Name: high-resolution three-dimensional imaging of the footpad vasculature in a murine hindlimb gangrene model
Uploaded: 2022-03-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag till Z-J L och OC V från National Institutes of Health [R01HL149452 och VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Vi tackar också Mikroskopi- och bildbehandlingsanläggningen i Miami Project to Cure Paralysis vid University of Miami School of Medicine för att ha gett tillgång till deras bildanalys- och bearbetningsprogram.

Alla djurförsök som beskrivs i protokollet godkändes av University of Miami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). FVB-möss, både manliga och kvinnliga, i åldern 8-12 veckor, användes för studien.
1. Beredning av L-NAME-lösning
<ol><li>Under sterila förhållanden i en laminär flödeshuv bereder du en L-NAME-stamlösning genom att lösa upp 1 g L-NAME-pulver (se Materialtabell) med 20 ml sterilt vatten för att göra en lösning på 5...

<ol>
	<li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update:+A+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139 (2020).</li><li>Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+of+critical+limb+ischemia:+A+review+of+recent+literature.">The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature.</a> Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).</li><li>Mills, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+society+for+vascular+surgery+lower+extremity+threatened+limb+classification+system:+Risk+stratification+based+on+Wound,+Ischemia,+and+foot+Infection+(WIfI).">The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI).</a> Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).</li><li>Conte, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+vascular+guidelines+on+the+management+of+chronic+limb-threatening+ischemia.">Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia.</a> Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).</li><li>Yeager, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+hemodialysis+access+to+finger+gangrene+in+patients+with+end-stage+renal+disease.">Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease.</a> Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).</li><li>Al Wahbi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoamputation+of+diabetic+toe+with+dry+gangrene:+A+myth+or+a+fact.">Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).</li><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+hindlimb+ischemia.">Murine model of hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).</li><li>Hellingman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+surgical+procedures+for+hind+limb+ischaemia+mouse+models+result+in+differences+in+collateral+formation.">Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).</li><li>Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+density,+remodeling,+and+VEGF-A+expression+differ+widely+between+mouse+strains.">Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains.</a> Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).</li><li>Dokun, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+trait+locus+(LSq-1)+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia.">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).</li><li>Parikh, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reliable+Mouse+Model+of+Hind+limb+Gangrene.">A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene.</a> Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).</li><li>Kopincov&#225;, J., P&#250;zserov&#225;, A., Bern&#225;tov&#225;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-NAME+in+the+cardiovascular+system+-+nitric+oxide+synthase+activator.">L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator.</a> Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).</li><li>Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+chronic+peripheral+ischemia:+new+perspectives.">Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives.</a> Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).</li><li>McDermott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pathology+in+peripheral+artery+disease+a+brief+review.">Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).</li><li>Usui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+role+of+oxidative+stress+in+vascular+angiotensin-converting+enzyme+activation+in+long-term+blockade+of+nitric+oxide+synthesis+in+rats.">Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats.</a> Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).</li><li>Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+surgical+procedures+for+inducing+hind+limb+ischemia+in+mice+and+the+impact+of+these+variations+on+neovascularization+assessment.">Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+DiO:+Versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).</li><li>Boden, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+imaging+of+the+mouse+hindlimb+vasculature+using+the+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).</li><li>Elfarnawany, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+processing+methods+for+quantitative+power+doppler+microvascular+angiography.">Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography.</a> Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).</li><li>Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+peripheral+arterial+disease+in+patients+with+chronic+venous+insufficiency.">Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency.</a> Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).</li><li>Ammermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+chronic+venous+insufficiency+in+patients+with+peripheral+artery+disease:+Insights+from+MR+angiography.">Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography.</a> European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanism+regulating+blood+flow+recovery+in+acute+versus+gradual+femoral+artery+occlusion+are+distinct+in+the+mouse.">Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse.</a> Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).</li><li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia.">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).</li><li>Greco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability,+reproducibility+and+standardisation+of+a+laser+doppler+imaging+technique+for+the+evaluation+of+normal+mouse+hindlimb+perfusion.">Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion.</a> Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).</li><li>Kochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+arterial+anatomy+of+the+murine+hindlimb:+Functional+role+in+the+design+and+understanding+of+ischemia+models.">Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models.</a> PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).</li><li>Hlushchuk, R., Haberth&#252;r, D., Djonov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+microangioCT:+Advances+in+microvascular+imaging.">Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging.</a> Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).</li><li>Robertson, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+labeled+tomato+lectin+for+imaging+vasculature+structures.">Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures.</a> Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).</li><li>Lee, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+interrogation+of+angiogenesis+in+the+ischemic+mouse+hind+limb:+Vulnerabilities+and+quality+assurance.">Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).</li></ol>

Medan mus hindlimb ischemi är den mest använda prekliniska modellen för att studera neovaskularisering i PAD och CLTI, finns det betydande variation i ischemi svårighetsgrad och återhämtning beroende på den specifika mus stam som används och platsen, antalet och metoden för kranskärlens störning. Kombinationen av femorala arteriell ligatur och IP administration av L-NAME kan tillförlitligt inducera hindlimb kallbrand i FVB möss11. Samma behandling resulterar i hindlimb ischemi utan v?...

