Name: spatiotemporal subcellular manipulation of the microtubule cytoskeleton in the living preimplantation mouse embryo using photostatins
Uploaded: 2021-11-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins at JoVE.com

يود المؤلفان أن يشكرا الدكتور أوليفر ثورن سيهولد ولي غاو على تزويدنا بالصور المخفضة للكوليستروتنات والمشورة بشأن إعداد المخطوطات ، وموناش للإنتاج لدعم التصوير ، وموناش مايكرو إيميتش لدعم الفحص المجهري.
تم دعم هذا العمل من خلال منحة مشروع المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC) APP2002507 إلى J.Z. ومنحة Azrieli الدراسية للمعهد الكندي للبحوث المتقدمة (CIFAR) إلى J.Z. يتم دعم المعهد الأسترالي للطب التجديدي من خلال منح من حكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الأسترالية.

تمت الموافقة على التجارب من قبل لجنة موناش لأخلاقيات الحيوان تحت رقم أخلاقيات الحيوان 19143. تم إيواء الحيوانات في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في منشأة الحيوانات (منصة موناش لأبحاث الحيوانات) بما يتفق بدقة مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية.
1. جمع أجنة الفأر قبل الزرع</s...

<ol>
	<li>Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-dependent+subcellular+organisation+of+pluripotent+cells.">Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells.</a> Development. 148 (20), (2021).</li><li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-organizing+centers:+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites.">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).</li><li>Galli, M., Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+size+determines+the+strength+of+the+spindle+assembly+checkpoint+during+embryonic+development.">Cell size determines the strength of the spindle assembly checkpoint during embryonic development.</a> Developmental Cell. 36 (3), 344-352 (2016).</li><li>Vazquez-Diez, C., Paim, L. M. G., FitzHarris, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-size-independent+spindle+checkpoint+failure+underlies+chromosome+segregation+error+in+mouse+embryos.">Cell-size-independent spindle checkpoint failure underlies chromosome segregation error in mouse embryos.</a> Current Biology. 29 (5), 865-873 (2019).</li><li>Baudoin, J. P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nocodazole-induced+changes+in+microtubule+dynamics+impair+the+morphology+and+directionality+of+migrating+medial+ganglionic+eminence+cells.">Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells.</a> Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).</li><li>Munz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+lose+their+functional+properties+after+paclitaxel+treatment.">Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).</li><li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs.">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li><li>Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomolar+concentrations+of+nocodazole+alter+microtubule+dynamic+instability+in+vivo+and+in+vitro.">Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro.</a> Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).</li><li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoswitchable+inhibitors+of+microtubule+dynamics+optically+control+mitosis+and+cell+death.">Photoswitchable inhibitors of microtubule dynamics optically control mitosis and cell death.</a> Cell. 162 (2), 403-411 (2015).</li><li>Gaspari, R., Prota, A. E., Bargsten, K., Cavalli, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+cis-+and+trans-Combretastatin+binding+to+tubulin.">Structural basis of cis- and trans-Combretastatin binding to tubulin.</a> Chem. 2 (1), 102-113 (2017).</li><li>Thorn-Seshold, O., Meiring, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocontrolling+microtubule+dynamics+with+photoswitchable+chemical+reagents.">Photocontrolling microtubule dynamics with photoswitchable chemical reagents.</a> ChemRxiv. , (2021).</li><li>Kopf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+control+cellular+shape+and+coherence+in+amoeboid+migrating+cells.">Microtubules control cellular shape and coherence in amoeboid migrating cells.</a> Journal of Cell Biology. 219 (6), 201907154 (2020).</li><li>Sawada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlexinD1+signaling+controls+morphological+changes+and+migration+termination+in+newborn+neurons.">PlexinD1 signaling controls morphological changes and migration termination in newborn neurons.</a> The EMBO Journal. 37 (4), 97404 (2018).</li><li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+microtubule+dynamics+directs+cell+mechanics+and+coordinates+forces+during+epithelial+morphogenesis.">Polarized microtubule dynamics directs cell mechanics and coordinates forces during epithelial morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 20 (10), 1126-1133 (2018).</li><li>Kepiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azidoblebbistatin,+a+photoreactive+myosin+inhibitor.">Azidoblebbistatin, a photoreactive myosin inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (24), 9402-9407 (2012).</li><li>Zenker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microtubule-organizing+center+directing+intracellular+transport+in+the+early+mouse+embryo.">A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo.</a> Science. 357 (6354), 925-928 (2017).</li><li>White, M. D., Zenker, J., Bissiere, S., Plachta, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instructions+for+assembling+the+early+mammalian+embryo.">Instructions for assembling the early mammalian embryo.</a> Developmental Cell. 45 (6), 667-679 (2018).</li><li>Zenker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+actin+rings+zipper+the+mouse+embryo+for+blastocyst+formation.">Expanding actin rings zipper the mouse embryo for blastocyst formation.</a> Cell. 173 (3), 776-791 (2018).</li><li>Theisen, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+and+motor+proteins+support+zebrafish+neuronal+migration+by+directing+cargo.">Microtubules and motor proteins support zebrafish neuronal migration by directing cargo.</a> Journal of Cell Biology. 219 (10), 201908040 (2020).</li><li>Rulicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pronuclear+microinjection+of+mouse+zygotes.">Pronuclear microinjection of mouse zygotes.</a> Methods in Molecular Biology. 254, 165-194 (2004).</li><li>Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+mouse+oocytes.">Isolation and in vitro culture of mouse oocytes.</a> Bio-protocol. 11 (15), 4104 (2021).</li><li>Subramanian, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocytes+mount+a+noncanonical+DNA+damage+response+involving+APC-Cdh1-mediated+proteolysis.">Oocytes mount a noncanonical DNA damage response involving APC-Cdh1-mediated proteolysis.</a> Journal of Cell Biology. 219 (4), 201907213 (2020).</li><li>Mihajlovic, A. I., Bruce, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+cell-fate+decision+of+mouse+preimplantation+embryo+development:+integrating+cell+position+and+polarity.">The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity.</a> Open Biology. 7 (11), 170210 (2017).</li><li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+speed+of+GTP+hydrolysis+determines+GTP+cap+size+and+controls+microtubule+stability.">The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability.</a> Elife. 9, 51992 (2020).</li><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+photocontrol+of+microtubule+dynamics+and+integrity,+migration+and+mitosis,+by+the+potent+GFP-imaging-compatible+photoswitchable+reagents+SBTubA4P+and+SBTub2M.">In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M.</a> BioRxiv. bioRxiv. , (2021).</li><li>Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+strategy+and+vector+library+for+the+rapid+generation+of+modular+light-controlled+protein-protein+interactions.">Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).</li><li>van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+microtubule+dynamics.">Optogenetic control of microtubule dynamics.</a> Methods in Molecular Biology. 2101, 211-234 (2020).</li><li>Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+microtubule+dynamics+using+an+optogenetic+microtubule+plus+end-F-actin+cross-linker.">Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).</li><li>Kogler, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+rapid+and+reversible+optogenetic+perturbation+of+nuclear+proteins+in+living+embryos.">Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos.</a> Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).</li><li>Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+microtubule+cytoskeleton:+setting+up+and+working+with+an+ablation+system.">Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system.</a> Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).</li><li>Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+combretastatins+as+potent+tubulin+polymerization+inhibitors.">Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors.</a> Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).</li><li>Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promising+applications+of+tumor+spheroids+and+organoids+for+personalized+medicine.">Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine.</a> Cancers (Basel). 12 (10), 2727 (2020).</li><li>Scherer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+and+uptake+of+the+anticancer+drug+combretastatin+in+cell+spheroids+and+photoisomerization+in+gels+with+multiphoton+excitation.">Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003 (2015).</li></ol>

شبكة الأنابيب الدقيقة هي جزء لا يتجزأ من الأعمال الداخلية الأساسية للخلية. وبالتالي ، فإن هذا يمثل تحديات في التلاعب بديناميكيات الأنابيب الدقيقة في الكائنات الحية ، حيث أن أي اضطراب في الشبكة يميل إلى أن يكون له عواقب واسعة النطاق على جميع جوانب الوظيفة الخلوية. يمثل ظهور مركبات استهداف ...

