प्रोटोकॉल अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव रक्त आउटग्रोथ एंडोथेलियल कोशिकाएं प्रदान करता है जिनका उपयोग विभिन्न ऊतक इंजीनियरिंग, सेल थेरेपी और रोग मॉडलिंग जांच के लिए किया जा सकता है। यह तकनीक लगातार एक ही रक्त ड्रॉ से कई कोशिकाओं का उत्पादन करती है। इस तकनीक के सफल होने के लिए, कोशिकाओं को जल्द से जल्द संस्कृति माध्यम और इनक्यूबेटर वातावरण में जल्दी से प्राप्त करना महत्वपूर्ण है।
सबसे पहले, बाँझ खारा में हेपरिन घोल को 100 यूनिट प्रति मिलीलीटर तक पतला करें। दो 50-मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों और दो 60-मिलीलीटर सिरिंज में से प्रत्येक में तीन से चार मिलीलीटर हेपरिन समाधान जोड़ें। फिर, एक विस्तार ट्यूब में 1,000 यूनिट प्रति मिलीलीटर हेपरिन घोल खींचें।
हेपरिन से भरे विस्तार ट्यूब के एक छोर पर 19-गेज सुई और एक्सटेंशन ट्यूब के दूसरे छोर पर हेपरिन युक्त 60 मिलीलीटर सिरिंज को कनेक्ट करें। इसके बाद, बीटाडीन स्क्रब समाधान के साथ एक एनेस्थेटाइज्ड सुअर के ऊरु कमर क्षेत्र को साफ करें। ऊरु शिरा या धमनी को 19-गेज सुई के साथ पंचर करें और प्रति सेकंड एक से दो मिलीलीटर पर, धीरे-धीरे सिरिंज में 50 मिलीलीटर रक्त खींचें।
सुई को जगह पर छोड़कर, तुरंत एक्सटेंशन ट्यूब को गांठ दें और 60 मिलीलीटर सिरिंज को डिस्कनेक्ट कर दें। धीरे-धीरे रक्त को हेपरिन युक्त 50-मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। शंक्वाकार ट्यूब को कसकर लपेटें, धीरे से मिश्रण करने के लिए ट्यूब को कुछ बार उलटा करें, और इसे बर्फ पर रखें।
शेष हेपरिन युक्त 60-मिलीलीटर सिरिंज को विस्तार ट्यूब से कनेक्ट करें। एक्सटेंशन ट्यूब को अनकिंक करें, और धीरे-धीरे सिरिंज में अतिरिक्त 50 मिलीलीटर रक्त खींचें। धमनी या नस से तुरंत सुई निकालें और धीरे-धीरे विस्तार ट्यूब से शेष रक्त को सिरिंज में खींचें।
एक्सटेंशन ट्यूब से 60-मिलीलीटर सिरिंज को डिस्कनेक्ट करें और धीरे-धीरे रक्त को शेष हेपरिन युक्त 50-मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। 50-मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को कसकर लपेटें, धीरे से मिश्रण करने के लिए कुछ बार उलटा करें, और बर्फ पर रखें। सुअर के ऊरु कमर क्षेत्र में दबाव हेमोस्टेसिस लागू करें।
चार 50-मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में पीबीएस के साथ रक्त को एक-से-एक पतला करें। आठ 50-मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में 25 मिलीलीटर कमरे का तापमान, उपयोग के लिए तैयार घनत्व ढाल समाधान जोड़ें। धीरे-धीरे प्रत्येक 50-मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के अंदर 25 मिलीलीटर रक्त लवण घोल को पिपेट की नोक पर एक तेज कोण पर ट्यूब को पकड़कर घनत्व ढाल समाधान होता है।
ट्यूबों को 560 ग्राम और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। एक पतली पिपेट के साथ प्रत्येक ट्यूब से बफी कोट को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करें, जो घनत्व ढाल समाधान के ऊपर और स्पष्ट प्लाज्मा के नीचे मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की बादल परत है और इसे दो नए 50-मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में समान रूप से वितरित करें। ट्यूबों वाले घनत्व ढाल समाधान को छोड़ दें।
फाइब्रोनेक्टिन के साथ छह-अच्छी प्लेट को कोट करने के लिए, बाँझ पानी में एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर तक पतला करके मानव प्लाज्मा फाइब्रोनेक्टिन का स्टॉक समाधान बनाएं। तीन मिलीलीटर पीबीएस में फाइब्रोनेक्टिन स्टॉक समाधान के 600 माइक्रोलीटर को पतला करके फाइब्रोनेक्टिन के 3.6 मिलीलीटर कार्यशील समाधान बनाएं। फाइब्रोनेक्टिन के 600 माइक्रोलीटर काम करने वाले घोल को छह-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें और समान रूप से लेपित होने तक धीरे से चट्टान दें।
और धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं से घोल को बाहर निकालें। फाइब्रोनेक्टिन को कोट करने की प्रतीक्षा करते समय मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को धोने के लिए, ट्यूबों को 45 मिलीलीटर पीबीएस के साथ ऊपर उठाएं, 560 एक्स जी पर पांच मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और कम ब्रेक के साथ चार डिग्री सेल्सियस रखें। दोनों ट्यूबों से सतह पर तैरनेवाला को अलग करें।
पीबीएस के 25 मिलीलीटर में प्रत्येक सेल गोली को पुन: निलंबित करें। पीबीएस के पांच मिलीलीटर में प्रत्येक सेल गोली को पुन: निलंबित करें और प्रत्येक ट्यूब में 0.8% अमोनियम क्लोराइड समाधान के 15 मिलीलीटर जोड़ें। पीबीएस जोड़कर कोशिकाओं को पहले की तरह धोएं।
दोनों ट्यूबों से सतह पर तैरनेवाला को अलग करें। पीबीएस के 25 मिलीलीटर में प्रत्येक सेल गोली को पुन: निलंबित करें। ईजीएम -2 कल्चर माध्यम के छह मिलीलीटर में प्रत्येक सेल गोली को 10% एफबीएस और 1 एक्स एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान के साथ पूरक करें।
धीरे से सेल निलंबन के दो मिलीलीटर को फाइब्रोनेक्टिन लेपित छह-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें और समान रूप से लेपित होने तक धीरे से चट्टान बनाएं। कोशिकाओं को बोने के 24 घंटे बाद, धीरे से प्रत्येक कुएं में एक मिलीलीटर ताजा कल्चर माध्यम जोड़ें। अगले दिन, धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं से 1.5 मिलीलीटर कल्चर माध्यम को हटा दें, और इसे 1.5 मिलीलीटर ताजा संस्कृति माध्यम के साथ बदल दें।
अगले पांच दिनों के लिए, धीरे-धीरे प्रति अच्छी तरह से दो मिलीलीटर ताजा संस्कृति माध्यम के साथ संस्कृति माध्यम को बदलें। नियमित रूप से कम शक्ति 4 एक्स उद्देश्य प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत सेल संस्कृतियों की कल्पना करें। सुसंस्कृत कोशिकाओं की आकृति विज्ञान संस्कृति की शुरुआत से लेकर बीओईसी कॉलोनियों तक देखा गया था।
अनुयायी कोशिकाओं की एक छोटी आबादी ने संस्कृति व्यंजनों से जुड़ना और बढ़ना शुरू कर दिया, जबकि गैर-अनुयायी कोशिकाओं को संस्कृति माध्यम परिवर्तनों के साथ हटा दिया गया। कॉलोनियां पहली बार छठे दिन एंडोथेलियल जैसी कोशिकाओं के संग्रह के रूप में दिखाई दीं जो एक केंद्रीय बिंदु से रेडियल रूप से बाहर की ओर बढ़ रही थीं। जैसे-जैसे संस्कृति आगे बढ़ी, सेल कॉलोनियां अधिक घनी हो गईं और परिपक्व एंडोथेलियल कोशिकाओं के समान एक कोबलस्टोन आकृति विज्ञान प्रदर्शित किया।
सीरम-मुक्त माध्यम और पूर्ण विकास माध्यम में ट्यूब गठन की छवि बनाने के लिए दो-आयामी चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया था। दोनों मीडिया स्थितियों में कोशिकाओं को रूपात्मक भेदभाव से गुजरना पड़ा और तेजी से केशिका ट्यूब जैसी संरचनाओं के व्यापक नेटवर्क में व्यवस्थित किया गया। बीओईसी को आगे परिपक्व एंडोथेलियल सेल मार्कर सीडी 31 या प्लेटलेट एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु एक की अभिव्यक्ति की विशेषता थी।
बीओईसी ने सीडी 31 की समान अभिव्यक्ति दिखाई। इसके अलावा, सकारात्मक नियंत्रण की तुलना में सीडी 14 एएफ 700 एंटीबॉडी के साथ बीओईसी के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण ने ईपीसी की अनुपस्थिति की पुष्टि की, क्योंकि पीबीसी के सकारात्मक नियंत्रण समूह की तुलना में मोनोसाइट मार्कर सीडी 14 के लिए सेल सना हुआ नकारात्मक था।
रक्त संग्रह के दौरान, जितना संभव हो उतना आसन्न परतों को इकट्ठा करते हुए बफी कोट परत को जितना संभव हो उतना इकट्ठा करना आवश्यक है। इस तकनीक ने शोधकर्ताओं को ऑटोलॉगस रक्त आउटग्रोथ एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ सुअर मॉडल का उपयोग करके प्रत्यारोपण योग्य कार्डियोवैस्कुलर उपकरणों के लिए नई रणनीतियों का अध्ययन करने में सक्षम बनाया है।