Name: generation of hook ischemia-reperfusion model using a three-day developing chick embryo
Uploaded: 2022-02-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Hook Ischemia-Reperfusion Model using a Three-Day Developing Chick Embryo at JoVE.com

Vogliamo esprimere la nostra gratitudine a Hari Shankar per i suoi input critici durante la videografia e il montaggio, Baqer Hussain per la voce fuori campo, Asghar Rizvi per il montaggio video, Mohammad Haider per le riprese video, Mohammad Danish Siddiqui per l'assistenza durante gli esperimenti.

L'Institutional Animal Ethical Committee presso il Lucknow Medical College and Hospital di Era ha emesso una rinuncia scritta affermando che non era richiesta alcuna approvazione formale per condurre questi esperimenti in conformità con il Comitato per lo scopo del controllo e della supervisione degli esperimenti sugli animali (CPCSEA). Tuttavia, sono state seguite procedure operative standard per ridurre al minimo qualsiasi potenziale di sofferenza embrionale.
1. Preparazione del tampo...

<ol>
	<li>Fauzia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+Embryo:+A+Preclinical+Model+for+Understanding+Ischemia-Reperfusion+Mechanism.">Chick Embryo: A Preclinical Model for Understanding Ischemia-Reperfusion Mechanism.</a> Frontiers in Pharmacology. 21 (9), 1034 (2018).</li><li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation.">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li><li>Raza, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+naringenin+is+mediated+through+suppression+of+NF-&#954;B+signaling+pathway+in+experimental+stroke.">Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-&#954;B signaling pathway in experimental stroke.</a> Neuroscience. 29 (230), 157-171 (2013).</li><li>Raza, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hesperidin+ameliorates+functional+and+histological+outcome+and+reduces+neuroinflammation+in+experimental+stroke.">Hesperidin ameliorates functional and histological outcome and reduces neuroinflammation in experimental stroke.</a> Brain Research. 28 (1420), 93-105 (2011).</li><li>Raza, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silymarin+protects+neurons+from+oxidative+stress+associated+damages+in+focal+cerebral+ischemia:+a+behavioral,+biochemical+and+immunohistological+study+in+Wistar+rats.">Silymarin protects neurons from oxidative stress associated damages in focal cerebral ischemia: a behavioral, biochemical and immunohistological study in Wistar rats.</a> Journal of the Neurological Sciences. 15 (1-2), 45-54 (2011).</li><li>Fan, L., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AG490+protects+cerebral+ischemia/reperfusion+injury+via+inhibiting+the+JAK2/3+signaling+pathway.">AG490 protects cerebral ischemia/reperfusion injury via inhibiting the JAK2/3 signaling pathway.</a> Brain and Behavior. 11 (1), 01911 (2021).</li><li>Wu, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Mechanistic+Concepts+in+Ischemia+and+Reperfusion+Injury.">Current Mechanistic Concepts in Ischemia and Reperfusion Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 46 (4), 1650-1667 (2018).</li><li>Collard, C. D., Gelman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology,+clinical+manifestations,+and+prevention+of+ischemia-reperfusion+injury.">Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury.</a> Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).</li><li>Allen, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+as+in+vitro+models+for+drug+screening+and+toxicity+studies.">Cell lines as in vitro models for drug screening and toxicity studies.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 31 (8), 757-768 (2005).</li><li>Schmeer, C., Gamez, A., Tausch, S., Witte, O. W., Isenmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+modulate+heat+shock+protein+expression+and+enhance+retinal+ganglion+cell+survival+after+transient+retinal+ischemia/reperfusion+in+vivo.">Statins modulate heat shock protein expression and enhance retinal ganglion cell survival after transient retinal ischemia/reperfusion in vivo.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (11), 4971-4981 (2008).</li><li>Huang, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+of+acupuncture+for+improving+learning+and+memory+ability+in+animals.">A systematic review and meta-analysis of acupuncture for improving learning and memory ability in animals.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 16 (1), 297 (2016).</li><li>Sommer, C. 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(62), e3923 (2012).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathelicidin+aggravates+myocardial+ischemia/reperfusion+injury+via+activating+TLR4+signaling+and+P2X(7)R/NLRP3+inflammasome.">Cathelicidin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating TLR4 signaling and P2X(7)R/NLRP3 inflammasome.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 139, 75 (2020).