تختلف بنية الأنابيب الدقيقة اختلافا كبيرا عبر أنواع الخلايا المختلفة لدعم وظائف متنوعة 1,2. تسمح طبيعتها الديناميكية للنمو والانكماش بالتكيف السريع مع الإشارات خارج وداخل الخلايا والاستجابة للاحتياجات المتغيرة باستمرار للخلية. وبالتالي ، يمكن اعتبارها "بصمة مورفولوجية" تلعب دورا رئيسيا في الهوية الخلوية.
أدى الاستهداف الدوائي للهيكل الخلوي للأنابيب الدقيقة باستخدام مثبطات الجزيئات الصغيرة إلى عدد كبير من الاكتشافات الأساسية في علم الأحياء التنموي ، وبيولوجيا الخلايا الجذعية ، وبيولوجيا السرطان ، والبيولوجيا العصبية3،4،5،6،7. وعلى الرغم من أن هذا النهج لا غنى عنه، فإنه ينطوي على قيود مختلفة مثل السمية والآثار غير المستهدفة. على سبيل المثال ، أحد أكثر عوامل استهداف الأنابيب الدقيقة استخداما على نطاق واسع ، نوكودازول ، هو دواء قوي لإزالة البلمرة من الأنابيب الدقيقة8. ومع ذلك ، فإن مثبطات الجزيئات الصغيرة مثل نوكودازول نشطة من وقت التطبيق ، وبالنظر إلى الطبيعة الأساسية للهيكل الخلوي للأنابيب الدقيقة للعديد من الوظائف الخلوية الحرجة ، فإن إزالة البلمرة العالمية من الأنابيب الدقيقة يمكن أن تنتج تأثيرات خارج الهدف ، والتي قد تكون غير مناسبة للعديد من التطبيقات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن علاج نوكودازول لا رجعة فيه ما لم يتم غسل العينات الخالية من الدواء ، مما يمنع التصوير الحي المستمر ، وبالتالي التتبع الدقيق لخيوط الأنابيب الدقيقة الفردية.
بدأ تطوير المركبات المنشطة بالضوء بإنشاء جزيئات غير محبوسة ضوئيا وبشرت بعصر جديد في استهداف ومراقبة آثار تثبيط نمو الأنابيب الدقيقة بطريقة دقيقة وخاضعة للتحكم الزماني المكاني. تم تطوير عائلة واحدة من الأدوية القابلة للتحويل الضوئي بشكل عكسي ، photostatins (PSTs) ، عن طريق استبدال مكون stilbene من combretastatin A-4 ب azobenzene9. تكون PSTs غير نشطة حتى الإضاءة بضوء الأشعة فوق البنفسجية ، حيث يتحول التكوين العابر غير النشط إلى تكوين رابطة الدول المستقلة النشط عن طريق الأيزومرات القابلة للعكس. تمنع Cis-PSTs بلمرة الأنابيب الدقيقة عن طريق الارتباط بموقع ربط الكولشيسين β-توبولين ، مما يمنع واجهته مع β-tubulin ويمنع dimerization المطلوب لنمو microtubule10. من بين مجموعة من PSTs ، برز PST-1P كمركب رصاص لأنه يتمتع بأعلى فعالية ، وهو قابل للذوبان في الماء بالكامل ، ويظهر بداية سريعة للنشاط الحيوي بعد الإضاءة.
يحدث الأيزومرات الأكثر فعالية عبر إلى رابطة الدول المستقلة ل PSTs عند أطوال موجية تتراوح بين 360-420 نانومتر ، مما يتيح خيارات مزدوجة لتنشيط PST. يمكن إعطاء خط ليزر 405 نانومتر على مجهر بؤري نموذجي للاستهداف المكاني الأمثل لتثبيط نمو الأنابيب الدقيقة. إن القدرة على تحديد موقع وتوقيت تنشيط PST من خلال إضاءة ليزر 405 نانومتر تسهل التحكم الزمني والمكاني الدقيق ، مما يسمح بتعطيل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة على المستوى دون الخلوي ، ضمن أوقات الاستجابة دون الثانية9. بدلا من ذلك ، يسمح ضوء الأشعة فوق البنفسجية LED بأسعار معقولة لإضاءة الكائن الحي بالكامل بالحث على تعطيل بنية الأنابيب الدقيقة على مستوى الكائن الحي. قد يكون هذا بديلا فعالا من حيث التكلفة للباحثين الذين يكون الهدف هو بداية التثبيط في الوقت المحدد بدقة ، بدلا من الاستهداف المكاني. ميزة أخرى ل PSTs هي تعطيلها عند الطلب عن طريق تطبيق الضوء الأخضر للطول الموجي في نطاق 510-540 نانومتر9. وهذا يتيح تتبع خيوط الأنابيب الدقيقة قبل وأثناء وبعد تثبيط النمو بوساطة PST.
على الرغم من أن PSTs لا يزال تصميما حديثا نسبيا ، فقد تم استخدامه في العديد من التطبيقات المخبرية عبر مجالات بحثية متنوعة11 ، بما في ذلك التحقيق في آليات جديدة لهجرة الخلايا في الأميبويدات12 ، في الخلايا العصبية المعزولة من دماغ الفأر حديث الولادة13 ، وتطوير ظهارة الجناح في ذبابة الفاكهة 14 . أثبتت الأدوية الأخرى التفاعلية الخفيفة أنها أدوات قيمة في التعطيل المستهدف للوظيفة الخلوية. على سبيل المثال ، تم استخدام تناظرية من blebbistatin ، azidoblebbistatin ، لتعزيز تثبيط الميوسين تحت الإضاءة15,16. وهذا يسلط الضوء على إمكانية اكتشافات جديدة بسبب القدرة على تثبيط الوظيفة الخلوية التي يتم التحكم فيها زمنيا ومكانيا.