Perifer arteriell sjukdom (PAD), kännetecknas av minskat blodflöde till extremiteterna på grund av åderförkalkning, påverkar 6,5 miljoner människor i USA och 200 miljoner människor över hela världen1. Patienter med PAD upplever nedsatt lemfunktion och livskvalitet, och de med CLTI, den allvarligaste formen av PAD, löper ökad risk för amputation och död med en 5-årig dödlighet som närmar sig 50%2. I klinisk praxis anses patienter med ankel-brachial index (ABI) <0,9 ha PAD, och de med ABI <0,4 i samband med antingen vilosmärta eller vävnadsförlust som att ha CLTI3. Symtomen varierar mellan patienter med liknande ADI beroende på daglig aktivitet, muskeltolerans mot ischemi, anatomiska variationer och skillnader i säkerhet utveckling4. Siffer- och lem kallbrand är den allvarligaste manifestationen av alla vaskulär ocklusiva sjukdomar som resulterar i CLTI. Det är en form av torr nekros som mumifierar mjukvävnaderna. Förutom aterosklerotisk PAD kan det också observeras hos patienter med diabetes, vaskuliter som Buergers sjukdom och Raynauds fenomen, eller calciphylaxi i inställningen av njursjukdom i slutstadiet5,6.
Flera prekliniska modeller har utvecklats för att studera patogenesen vid PAD/CLTI och testa effekten av potentiella behandlingar, varav den vanligaste är mus hindlimb ischemi. Inducera hindlimb ischemi hos möss uppnås vanligtvis genom obstruktion av blodflödet från iliaca eller femorala artärer, antingen genom sutur ligatur, elektrokoagulering eller andra sätt att begränsa det önskade kärlet7. Dessa tekniker drastiskt minska perfusion till hindlimb och stimulera neovascularization i lår och kalv muskler. Det finns dock väsentliga murin stamberoende skillnader i känslighet för skandinavisk förolämpning delvis på grund av anatomiska skillnader i säkerhet distribution8,9. Till exempel är C57BL/6 möss relativt resistenta mot hindlimb ischemi, visar minskad lem funktion men i allmänhet inga tecken på kallbrand i fotplattan. Å andra sidan har BALB/c möss en inneboende dålig kapacitet att återhämta sig från ischemi och vanligtvis utveckla auto-amputation av foten eller underbenet efter femorala arteriell ligatur ensam. Detta allvarliga svar på ischemi begränsar det terapeutiska fönstret och kan utesluta longitudinell bedömning av lem reperfusion och funktion. Intressant nog har genetiska skillnader i en enda kvantitativ egenskap locus ligger på murine kromosom 7 varit inblandade i dessa differentiella känsligheter av C57BL/6 och BALB/c möss till vävnad nekros och lem reperfusion10.
Jämfört med C57BL/6 och BALB/c stammar, FVB möss visar ett mellanliggande men inkonsekvent svar på femorala gatan ligatur ensam. Vissa djur utvecklar fotpad kallbrand i form av svarta ischemiska naglar eller mumifierade siffror, men andra utan några stora tecken på ischemi11. Samtidig administrering av Nω-Nitro-L-arginin metylesterhydroklorid (L-NAME), en nitrisk oxidsyntas (NOS) hämmare12, förhindrar kompensatoriska vasodilatory mekanismer och ytterligare ökar oxidativ stress i hindlimb vävnad. I kombination med femorala gatan ligatur eller koagulering, producerar detta tillvägagångssätt konsekvent footpad vävnad förlust i FVB möss som liknar de bestod förändringarna av CLTI men sällan utvecklas till lem auto-amputation11. Oxidativ stress är ett av kännetecknen för PAD/CLTI och förökas av endotel dysfunktion och minskad biotillgänglighet av kväveoxid (NO)13,14. NEJ är en pluripotent molekyl som vanligtvis utövar positiva effekter på arteriellt och kapillärblodflöde, trombocyt vidhäftning och aggregering samt leukocytrekrytering och aktivering13. Minskade nivåer av NOS har också visat sig aktivera angiotensin-omvandla enzymet, som inducerar oxidativ stress och påskyndar utvecklingen av ateroskleros15.
När en modell av hindlimb ischemi är etablerad, övervakning efterföljande lem reperfusion och den terapeutiska effekten av eventuella behandlingar behövs också. I den föreslagna murin kallbrandsmodellen kan graden av vävnadsförlust först kvantifieras med hjälp av Faber-poängen för att bedöma fotens bruttoutseende (0: normalt, 1-5: förlust av naglar där poängen representerar antalet drabbade naglar, 6-10: atrofi av siffror där poängen representerar antalet siffror som påverkas, 11-12: partiell och fullständig fotatrofi, respektive)9. Kvantitativa mätningar av hindlimb perfusion görs sedan vanligtvis med hjälp av LDPI, som förlitar sig på Doppler interaktioner mellan laserljus och röda blodkroppar för att indikera pixelnivåperfusion i en region av intresse (ROI)16. Även om denna teknik är kvantitativ, icke-invasiv och idealisk för upprepade mätningar, ger den inte granulära anatomiska detaljer i hindlimb vaskulatur16. Andra bildframställning modaliteter, såsom mikro-datortomografi (micro-CT), magnetisk resonans angiografi (MRA) och röntgen mikroangiography, visar sig antingen kostsamma, kräver sofistikerad instrumentering, eller på annat sätt tekniskt utmanande16. 2008 beskrev Li et al. en teknik för märkning av blodkärl i näthinnan med det lipofila karbacyyaninfärgämnet DiI17. DiI införlivar i endotelceller och, genom direkt diffusion, fläckar vaskulär membran strukturer såsom angiogena groddar och pseudopodala processer17,18. På grund av dess direkta leverans till endotelceller och färgämnets mycket fluorescerande natur ger denna procedur intensiv och långvarig märkning av blodkärl. 2012 anpassade Boden et al. tekniken för DiI perfusion till murine hindlimb ischemi modellen via hela mount imaging av skördade lår adductor muskler efter femorala arteriell ligatur19.
Den nuvarande metoden ger ett relativt billigt och tekniskt genomförbart sätt att bedöma neovaskularisering som svar på hindlimb ischemi och gen- eller cellbaserade terapier. I en ytterligare anpassning beskriver detta protokoll tillämpningen av DiI perfusion för att avbilda footpad vaskulatur i hög upplösning och 3D i en murin modell av hindlimb kallbrand.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Binder clips (small)</td>
			<td>Office supply store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (sustained-release)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly needle (25 G with Luer-Lok)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10148-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocautery device</td>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>5917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ) software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Used version 2.1.0. Free download, no license required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam biopsy pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-038-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin (neutral buffered, 10%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>001800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Used version 2.1.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (1 M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Used version 9.6.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-NAME (N&#969;-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler perfusion imager</td>
			<td>MoorLDI</td>
			<td>moorLDI2-HIR</td>
			<td>Used moorLDI V5 software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine swabstick (10%)</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS093901ZZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td></td>
			<td>Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (5-0 absorbable)</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>G275017B0P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>19406-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Analysis Plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution three-dimensional imaging of the footpad vasculature in a murine hindlimb gangrene model