</li><li>Franke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NLRP3+inflammasome+drives+inflammation+in+ischemia/reperfusion+injury+after+transient+middle+cerebral+artery+occlusion+in+mice.">The NLRP3 inflammasome drives inflammation in ischemia/reperfusion injury after transient middle cerebral artery occlusion in mice.</a> Brain Behaviour and Immunity. 92, 223 (2021).</li><li>Lawrence, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+factor+NF-kappaB+pathway+in+inflammation.">The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), 001651 (2009).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pterostilbene+attenuates+astrocytic+inflammation+and+neuronal+oxidative+injury+after+ischemia-reperfusion+by+inhibiting+NF-kappaB+phosphorylation.">Pterostilbene attenuates astrocytic inflammation and neuronal oxidative injury after ischemia-reperfusion by inhibiting NF-kappaB phosphorylation.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2408 (2009).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sivelestat-loaded+nanostructured+lipid+carriers+modulate+oxidative+and+inflammatory+stress+in+human+dental+pulp+and+mesenchymal+stem+cells+subjected+to+oxygen-glucose+deprivation.">Sivelestat-loaded nanostructured lipid carriers modulate oxidative and inflammatory stress in human dental pulp and mesenchymal stem cells subjected to oxygen-glucose deprivation.</a> Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 120, 111700 (2021).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+enhances+autophagy+in+stem+cells+through+Erk1/2+signaling+pathway+-+implications+for+neurotransplantations.">Oxidative stress enhances autophagy in stem cells through Erk1/2 signaling pathway - implications for neurotransplantations.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li><li>Ahmad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin-coated+polycaprolactone+nanoparticle-mediated+naringenin+delivery+rescue+human+mesenchymal+stem+cells+from+oxygen+glucose+deprivation-induced+inflammatory+stress.">Gelatin-coated polycaprolactone nanoparticle-mediated naringenin delivery rescue human mesenchymal stem cells from oxygen glucose deprivation-induced inflammatory stress.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (2), 683-695 (2019).</li><li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroprotective+effects+of+carvacrol+on+ischemia/reperfusion-induced+hippocampal+neuronal+impairment+by+ferroptosis+mitigation.">The neuroprotective effects of carvacrol on ischemia/reperfusion-induced hippocampal neuronal impairment by ferroptosis mitigation.</a> Life Science. 235, 116795 (2019).</li><li>Jin, Z., Guo, P., Li, X., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+irisin+against+cerebral+ischemia/+reperfusion+injury+via+Notch+signaling+pathway.">Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/ reperfusion injury via Notch signaling pathway.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 120, 109452 (2019).</li><li>Wainrach, S., Sotelo, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+study+of+the+developing+chick+embryo+heart.">Electron microscope study of the developing chick embryo heart.</a> Zeitschrift fur Zellforschung und mikroskopische Anatomie. 55, 622-634 (1961).</li><li>Joshi, V. C., Wilson, A. C., Wakil, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+the+terminal+enzyme+of+the+stearoyl+coenzyme+A+desaturase+system+using+microsomes.">Assay for the terminal enzyme of the stearoyl coenzyme A desaturase system using microsomes.</a> Journal of Lipid Research. 18 (1), 32-36 (1977).</li><li>Kain, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+embryo+as+an+expanding+experimental+model+for+cancer+and+cardiovascular+research.">The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research.</a> Development Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).</li><li>Mann, R. A., Moore, K. L., Persaud, T. V. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+ischaemic+conditioning+reduces+infarct+size+in+animal+in+vivo+models+of+ischaemia-reperfusion+injury:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Remote ischaemic conditioning reduces infarct size in animal in vivo models of ischaemia-reperfusion injury: a systematic review and meta-analysis.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 288-297 (2017).</li><li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+ischemia/reperfusion+injury.">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li><li>Hogers, B., DeRuiter, M. C., Baasten, A. M., Gittenberger-de Groot , A. C., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracardiac+blood+flow+patterns+related+to+the+yolk+sac+circulation+of+the+chick+embryo.">Intracardiac blood flow patterns related to the yolk sac circulation of the chick embryo.</a> Circ Res. 76 (5), 871-877 (1995).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=angiogenesis-inflammation+cross+talk+in+diabetic+retinopathy:+novel+insights+from+the+chick+embryo+chorioallantoic+membrane/human+vitreous+platform.">angiogenesis-inflammation cross talk in diabetic retinopathy: novel insights from the chick embryo chorioallantoic membrane/human vitreous platform.</a> Frontiers in Immunology. 11, 581288 (2020).</li></ol>