تقدم الكائنات الحية 3D أنظمة رائعة ولكنها أكثر حساسية للتعامل مع ديناميكيات الأنابيب الدقيقة على مستوى حيواني كامل أو خلية واحدة أو دون خلوية في ظل ظروف فسيولوجية. على وجه الخصوص ، يقدم جنين الفأر قبل الزرع نظرة ثاقبة استثنائية في الأعمال الداخلية للخلية وكذلك العلاقات بين الخلايا داخل الكائن الحي17. ساهمت الدورات المتتالية المستهدفة زمنيا ومكانيا لتنشيط وتعطيل PSTs في توصيف الجسر بين الأطوار ، وهو بنية ما بعد الحركية الخلوية بين الخلايا ، كمركز غير مركزي لتنظيم الأنابيب الدقيقة في جنين الفأر قبل الزرع16. أظهر إعداد تجريبي مماثل مشاركة الأنابيب الدقيقة النامية في ختم جنين الفأر للسماح بتكوين الكيسة الأريمية18. علاوة على ذلك ، تم استخدام PSTs أيضا في أجنة الزرد الكاملة للتحقيق في هجرة الخلايا العصبية عن طريق تثبيط نمو الأنابيب الدقيقة في مجموعة فرعية من الخلايا في الدماغ الخلفي19.
يصف هذا البروتوكول الإعداد التجريبي واستخدام PST-1P في جنين الفأر قبل الزرع. يمكن للتعليمات المقدمة هنا أيضا توجيه تطبيق PSTs لمجموعة واسعة من الأهداف مثل دراسة فصل الكروموسومات وانقسام الخلايا ، والاتجار بالبضائع داخل الخلايا ، وتكوين الخلايا وهجرتها. وعلاوة على ذلك، ستساعد هذه الدراسات على تنفيذ PSTs في الأنظمة العضوية، والأروميات، وغيرها من نماذج الأجنة مثل Caenorhabditis elegans و Xenopus laevis، فضلا عن إمكانية توسيع استخدام PSTs لتقنيات الإخصاب في المختبر .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td>For mouth aspiration apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slides - LabTek</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NUN155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cRNA encoding for EB3-dTomato</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dishes - 35mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic growth hormone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Tubal Fluid (HTF) medium</td>
			<td>Cosmo-Bio</td>
			<td>CSR-R-B071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Image Analysis Software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil W 2010</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>For use with microscope immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED torch - Red light</td>
			<td>Celestron</td>
			<td>93588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice - wild-type FVB/N, males and females</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary Pipettes - Kimble</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z543306</td>
			<td>For mouth aspiration apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-4008-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage In vitro Transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium</td>
			<td>Cosmo-Bio</td>
			<td>CSR-R-B074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotrophin</td>
			<td>Prospec Bio</td>
			<td>HOR-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PST-1P</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>B511361-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Black Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporal subcellular manipulation of the microtubule cytoskeleton in the living preimplantation mouse embryo using photostatins

