Name: spatiotemporal subcellular manipulation of the microtubule cytoskeleton in the living preimplantation mouse embryo using photostatins
Uploaded: 2021-11-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins at JoVE.com

Die Autoren danken Dr. Oliver Thorn-Seshold und Li Gao für die Bereitstellung von Photostatinen und Ratschlägen zur Manuskriptvorbereitung, Monash Production für die Unterstützung bei den Dreharbeiten und Monash Micro Imaging für die Unterstützung der Mikroskopie.
Diese Arbeit wurde durch den Projektzuschuss APP2002507 des National Health and Medical Research Council (NHMRC) an J.Z. und das Canadian Institute for Advanced Research (CIFAR) Azrieli-Stipendium für J.Z. Das Australian Regenerative Medicine Institute wird durch Zuschüsse der Landesregierung von Victoria und der australischen Regierung unterstützt.

Die Experimente wurden von der Monash Animal Ethics Committee unter der Tierethiknummer 19143 genehmigt. Die Tiere wurden in der Tiereinrichtung (Monash Animal Research Platform) unter strikten ethischen Richtlinien unter bestimmten pathogenfreien Tierstallbedingungen untergebracht.
1. Präimplantations-Maus-Embryo-Entnahme
<ol><li>Superovulierte und paarende Mäuse wie zuvor beschrieben16,18, in Übereinstimmung mit...

<ol>
	<li>Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-dependent+subcellular+organisation+of+pluripotent+cells.">Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells.</a> Development. 148 (20), (2021).</li><li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-organizing+centers:+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites.">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).</li><li>Galli, M., Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+size+determines+the+strength+of+the+spindle+assembly+checkpoint+during+embryonic+development.">Cell size determines the strength of the spindle assembly checkpoint during embryonic development.</a> Developmental Cell. 36 (3), 344-352 (2016).</li><li>Vazquez-Diez, C., Paim, L. M. G., FitzHarris, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-size-independent+spindle+checkpoint+failure+underlies+chromosome+segregation+error+in+mouse+embryos.">Cell-size-independent spindle checkpoint failure underlies chromosome segregation error in mouse embryos.</a> Current Biology. 29 (5), 865-873 (2019).</li><li>Baudoin, J. P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nocodazole-induced+changes+in+microtubule+dynamics+impair+the+morphology+and+directionality+of+migrating+medial+ganglionic+eminence+cells.">Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells.</a> Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).</li><li>Munz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+lose+their+functional+properties+after+paclitaxel+treatment.">Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).</li><li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs.">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li><li>Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomolar+concentrations+of+nocodazole+alter+microtubule+dynamic+instability+in+vivo+and+in+vitro.">Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro.</a> Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).</li><li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoswitchable+inhibitors+of+microtubule+dynamics+optically+control+mitosis+and+cell+death.">Photoswitchable inhibitors of microtubule dynamics optically control mitosis and cell death.</a> Cell. 162 (2), 403-411 (2015).</li><li>Gaspari, R., Prota, A. E., Bargsten, K., Cavalli, A., Steinmetz, M. 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D., Zenker, J., Bissiere, S., Plachta, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instructions+for+assembling+the+early+mammalian+embryo.">Instructions for assembling the early mammalian embryo.</a> Developmental Cell. 45 (6), 667-679 (2018).</li><li>Zenker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+actin+rings+zipper+the+mouse+embryo+for+blastocyst+formation.">Expanding actin rings zipper the mouse embryo for blastocyst formation.</a> Cell. 173 (3), 776-791 (2018).</li><li>Theisen, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+and+motor+proteins+support+zebrafish+neuronal+migration+by+directing+cargo.">Microtubules and motor proteins support zebrafish neuronal migration by directing cargo.</a> Journal of Cell Biology. 219 (10), 201908040 (2020).</li><li>Rulicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pronuclear+microinjection+of+mouse+zygotes.">Pronuclear microinjection of mouse zygotes.</a> Methods in Molecular Biology. 254, 165-194 (2004).</li><li>Greaney, J., Subramanian, G. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+cell-fate+decision+of+mouse+preimplantation+embryo+development:+integrating+cell+position+and+polarity.">The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity.</a> Open Biology. 7 (11), 170210 (2017).</li><li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+speed+of+GTP+hydrolysis+determines+GTP+cap+size+and+controls+microtubule+stability.">The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability.</a> Elife. 9, 51992 (2020).</li><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+photocontrol+of+microtubule+dynamics+and+integrity,+migration+and+mitosis,+by+the+potent+GFP-imaging-compatible+photoswitchable+reagents+SBTubA4P+and+SBTub2M.">In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M.</a> BioRxiv. bioRxiv. , (2021).</li><li>Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+strategy+and+vector+library+for+the+rapid+generation+of+modular+light-controlled+protein-protein+interactions.">Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).</li><li>van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+microtubule+dynamics.">Optogenetic control of microtubule dynamics.</a> Methods in Molecular Biology. 2101, 211-234 (2020).</li><li>Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+microtubule+dynamics+using+an+optogenetic+microtubule+plus+end-F-actin+cross-linker.">Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).</li><li>Kogler, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+rapid+and+reversible+optogenetic+perturbation+of+nuclear+proteins+in+living+embryos.">Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos.</a> Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).</li><li>Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+microtubule+cytoskeleton:+setting+up+and+working+with+an+ablation+system.">Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system.</a> Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).</li><li>Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+combretastatins+as+potent+tubulin+polymerization+inhibitors.">Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors.</a> Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).</li><li>Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promising+applications+of+tumor+spheroids+and+organoids+for+personalized+medicine.">Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine.</a> Cancers (Basel). 12 (10), 2727 (2020).</li><li>Scherer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+and+uptake+of+the+anticancer+drug+combretastatin+in+cell+spheroids+and+photoisomerization+in+gels+with+multiphoton+excitation.">Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003 (2015).</li></ol>