L'obiettivo della ricerca ischemia-riperfusione è quello di creare strategie terapeutiche che prevengano la morte cellulare e promuovano il recupero29,30. Per superare gli attuali vincoli nella ricerca I/R, abbiamo progettato un modello di embrione di pulcino Hook I/R per produrre un modello I/R affidabile e riproducibile. Per quanto ne sappiamo, il nostro è il primo modello I / R mai creato in un embrione di pulcino di 3 giorni per esperimenti I / R di routine...

La lesione tissutale da ischemia-riperfusione è stata collegata a una serie di patologie, tra cui infarti, ictus ischemico, traumi e malattie vascolari periferiche1,2,3,4,5. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di una comprensione completa della progressione della malattia e alla mancanza di un modello di ricerca efficace. La lesione ischemica si verifica quando l'afflusso di sangue a un'area specifica del tessuto viene interrotto. Di conseguenza, il tessuto ischemico alla fine necrotizza, anche se il tasso varia a seconda del tessuto. Quindi, ripristinare l'afflusso di sangue può aiutare a mitigare il danno. Tuttavia, è stato osservato, in alcuni casi, che la riperfusione provoca più danni ai tessuti rispetto all'ischemia da sola6,7,8. Pertanto, è necessaria la comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari dell'ischemia-riperfusione per sviluppare un intervento terapeutico efficace. Attualmente, non è noto alcun trattamento efficace per le lesioni I / R. Questa disparità ha spinto la creazione di nuovi modelli sperimentali, che vanno dai modelli in vitro a quelli in vivo, per affrontare il problema esistente9,10,11,12,13.
Gli embrioni di pulcino (Gallus gallus domesticus) sono ampiamente utilizzati nella ricerca a causa della loro facilità di accesso, accettabilità etica, dimensioni relativamente grandi (rispetto ad altri embrioni), basso costo e rapida crescita14. Abbiamo usato un embrione di pulcino a 72 ore di sviluppo per creare un in ovo I / R occludendo e rilasciando l'arteria vitellina destra con l'assistenza di un ago spinale. L'abbiamo chiamato hook-I/R ischemia-riperfusione modello (Figura 1). Il modello utilizzato in questo studio è in grado di simulare accuratamente tutti i processi a valle, comprese le vie ossidative e infiammatorie, che sono frequentemente associate al danno I/R15,16,17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(-80&#176;C) freezer</td>
			<td>Haier, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL Centrifuge tube</td>
			<td>TARSONS, India</td>
			<td>500010X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm Petri dish (sterile)</td>
			<td>Tarsons, India</td>
			<td>460050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G Needle (18G&#215;1.5 (1.25&#215;38mm)</td>
			<td>Ramsons, India</td>
			<td>13990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL Syringe</td>
			<td>DISPO VAN</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G Needle (26G&#215;1/2 (10.45x13mm)</td>
			<td>DISPO VAN, india</td>
			<td>30722D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C egg incubator with adjustable percentage humidity</td>
			<td>Gentek, India</td>
			<td>GL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C laboratory incubator</td>
			<td>SCIENCE TECH, India</td>
			<td>CB 101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Methyladenine (3-MA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>M9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mL Pasture Pipette</td>
			<td>TARSONS, India</td>
			<td>940050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Beaker</td>
			<td>TARSONS, India</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Syringe</td>
			<td>DISPO VAN, India</td>
			<td>IP53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Merck Millipore, United States</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape/Cello tape</td>
			<td>Sunrise, India</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambra1 primers</td>
			<td>Applied Biosystems, Foster city, USA</td>
			<td>Hs00387943_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG</td>
			<td>Cell Signaling Technology, USA</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno Research Laboratories, USA</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atg7</td>
			<td>R&#38;D Systems, USA</td>
			<td>MAB6608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atg7 primers</td>
			<td>Applied Biosystems, Foster city, USA</td>
			<td>Hs00893766_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave Bag</td>
			<td>Tarsons, India</td>
			<td>550022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave Machine</td>
			<td>Local made, Lucknow, India</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beclin-1</td>
			<td>Proteintech, USA</td>
			<td>66665-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta Actin</td>
			<td>ImmunoTag, USA</td>
			<td>ITT07018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Himedia, Mumbai, India</td>
			<td>TC194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Himedia, Mumbai, India</td>
			<td>GRM534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>ImmunoTag, USA</td>
			<td>ITT5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark, India</td>
			<td>370080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase3</td>
			<td>ImmunoTag, USA</td>
			<td>ITT07022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate</td>
			<td>Himedia, Mumbai, India</td>
			<td>GRM39611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doppler blood flowmeter</td>
			<td>Moors instrument, United Kingdom</td>
			<td>moorVMS-LDF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg rack</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg rack</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>ImmunoTag, USA</td>
			<td>M1000110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH primers</td>
			<td>Applied Biosystems, Foster city, USA</td>
			<td>Hs02758991_g1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Himedia, Mumbai, India</td>
			<td>MB013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kidney tray</td>
			<td>HOSPITO</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3A/B</td>
			<td>Cell Signaling Technology, USA</td>
			<td>4108S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Rankem laboratories, Mumbai, India</td>
			<td>M0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige, Japan</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>A7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naringenin</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>67604-48-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NF-k&#946;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>51-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLRP3</td>
			<td>ImmunoTag, USA</td>
			<td>ITT07438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose plier</td>
			<td>Local made, Lucknow, India</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular forceps</td>
			<td>Stoelting, Germany</td>
			<td>52106-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular iris</td>
			<td>Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India</td>
			<td>Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OHP marker pen</td>
			<td>Camlin, India</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORP-150</td>
			<td>ImmunoTag, USA</td>
			<td>ITT08329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed sharp edge scissor</td>
			<td>Stoelting, Germany</td>
			<td>52132-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Himedia, Mumbai, India</td>
			<td>MB043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Himedia, Mumbai, India</td>
			<td>MB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor</td>
			<td>Abcam, United States</td>
			<td>Ab65621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOD-1</td>
			<td>ImmunoTag, USA</td>
			<td>ITT4364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Mumbai, India</td>
			<td>27605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Himedia, Mumbai, India</td>
			<td>GRM886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm)</td>
			<td>Ramson, India</td>
			<td>GS-2029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Zoom surgical microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>SZ2-STU3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe discarder</td>
			<td>BIOHAZARD</td>
			<td>882210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed forceps</td>
			<td>Stoelting, Germany</td>
			<td>52102-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>G Biosciences, United States</td>
			<td>RC1217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloric Acid</td>
			<td>Himedia, Mumbai, India</td>
			<td>MB030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>G Biosciences, United States</td>
			<td>RC1227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Leghorn Chicken 0-day eggs</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC, USA</td>
			<td>FK009</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of hook ischemia-reperfusion model using a three-day developing chick embryo