يشكل الهيكل الخلوي للنبيبات الدقيقة إطار الخلية وهو أساسي للنقل داخل الخلايا وانقسام الخلايا ونقل الإشارة. يمكن أن يكون للاضطراب الدوائي التقليدي لشبكة الأنابيب الدقيقة في كل مكان باستخدام ، على سبيل المثال ، نوكودازول عواقب وخيمة على أي خلية. مثبطات الأنابيب الدقيقة القابلة للتحويل الضوئي بشكل عكسي لديها القدرة على التغلب على القيود من خلال تمكين تنفيذ تأثيرات الدواء بطريقة يتم التحكم فيها مكانيا وزمنيا. واحدة من هذه العائلات من الأدوية هي الفوتوستاتينات القائمة على الآزوبنزين (PSTs). هذه المركبات غير نشطة في الظروف المظلمة ، وعند الإضاءة بضوء الأشعة فوق البنفسجية ، فإنها ترتبط بموقع ربط الكولشيسين β-tubulin وتمنع بلمرة الأنابيب الدقيقة والدوران الديناميكي. هنا ، تم تعيين تطبيق PSTs في جنين الفأر الحي ثلاثي الأبعاد (3D) قبل الزرع لتعطيل شبكة microtubule على المستوى دون الخلوي. يوفر هذا البروتوكول إرشادات للإعداد التجريبي ، بالإضافة إلى معلمات التنشيط الضوئي وإلغاء التنشيط ل PSTs باستخدام المجهر البؤري للخلية الحية. وهذا يضمن قابلية التكرار ويمكن الآخرين من تطبيق هذا الإجراء على أسئلتهم البحثية. قد تتطور مفاتيح التبديل الضوئية المبتكرة مثل PSTs كأدوات قوية لتعزيز فهم شبكة الأنابيب الدقيقة الديناميكية داخل الخلايا والتلاعب بالهيكل الخلوي بشكل غير جراحي في الوقت الفعلي. علاوة على ذلك ، قد تكون PSTs مفيدة في هياكل 3D الأخرى مثل المواد العضوية أو الأروميات أو أجنة الأنواع الأخرى.