Perifera kranskärlens sjukdom (PAD) är en betydande orsak till sjuklighet till följd av kronisk exponering för aterosklerotiska riskfaktorer. Patienter som lider av dess allvarligaste form, kronisk lemhotande ischemi (CLTI), står inför betydande försämringar i det dagliga livet, inklusive kronisk smärta, begränsat gångavstånd utan smärta och icke-healing sår. Prekliniska modeller har utvecklats i olika djur för att studera PAD, men mus hindlimb ischemi är fortfarande den mest använda. Det kan finnas betydande variation som svar på skandinaviska förolämpning i dessa modeller beroende på mus stam som används och platsen, antalet och medel för kranskärlens störningar. Detta protokoll beskriver en unik metod som kombinerar femorala gatan och ven elektrokoagulering med administrering av en kväveoxid syntas (NOS) hämmare att tillförlitligt inducera footpad kallbrand i Friend Virus B (FVB) möss som liknar vävnad förlust av CLTI. Medan traditionella metoder för att bedöma reperfusion såsom laser Doppler perfusion imaging (LDPI) rekommenderas fortfarande, intracardiac perfusion av lipophilic färgämnet 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanin perklorat (DiI) används för att märka vaskulaturen. Efterföljande helmonterade konfokala laserskanningsmikroskopi möjliggör högupplöst, tredimensionell (3D) rekonstruktion av fotplatta vaskulär nätverk som kompletterar traditionella sätt att bedöma reperfusion i hindlimb ischemia modeller.