I disturbi da ischemia e riperfusione (I / R), come infarto miocardico, ictus e malattia vascolare periferica, sono alcune delle principali cause di malattia e morte. Molti modelli in vitro e in vivo sono attualmente disponibili per lo studio del meccanismo I/R in malattie o tessuti danneggiati. Tuttavia, ad oggi, non è stato riportato alcun modello I/R in ovo, il che consentirebbe una migliore comprensione dei meccanismi I/R e uno screening farmacologico più rapido. Questo documento descrive la modellazione I / R utilizzando un gancio personalizzato con ago spinale in un embrione di pulcino di 3 giorni per comprendere i meccanismi di sviluppo e trattamento I / R. Il nostro modello può essere utilizzato per studiare le anomalie a livello di DNA, RNA e proteine. Questo metodo è semplice, veloce e poco costoso. Il modello attuale può essere utilizzato indipendentemente o in combinazione con modelli I/R esistenti in vitro e in vivo.

La tecnica Doppler Blood Flow Imaging è stata utilizzata per valutare l'efficacia del nostro modello. In breve, abbiamo confrontato i dati del gruppo di controllo con i dati del gruppo RVA per determinare il successo della nostra creazione. La Figura 4A raffigura un flusso tipico associato all'animale di controllo, mentre la Figura 4B illustra i risultati ottenuti da un RVA. Il numero 1-8 rappresenta i vari eventi associati alle fasi I/R. In breve, il numero 1-...