وتماشيا مع البروتوكول، تم حقن أجنة الفئران قبل الزرع بالحمض النووي الريبوزي المرسال (cRNA) ل EB3، الموسومة بالطماطم الفلورية الحمراء (EB3-dTomato). وهذا يتيح تصور الأنابيب الدقيقة المتنامية حيث يرتبط EB3 ببلمرة الأنابيب الدقيقة بالإضافة إلى نهايات24.
أجريت التجارب بعد 3 أ...

Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins at JoVE.com

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

مثبطات الأنابيب الدقيقة النموذجية ، المستخدمة على نطاق واسع في البحوث الأساسية والتطبيقية ، لها تأثيرات بعيدة المدى على الخلايا. في الآونة الأخيرة ، ظهرت الفوتوستاتينات كفئة من مثبطات الأنابيب الدقيقة القابلة للتحويل الضوئي ، القادرة على التلاعب الفوري والقابل للانعكاس والدقيق مكانيا للأنابيب الدقيقة. يفصل هذا البروتوكول خطوة بخطوة تطبيق photostatins في جنين فأر 3D حي قبل الزرع.

التلاعب المكاني الزماني دون الخلوي للهيكل الخلوي للأنابيب الدقيقة في جنين الفأر الحي قبل الزرع باستخدام الفوتوستاتينات

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. ...