Detta protokoll beskriver ett tillförlitligt sätt att inducera ischemi och vävnad förlust i murine fotplattan med hjälp av en kombination av femorala gatan och ven koagulering med L-NAME administration, en kväveoxid syntas inhibitor, i mottagliga FVB möss. Figur 1 beskriver anatomin hos murine hindlimb vaskulaturen och anger platserna för femorala gatan och ven koagulering (gul X), bara proximal till den laterala cirkumflex femorala gatan (LCFA) och proximal till saphenopopliteal kor...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model at JoVE.com

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Detta protokoll beskriver en unik, kliniskt relevant modell av perifera kranskärlens sjukdom som kombinerar femorala gatan och ven elektrokoagulering med administrering av en kväveoxid syntas inhibitor att inducera hindlimb kallbrand i FVB möss. Intracardiac DiI perfusion används sedan för högupplöst, tredimensionell avbildning av fotplattan vaskulatur.

Högupplöst tredimensionell avbildning av fotplattan Vasculature i en Murine Hindlimb Gangrene Modell

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Detta protokoll presenterar hur man skapar en mus fot pad kallbrand modell med administration av massa hämmare och femorala gatan koagulering. DiI perfusion möjliggör sedan högupplöst visualisering av fotplattan vaskulatur. Denna modell är kliniskt relevant och kan användas för preklinisk läkemedelstestning och för att studera lem ischemi.Högupplöst visualisering av vaskulatur erbjuder ett tekniskt lätt sätt att bedöma neovaskularisering. Denna fot pad kallbrand modell har viktiga tillämpningar i preklinisk forskning av perifera kranskärlens sjukdom och kritisk lem ischemi. DiI perfusion är ett användbart verktyg för att studera neovaskularisering i djurmodeller.Antoine Ribieras, från kirurgen, och Yulexi Ortiz, en forskningsassistent från mitt laboratorium, demonstrerar. Gör först DiI-arbetslösningen genom att tillsätta 200 mikroliter DiI-lagerlösning till 10 ml av den fungerande spädninglösningen omedelbart före användning. Skaka för hand för att blanda väl.Anslut två eller tre trevägskranar och en 25 gauge fjärilsnål i serie. Förbered 10 milliliter sprutor med fyra milliliter PBS, 10 milliliter DiI-lösning och 10 ml 10% neutralt buffrat formalin. Anslut sprutan med formalin till den proximala inflödesporten och injicera lösningen för att spola luft från linjen.Vrid sedan på kranen för att stänga porten. Upprepa samma procedur, anslut sprutorna med DiI och sedan PBS till mitten respektive distala inflödesportar. Post-eutanasia, placera djuret i en supin position på en absorberande pad och säkra axilla och nedre extremiteter med nålar.Använd sax, gör ett tvärgående snitt för att öppna bukhålan, exponera och dela sedan vänster och höger membran för att komma åt brösthålan. Skär bröstväggen på vardera sidan av bröstbenet från de nedre revbenen till det första eller andra revbenet. Använd en hemostat för att ta tag i bröstbenets nedre ände och reflektera den mot djurets huvud för att exponera brösthålan.Identifiera den vänstra ventrikeln, som verkar ljusare i färg än höger. Ta försiktigt tag i hjärtat med trubbiga tångar och sätt in fjärilsnålen i vänster kammare. Använd sax eller en 18 gauge nål för att punktera rätt förmak, så att blod- och perfusionslösningar kan återvända till hjärtat för att dräneras.Öppna sprutans port med PBS och injicera manuellt två till fyra milliliter med en hastighet av en till två milliliter per minut i en till två minuter för att spola blod från kärlsystemet. Säkerställ framgångsrik perfusion genom att observera blödning från rätt förmak. Stäng sedan injektionen porten på PBS-sprutan.Öppna sprutans port med DiI och injicera fem till tio milliliter med en hastighet av en till två milliliter per minut i fem minuter. Efter injektionen stänger du diI-sprutans port och väntar i två minuter för att tillåta inkorporering av färgämnet innan fixativet injiceras. Öppna sprutans port med formalin och injicera fem till tio milliliter med en hastighet av en till två milliliter per minut i fem minuter.Efter injektionen, ta bort nålen från vänster kammare. Använd tung sax, flytta skenbenet vid fotleden, helt separera vänster och höger fot från underbenen. Placera skördade fötter i en 12 brunnsplatta med en till två milliliter 10% formalinlösning.Linda plattan med folie och förvara på fyra grader Celsius över natten. Nästa dag, byt ut den fixativa lösningen i en 12 brunnsplatta med en till två milliliter PBS per