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Generation of Hook Ischemia-Reperfusion Model using a Three-Day Developing Chick Embryo

Questo documento descrive la modellazione ischemia-riperfusione (I / R) in un embrione di pulcino di 3 giorni utilizzando un gancio personalizzato con ago spinale per comprendere meglio lo sviluppo e il trattamento I / R. Questo modello è semplice, veloce e poco costoso.

Generazione di un modello di ischemia-riperfusione del gancio utilizzando un embrione di pulcino in via di sviluppo di tre giorni

Ischemia and reperfusion (I/R) disorders, such as myocardial infarction, stroke, and peripheral vascular disease, are a few of the leading causes of ...

Ciao, sono il Dr.Syed Shadab Raza, il ricercatore principale per il Laboratorio di Cellule Staminali e Neurologia Restaurativa, situato presso il Dipartimento di Biotecnologie presso l'Era University Campus, Lucknow, India. Nel mio laboratorio, ci sforziamo di comprendere il meccanismo fisiopatologico alla base dei disturbi ischemia-riperfusione e gli interventi che possono invertire tali processi. In questo contesto, impieghiamo frequentemente il modello in vitro e in vivo dell'ictus ischemico.Recentemente, abbiamo creato un modello di lesione da riperfusione ischemica in un embrione di pulcino in via di sviluppo di tre giorni. Quindi ora i miei studenti ti mostreranno come replicare la lesione da ischemia-riperfusione in un embrione di pulcino in via di sviluppo di tre giorni. Ora ti mostreremo come creare ischemia-riperfusione in un embrione di pulcino di tre giorni.Il nostro modello è economico, efficace in termini di tempo e altamente riproducibile. Quindi iniziamo. Primo giorno.Requisiti per il primo giorno. Procedimento. Pulire l'uovo zero day con etanolo al 70% usando salviette di carta velina. Quindi, scrivi il giorno corrente, la data, sulle uova con il marcatore OHP e quindi posiziona le uova in un'incubatrice per uova con una temperatura da 36 a 37 gradi centigradi e dal 60 al 65% di umidità.Incubare le uova per le prossime 24 ore. Secondo giorno. Requisiti per il secondo giorno. Procedimento.Pulire la forbice chirurgica con etanolo al 70% o seguita da un'autoclave. Dopo 24 ore di incubazione, rimuovere l'uovo dall'incubatrice per la stratificazione. Quindi, attaccare un piccolo pezzo di Sellotape di circa un pollice di lunghezza e larghezza al bordo dell'uovo e quindi fare un piccolo foro nel bordo del guscio d'uovo usando la forbice a punta affilata seguita dall'inserimento di una siringa da cinque ml con un angolo di circa 75 gradi.Dopo aver inserito l'ago nel sacco del tuorlo, prelevare lentamente da cinque a sei ml di albumina. Dopo aver rimosso l'albumina, risigillare il buco con Sellotape e rimettere l'uovo nell'incubatrice per uova centigrada a 37 gradi per le prossime 48 ore. Quarto giorno.Requisiti per il quarto giorno. Procedimento. Preparare la soluzione di Ringer, soluzione salina normale allo 0,9% e una soluzione salina tampone X fosfato secondo le tabelle fornite in questo manoscritto. Quindi autoclave le tre soluzioni.Dopo l'autoclave, le rispettive soluzioni possono essere posizionate a temperatura ambiente. Quindi, estrarre l'uovo dall'incubatrice a 37 gradi. Ora, prima di tagliare il guscio, coprire l'area di finestratura con Sellotape.E ora fai un piccolo foro sul guscio d'uovo e inizia a tagliare un'apertura circolare. Questo processo è noto come windowing. Assicurati che il taglio circolare sia abbastanza grande in modo che l'embrione possa essere facilmente accessibile da qualsiasi direzione, poiché il posizionamento dell'uovo potrebbe dover essere regolato in base alla posizione dell'embrione.Ora, utilizzando un microscopio chirurgico con zoom stereo, individuare l'arteria vitale destra o RVA. Qui, la freccia indica lo stadio di sviluppo di tre giorni