هذا البروتوكول هو الأول من نوعه لتطبيق photostatins على جنين الفأر الحي قبل الزرع ، والنظر في الاستخدامات لاستخدام الأدوية القابلة للتحويل الضوء على الأنظمة الفسيولوجية 3D الأخرى. تسمح الفوتوستانات القابلة للتحويل الضوئي بالتلاعب بنمو الأنابيب الدقيقة ، في المكان والزمان ، وتحويلها مرة أخرى إلى حالة إيقاف التشغيل. يمكن أن يؤدي تعريض الفوتوستاتينات عن غير قصد للضوء الأزرق ، قبل التجربة ، إلى تنشيطها قبل الأوان.لذلك ننصح بالعمل في ظلام دامس ، أو ظروف الضوء الأحمر ، في جميع الأوقات عند إعداد عيناتك. في الظروف المظلمة الصارمة ، باستخدام الضوء الأحمر فقط للإضاءة ، ابدأ في صنع المخزون وحل العمل الوسيط ل PST-1P في الماء فائق النقاء. كما هو موضح في نص المخطوطة.بعد ذلك ، قم بتخفيف PST-1P في KSOM الطازج لتحقيق التركيز النهائي البالغ 40 M.To قم بإعداد شريحة الغرفة للتصوير الحي ، وأضف 10 لتر من KSOM المعالج ب PST-1P في وسط بئر واحد ، لتشكيل قطرة نصف كروية. لمنع القطيرة من التبخر ، قم بتغطيتها بزيت معدني كاف. بعد ذلك ، قم بلف طبق الثقافة المحضر بشكل فضفاض في رقائق معدنية ، أو ضع طبق الثقافة في حاوية غير شفافة محكمة الإغلاق في الحاضنة لضمان عدم التعرض للضوء.بعد نقل الأجنة إلى قطرة KSOM المعالجة ب PST-1P ، تأكد من تجميع الأجنة في وسط القطرة ، وتسويتها في قاع الطبق. بمجرد إعداد عدسة هدف الغمر ، قم بتركيب شريحة الغرفة على المجهر ، داخل غرفة بيئية. اضبط على 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، وفي ظلام دامس ، لضمان أن جميع PST-1Ps في التكوين غير النشط ، وأن الأجنة يمكن أن تغرق في قاع الطبق.استخدم شعلة الضوء الأحمر لوضع العدسة الموضوعية في ملامسة وسط الغمر. ثم حدد موقع حافة قطرة الوسط ووضع الهدف فوقه مباشرة. باستخدام وضع المسح الحي ، وليزر 561 نانومتر ، حدد موقع الأجنة داخل القطرة.استخدم وحدات التحكم في المرحلة ووضع المسح الضوئي المباشر لتعيين نقطتي البداية والنهاية للحصول على مكدس z للجنين بأكمله. اضبط إعدادات طاقة الليزر بحد أقصى 5٪ وفقا لإشارتك. واضبط الإزاحة الرقمية على 0.900 كحد أقصى ، وفقا لإشارتك ، لتحسين مظهر مذنبات EB3-dTomato.تقليل ضوضاء الخلفية. اضبط الثقب على ارتفاع 2 متر. دقة بكسل عند 512 × 512.ووقت سكن البكسل عند 3.15 ثانية. واضبط التكبير/التصغير على 2x. الحصول على كومة z من الجنين كله مع فترات مقطع 1 م لتقييم مناطق نمو الأنابيب الدقيقة في الكائن الحي بأكمله.بالنسبة لتجارب تتبع مذنب EB3-dTomato ، افتح صورة 3D z-stack ، وقم بزيادة التكبير إلى ثلاث مرات. ورسم عائد استثمار مستطيل حول منطقة الاهتمام دون الخلوية المحددة. بعد ذلك ، احصل على فيلم الفاصل الزمني لمستوى z واحد ، باستخدام المعلمات المحددة ، مع الفاصل الزمني البالغ 500 مللي ثانية.لتنشيط PST-1P ، قم بالتبديل إلى ليزر 405 نانومتر ، واحصل على فاصل زمني آخر ، مع ضبط الليزر على 10٪ من الطاقة ، وفتح الثقب إلى أقصى حد ، ودقة بكسل 512 × 512 ، ووقت سكن البكسل 3.15 ثانية ، والتكبير ثلاث مرات ، في فاصل زمني قدره 500 مللي ثانية ، وتعيين 20 إطارا ليتم الحصول عليها. مباشرة بعد التنشيط ، قم بالتبديل مرة أخرى إلى ليزر 561 نانومتر ، وكرر الاستحواذ ، كما هو موضح سابقا ، لتأكيد فقدان مذنبات EB3-dTomato بعد تنشيط PST-1P. الآن ، لعكس PST-1P مرة أخرى إلى حالته العابرة غير النشطة ، قم بتشغيل ليزر 514 نانومتر ، واحصل على فاصل زمني آخر مع معلمات محددة.