brunn. Gör ett längsgående snitt med en skalpell på plantaren och den dorsala delen av foten.Använd sedan tandade tångar och en liten hemostat, ta försiktigt bort all hud från foten och siffrorna, vilket inte skadar de underliggande mjuka vävnaderna. För att montera vävnader, placera individuellt fötter mellan två glasmikroskopbilder med en skumbiopsiplatta vikt över sig själv i varje ände. Använd två små bindemedelsklämmor för att komprimera glasglasen i varje ände.Alternativt kan du återföra fotplattan till en 12-brunnsplatta med en till två milliliter PBS. Efter att ha täckt den med folie, lagra den vid fyra grader Celsius för att bibehålla fluorescens i upp till en månad. Slå på bildsystemet, starta anskaffningsprogrammet och använd ett mål med låg förstoring eller låg numerisk bländare för att ta bilder.Klicka på ja till dialogrutan aktivera scenen. Aktivera 561 nanometerslasern på konfigurationsfliken. Aktivera en synlig strålbana på huvudskärmen genom att klicka på den synliga knappen.Ställ in en detektor på intervallet 570 till 600 nanometer genom att klicka på motsvarande aktiva kryssruta. Välj ikonen för panelsökning på fliken Förvärv och ange önskad upplösning. Placera torrmonterat vävnadsprov komprimerat mellan glasglasbilder på mikroskopstadiet och sätt vävnaden i fokus.Navigera till ett hörn av exemplet. Klicka på knappen Markera placering under panelsökningsmenyn. Navigera till det motsatta hörnet och klicka på knappen markera position igen och ange skanningsgränserna.Om du vill ställa in djupet på Z-stacken klickar du på live-knappen. Navigera till mitten av exemplet och använd z-axelratten för att bläddra igenom till botten av exemplet. Klicka på startknappen på fliken Förvärv under Z-stack-menyn.Bläddra igenom till toppen av exemplet och klicka på slutknappen. Klicka på z-stegstorleken och ställ in önskad värde. Klicka sedan på start för att börja bildförvärv.Figuren visar variationen i vävnadsförlust som kan förväntas från denna modell en vecka efter operationen med FABER-poäng registrerade i det nedre högra hörnet av varje bild. Återuppbyggnad mikroskopi bilder avslöjar normala vaskulär anatomi i icke-ligated kontroll fot pad jämfört med allvarligt minskat perfusion till foten pad av ligated hindlimb fem dagar efter kirurgi. 20 dagar efter kirurgi, perfusion till foten pad har förbättrats avsevärt, men inte i den utsträckning som icke-ligated kontroll.Videon visar att ytåtergivning sedan skapades med hjälp av animeringsfunktionen. Spola alla luftbubblor från perfusionsenheten. Om lungorna expanderar och blir rosa under perfusion har nålen trängt in i höger kammare och bör dras tillbaka något.Lem vävnader kan användas för immunostaining för att bedöma muskelnekros, vävnad regenerering, fartygstäthet, och rekrytering av stamceller, och andra vävnad reparation celler. Tekniken för DiI perfusion i denna murin kallbrand modell har använts i studier av gen och cell terapier. Forskningen syftar till att förbättra perfusion i lemmar av patienter med kritisk lem ischemi.

Research

JoVE Journal

Medicine

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Mänskliga neuroendokrin tumör cellinjer som en tredimensionell modell för studiet av mänskliga neuroendokrin tumör Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

En mus modell av stentimplantation i halspulsådern för studier av restenos

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

Tredimensionell avbildning av Nociceptiva Intraepidermal nervfibrer i human hud Biopsier

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Osmotisk Drug Delivery ischemisk bakben och perfusion av kärlsystemet med Microfil för Micro-Datortomografi Imaging

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

Kvantifiering av bröstcancer Cell Invasivt hjälp av en tredimensionell (3D) Modell

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Tredimensionell Samodling modell för Tumör-stromal Interaktion

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Tredimensionell (3D) Tumör Spheroid invasionsanalys

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kvantitativ visualisering av leukocytinfiltrat i en murinmodell av Fulminant-myokardit genom ljusarkmikroskopi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Elektrofysiologiska bedömning av murina Atria med högupplöst optisk kartläggning

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Bedömning av terapeutisk angiogenes i en murin modell av Hindlimb ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...