dell'embrione. Una volta individuato l'RVA, con l'uso di un ago da 26 G fare due piccoli fori sui lati sinistro e destro dell'RVA.Quindi, regolare la sonda di imaging del flusso sanguigno Doppler sull'RVA. La sonda doppler per l'imaging del flusso sanguigno deve essere posizionata cinque più meno un millimetro dal sito di ischemia e due terzi dall'estremità distale dell'RVA. Prendere la lettura del flusso per 30 secondi a due minuti, come desiderato.Questo renderà la lettura della fase normossia. Ora modella manualmente il bordo dell'ago spinale per dare al bordo una forma di gancio con l'aiuto di una pinza per il naso seguita da una pinza per i denti. Ora, usando un micropolatore, inserisci l'ago spinale appena sotto l'arteria vitale destra.Sei pronto a sollevare l'ago spinale. Ora, con l'assistenza del micropolatore, sollevare lentamente l'arteria fino a quando il flusso sanguigno Doppler mostra una diminuzione minima dell'80% del flusso arterioso. Una volta raggiunto un dropdown dell'80% o più nel flusso Doppler, lasciare l'ago spinale sollevato verso l'alto, tirando l'arteria per cinque minuti.Questo sarà il periodo di ischemia. Dopo questo tempismo ischemico di cinque minuti, rilasciare lentamente l'arteria con l'aiuto del micropolatore per ripristinare i normali livelli di flusso sanguigno. Ora il misuratore di flusso sanguigno Doppler dovrebbe mostrare letture simili a quelle osservate durante la normossia.Questo sarà il periodo di riperfusione nell'RVA. Dopo il processo I/R, applicare due, tre gocce di 1X PBS all'embrione. Infine, risigillare la finestra con Sellotape e quindi rimettere l'uovo nell'incubatrice per cinque ore e 55 minuti.Dopo cinque ore e 55 minuti, estrarre l'uovo dall'incubatrice e posizionarlo sul vassoio delle uova e riaprire la finestra. Requisiti di trattamento. Procedimento. Per il trattamento delle arterie con farmaci, attivatori o inibitori, l'RVA deve essere asportato dopo un'ora di processo I / R.Rimuovere l'embrione dal guscio estraendolo dal guscio su una capsula di Petri sterile da 100 mm. Una volta che l'embrione viene rilasciato nella capsula di Petri, asportare l'RVA usando l'iride oculare nella guida del microscopio chirurgico stereo zoom. La dimensione di escissione di RVA dovrebbe essere fino a 15 più meno un millimetro distale dal tronco e due più meno un millimetro verso il tronco.Dopo aver asportato l'RVA, lavarlo con 1X PBS in una nuova capsula di Petri sterile. Per i trattamenti desiderati, mettere l'arteria in un tubo centrifugo sterilizzato da 1,5 millilitri riempito con 500 microlitri della soluzione di Ringer. E dopo aver posizionato l'arteria nel tubo della centrifuga, mettere nell'incubatore di laboratorio a 37 gradi centigradi per cinque ore.Dopo cinque ore di incubazione, estrarre l'RVA dall'incubatore di laboratorio a 37 gradi centigradi e procedere per i trattamenti desiderati. E ora, per presentare i risultati. Per verificare l'utilità del nostro modello nella ricerca ischemico-riperfusionale nelle arterie ischemiche, abbiamo prima esaminato le attività delle proteine regolatrici dell'ossigeno 150 o ORP150, della superossido dismutasi citoplasmatica uno o della SOD1 e della catalasi.Gli VA trattati con I/R hanno mostrato un aumento dell'attività di ORP150, SOD1 citoplasmatica e catalasi rispetto al gruppo di controllo, tuttavia, integrando con N-acetil-L-cisteina, o NAC, un quencher ROS, ha ridotto lo stress ossidativo nel gruppo I/ R, come può essere evidente nella figura attuale. Per stabilire l'utilità di questo modello per le indagini infiammatorie, abbiamo esaminato l'espressione di I/R-1 beta e TNF-alfa negli ARRA trattati con I/R rispetto ai VA di controllo. Entrambe le interleuchine sono risultate sovra-espresse nel gruppo Hook-I/R rispetto al gruppo di controllo.L'integrazione di Naringenina, un farmaco antinfiammatorio, ha