لتصور استعادة مذنبات EB3-dTomato ، عد إلى ليزر 561 نانومتر ، وكرر الاستحواذ. في أجنة التحكم غير المعالجة ، قبل الإضاءة باستخدام ليزر 405 نانومتر ، كانت إشارة EB3-dTomato عالية داخل السيتوبلازم بأكمله للخلية ، باستثناء المنطقة النووية. بعد الإضاءة ، لم يتم الكشف عن التغييرات في الإشارة.مشيرا إلى أن ليزر 405 نانومتر لم يسبب تلفا للصورة للجنين أو ديناميكيات الأنابيب الدقيقة. أثناء معالجة PST-1P للأجنة المكونة من 16 خلية ، في ظل ظروف مظلمة صارمة ، تم الكشف عن تعبير EB3-dTomato القوي في الصورة ثلاثية الأبعاد ، مما يدل على أن PST-1P غير النشط لم يثير تثبيط بلمرة الأنابيب الدقيقة في ظل الظروف المظلمة. قبل تنشيط PST-1P ، أكد التصوير بالفاصل الزمني لمستوى z واحد تعبيرا قويا عن EB3-dTomato ، وبلمرة الأنابيب الدقيقة في منطقة دون الخلايا.بعد تنشيط الضوء 405 نانومتر ، في غضون ثوان ، تم الكشف عن انخفاض في إشارة المذنب EB3-dTomato. وتم تحقيق استعادة الإشارة عند تعطيل PST-1P ، باستخدام ليزر 514 نانومتر. أظهرت الأجنة التي تم حقنها بالطماطم EB3-dTomato، واحتضانها باستخدام PST-1P، إمكانات جنينية طبيعية، وتطورت إلى مرحلة الكيسة الأريمية.وديناميكيات الأنابيب الدقيقة الطبيعية أثناء الانقسام الخيطي. الإشارة إلى عدم سمية PST-1P النشطة للجنين. في أفلام الفاصل الزمني المكتسبة ، ظهرت علامات EB3-dTomato كهياكل تشبه المذنبات ، ومكنت من تتبع خيوط الأنابيب الدقيقة المتنامية.في الأجنة المعالجة PST-1P ، المحفوظة في ظروف مظلمة ، انبثقت مذنبات EB3-dTomato الفردية من الجسر بين الأطوار ، والذي يعمل كمركز تنظيم للأنابيب الدقيقة غير المركزية في جنين الفأر المبكر. يظهر مكدس t مذنبات EB3-dTomato في منطقة الجسر بين الطور. بعد تنشيط PST-1P ، تم تقليل مذنبات EB3-dTomato في قاعدة الجسر بين الأطوار وفي مكدس t.تذكر أن الضوء الأبيض يمكن أن ينشط PST-1P قبل الأوان. لذا استخدم مصادر الضوء الأحمر فقط للرؤية. يعمل الضوء الأخضر أيضا على إلغاء تنشيط PST-1P ، لذا يرجى تجنب استخدام علامات ملصقات الفلورسنت الخضراء.وقد استخدمت هذه التقنية في ذبابة الفاكهة والأميبا والفئران وأنظمة المختبر المتعددة ، لاستهداف نمو الأنابيب الدقيقة من أجل دراسة هجرة الخلايا وتكوين الأنسجة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

قياس الاستقرار البروتين المتواجد في الحي اسماك الزرد الأجنة عن طريق الإسفار تسوس بعد Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

توصيف التوتة تسوية الأسلاف في جنين الفأر عن طريق<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead زرع الأجنة الزرد

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

تحديد أسلاف ريدثروميلويد وذريتهم في الجنين الماوس عن طريق التدفق الخلوي

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

اشتقاق خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الجيني الماوس

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

فعالية "تجريد الهواء" في "اثنين من أسماك السلمون"، تراوت قوس قزح (Oncorhynchus Mykiss) وسمك السلمون المرقط البنى (Salmo Trutta مورفى فريو)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

نقل الاجنه طفيف التوغل والتزجيج الجنيني في مرحله الجنين الأمثل في نموذج الأرنب

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

في المختبر أعاده تشكيل الخلية المكانية أنماط الاتصال مع المعزولة Caenorhabditis الاجنه البدائية والخرز البوليسترين لاصقه

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...