Isolement rapide des nématodes sauvages par Baermann Funnel

Les nématodes Caenorhabditis sont de vrais animaux, qui vivent dans la nature. La collecte de nématodes sauvages nous permet d’étudier les gènes et les génomes dans leur contexte naturel révélant des fonctions qui peuvent être obscurcies par les conditions artificielles du laboratoire. Cette technique extrait des vers de substrats organiques riches en bactéries sur le terrain et crée des cultures propres sur des boîtes de Pétri, en capturant un instantané de chaque population, au moment où elle a été collectée.

Ces populations sont bien adaptées aux questions d’écologie, de génétique des populations ou de métagénétique. Les cultures de souches sauvages sont également précieuses pour les études génétiques quantitatives. Cette technique est simple et facile à exécuter, même pour un novice en recherche sur le terrain.

Cependant, un voyage de collecte réussi nécessite une préparation réfléchie du matériel avant de voyager. Identifiez un substrat riche en bactéries dans le champ, comme des fruits en décomposition, des fleurs, des champignons, des tiges de plantes herbacées, du sol ou de la litière de feuilles. Placez un petit volume du substrat dans un sac en plastique étiqueté.

Si le matériel pourri est rare dans le domaine d’intérêt, placez des fruits comme appât. Laissez-le se balancer, puis récupérez-le, ainsi que tous les vers qui l’ont colonisé. Enregistrez l’ID de l’échantillon, la latitude, la longitude, la date et la description du substrat.

Enregistrez toute autre mesure environnementale locale pertinente pour l’expérience, telle que la température ambiante et du substrat, l’état du substrat, le moment de la collecte et la présence de macro-invertébrés associés au substrat. Utilisez des ciseaux pour couper un segment de trois centimètres de tube en caoutchouc de chaque entonnoir. Placez le tube sur l’extrémité d’un entonnoir en plastique.

Faites glisser une pince de tube sur le tube en caoutchouc et fermez-la. Pour faire un porte-entonnoir, coupez des trous circulaires, au centre d’un plateau de mouche en carton déplié. Inversez le carton, pliez les côtés une fois et collez-les ensemble.

Cela créera des jambes qui élèveront les trous au-dessus du banc. Assurez-vous que les colliers de serrage sont en position fermée et placez des entonnoirs dans les trous. Versez de l’eau stérile dans chaque entonnoir, en le remplissant à environ trois centimètres sous le bord.

Appuyez sur l’entonnoir pour libérer les bulles d’air piégées dans le tube. Pliez une lingette non pelucheuse en deux, pour faire un carré, et placez-la sur l’entonnoir. Ensuite, appuyez sur la lingette vers le bas, pour l’immerger dans l’eau.

Briser manuellement tous les gros morceaux solides du substrat naturel. Placez doucement une partie de l’échantillon sur la lingette dans l’entonnoir. Assurez-vous de ne pas percer la lingette ou de laisser un échantillon dépasser au-dessus de la jante.

Pliez soigneusement les coins de la lingette, sur l’échantillon, pour empêcher l’eau de s’évacuer, sur le bord de l’entonnoir. Étiquetez l’entonnoir avec l’ID d’échantillon, correspondant aux notes de collecte de champs. Choisissez tous les insectes actifs, ou d’autres animaux, qui peuvent voyager et contaminer les échantillons.

Ajoutez plus d’eau à chaque entonnoir, pour immerger l’échantillon entier. Pendant l’incubation à température ambiante pendant la nuit, les nématodes actifs se tortillent à travers les tissus et coulent au fond de l’entonnoir. Écrivez l’ID d’échantillon d’un entonnoir, au bas d’une plaque de ver NGM de six centimètres, assis avec une tache de bactérie OP50 E. coli.

Retirez le couvercle de la plaque, retirez l’entonnoir contenant l’échantillon du support de l’entonnoir et tenez-le droit, au-dessus de la plaque à vis sans fin ouverte, d’une seule main. Relâchez la pression sur la pince du tube avec l’autre main, et laissez une ou deux gouttes d’eau tomber du tube, sur la plaque de ver à côté de la pelouse bactérienne. Dès que l’eau tombe de l’entonnoir, serrez-le rapidement à nouveau pour éviter d’inonder la plaque NGM.

Pour nettoyer, jetez le contenu des entonnoirs et lavez-les à l’eau chaude pour une réutilisation ultérieure. Observez les nématodes isolés au stéréomicroscope. En plus des nématodes, il y aura parfois de petits annélides en kit Oligo, des tardigrades, des rotifères et de petits crustacés.

Pour établir des lignées ISO hermaphrodites, ou ISO femelles, transférez chaque hermaphrodite L4 ou femelle adulte accouplée, sur une plaque NGM séparée de 3,5 centimètres, assise avec OP50. Stérilisez le pic à vers, avant et après chaque transfert. Enfin, enveloppez soigneusement les assiettes pour le voyage, avec un film de paraffine.

Sur l’île de Barro Colorado au Panama, en 2018, 131 substrats ont été traités par cette méthode. 99% d’entre eux ont donné des nématodes. 34% ont donné des nématodes Caenorhabditis.

Dans la zone d’exclusion de Tchernobyl en Ukraine, en 2019, 170 substrats ont été traités par cette méthode. 56% d’entre eux ont donné des nématodes, dont aucun n’était Caenorhabditis. Cette méthode fonctionne parce que les nématodes nagent à travers la lingette.

mais le substrat et les autres animaux restent au sommet. De nombreux aspects d’un protocole peuvent être modifiés, pour utiliser toutes les ressources disponibles sur le terrain. Les échantillons prélevés à l’aide de cette méthode permettent aux chercheurs d’aborder un large éventail de questions de biologie des populations dans des cultures établies pour des études de laboratoire ultérieures.