ridotto significativamente i livelli di IL1-beta e TNF-alfa. Successivamente, abbiamo esaminato l'espressione di NLRP3 e NF-kappa beta attraverso il Western blotting. Questa analisi ha scoperto prove di attivazione dell'inflamasoma NLRP3, così come NF-kappa beta in risposta all'I/R prodotto nell'RVA.Analogamente ai risultati precedenti, Naringenin ha ridotto l'espressione di NLRP3 e NF-kappa beta. Questi risultati hanno dimostrato che il nostro modello potrebbe essere utilizzato per studiare le alterazioni infiammatorie. Successivamente, abbiamo esaminato l'effetto di I / R sulle vie di apoptosi e autofagia.Innanzitutto, nella figura A, abbiamo avuto accesso all'espressione di caspasi-3 scissa. Abbiamo osservato una maggiore espressione di caspasi-3 scissa nel gruppo I/R rispetto al gruppo di controllo, mentre il gruppo I/R che riceveva ZVADFMK ha mostrato una diminuzione dell'espressione di caspasi-3. Analogamente per l'autofagia, il gruppo I/R ha mostrato alti livelli proteici di LC3, marcatore dell'autofagosoma Beclin-1, un regolatore chiave dell'autofagia nelle cellule di mammifero, e ATG-7, una proteina necessaria per l'autofagia basale, rispetto al gruppo di controllo, mentre i gruppi che hanno ricevuto 3-ma, un inibitore dell'autofagia, hanno mostrato una diminuzione dell'espressione delle tre proteine dell'autofagia di cui sopra, come evidente dalle figure da B a D.La figura E dimostra l'effetto dell'I/R mediato da Hook sui livelli di mRNA ambra-1 e ATG-7.Questi risultati erano in linea con i risultati precedenti, cioè è stata osservata una maggiore espressione di mRNA per ambra-1 e ATG-7 negli ARRA trattati con I/R rispetto ai rispettivi controlli. Tuttavia, i risultati sono stati invertiti quando 3-ma è stato aggiunto al gruppo I / R. La cifra attuale rappresenta l'efficacia del nostro modello per studiare le alterazioni nel DNA.Abbiamo osservato un intenso striscio di DNA nel gruppo trattato con I / R rispetto al gruppo di controllo. Tuttavia, l'integrazione di NAC al gruppo I/R RVA ha invertito il risultato. Per esaminare l'efficacia del nostro modello rispetto ad altri modelli, abbiamo confrontato i dati generati dal nostro modello Hook-I/R e dal modello MCAO nel presente esperimento.In breve, l'espressione della proteina apoptotica, la caspasi-3 scissa, le proteine dell'autofagia, Beclin-1 e ATG-7, e le interleuchine infiammatorie, TNF e IFN, era destinata ad essere più alta negli RVA trattati con I / R rispetto agli RVA di controllo. È interessante notare che il modello Hook-I / R ha dato risultati molto simili a quelli ottenuti dal modello MCAO, sia che si trattasse dell'analisi per lo stress infiammatorio o delle vie di morte cellulare. Il nostro modello può essere utilizzato per esperimenti di routine di ischemia-riperfusione, da solo o parallelamente ai modelli esistenti.Tuttavia, durante l'imitazione dell'ischemia-riperfusione, è necessario prendere la massima precauzione durante la perforazione, il lato destro e sinistro dell'RVA, e anche durante l'occlusione o il rilascio dell'RVA in modo che non danneggi le arterie o le vene. Nella biologia molecolare di routine come il Western blotting, l'analizzatore QRT-PCR, gli acidi chimici e le tecniche di imaging potrebbero essere improvvisati per associare la fisiopatologia associata all'ischemia-riperfusione in un embrione di pulcino in via di sviluppo di tre giorni. Questo modello potrebbe essere utilizzato in modo efficiente per studiare la meccanica molecolare a livello di DNA, RNA e proteine.Come vi abbiamo mostrato, la modellazione I/R in un embrione di pulcino in via di sviluppo di tre giorni, crediamo che il nostro modello aprirà nuove strade nel campo della ricerca I/R. Con questo lavoro, vi auguro tutto il meglio per i vostri esperimenti. Grazie.

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