Das Mikrotubuli-Netzwerk ist integraler Bestandteil des grundlegenden Innenlebens einer Zelle. Folglich stellt dies eine Herausforderung bei der Manipulation der Mikrotubulidynamik in lebenden Organismen dar, da jede Störung des Netzwerks tendenziell weitreichende Folgen für alle Aspekte der zellulären Funktion hat. Das Aufkommen von photoschaltbaren Mikrotubuli-Targeting-Verbindungen stellt eine Möglichkeit dar, das Zytoskelett auf subzellulärer Ebene präzise zu manipulieren, mit überlegener Kontrolle für die In...

Die Mikrotubuli-Architektur variiert stark zwischen verschiedenen Zelltypen, um verschiedene Funktionen zu unterstützen 1,2. Seine dynamische Natur des Wachstums und der Schrumpfung ermöglicht eine schnelle Anpassung an extra- und intrazelluläre Hinweise und die Reaktion auf die sich ständig ändernden Bedürfnisse einer Zelle. Daher kann es als der "morphologische Fingerabdruck" betrachtet werden, der eine Schlüsselrolle bei der zellulären Identität spielt.
Das pharmakologische Targeting des Mikrotubuli-Zytoskeletts unter Verwendung von niedermolekularen Inhibitoren hat zu einer Fülle grundlegender Entdeckungen in der Entwicklungsbiologie, Stammzellbiologie, Krebsbiologie und Neurobiologiegeführt 3,4,5,6,7. Dieser Ansatz ist zwar unverzichtbar, weist jedoch verschiedene Einschränkungen wie Toxizität und Off-Target-Effekte auf. Zum Beispiel ist eines der am weitesten verbreiteten Mikrotubuli-Targeting-Mittel, Nocodazol, ein starkes Mikrotubuli-Depolymerisationsmittel8. Niedermolekulare Inhibitoren wie Nocodazol sind jedoch ab dem Zeitpunkt der Anwendung aktiv, und angesichts der essentiellen Natur des Mikrotubuli-Zytoskeletts für viele kritische zelluläre Funktionen kann die globale Depolymerisation von Mikrotubuli Off-Target-Effekte erzeugen, die für viele Anwendungen ungeeignet sein können. Darüber hinaus ist die Nocodazol-Behandlung irreversibel, es sei denn, die Proben werden frei von dem Arzneimittel gewaschen, wodurch eine kontinuierliche Live-Bildgebung und damit eine präzise Verfolgung einzelner Mikrotubuli-Filamente verhindert wird.
Die Entwicklung lichtaktivierter Verbindungen begann mit der Schaffung von photounkäfigförmigen Molekülen und hat eine neue Ära in der gezielten und überwachung der Auswirkungen der Wachstumshemmung von Mikrotubuli auf präzise und räumlich-zeitlich kontrollierte Weise eingeläutet. Eine Familie von reversibel photoschaltbaren Medikamenten, Photostatine (PSTs), wurde entwickelt, indem die Stilbenkomponente von Combretastatin A-4 durch Azobenzel 9 ersetztwurde. PSTs sind bis zur Beleuchtung mit UV-Licht inaktiv, wobei die inaktive Transkonfiguration durch reversible Isomerisierung in die aktive cis-Konfiguration umgewandelt wird. Cis-PSTs hemmen die Mikrotubulipolymerisation durch Bindung an die Colchicin-Bindungsstelle von β-Tubulin, blockieren seine Grenzfläche mit β-Tubulin und verhindern die für das Wachstum der Mikrotubuli erforderliche Dimerisierung10. Unter einer Kohorte von PSTs hat sich PST-1P als Bleiverbindung herauskristallisiert, da es die höchste Potenz hat, vollständig wasserlöslich ist und nach der Beleuchtung einen schnellen Beginn der Bioaktivität zeigt.
Die effektivste Trans- bis Cis-Isomerisierung von PSTs erfolgt bei Wellenlängen zwischen 360-420 nm, was zwei Optionen für die PST-Aktivierung ermöglicht. Eine 405-nm-Laserlinie auf einem typischen konfokalen Mikroskop kann für eine optimale räumliche Ausrichtung der Mikrotubuli-Wachstumshemmung verabreicht werden. Die Möglichkeit, den Ort und das Timing der PST-Aktivierung durch 405-nm-Laserbeleuchtung zu bestimmen, erleichtert eine präzise zeitliche und räumliche Kontrolle, die eine Störung der Mikrotubuli-Dynamik auf subzellulärer Ebene innerhalb von Subsekunden-Reaktionszeitenermöglicht 9. Alternativ ermöglicht ein erschwingliches LED-UV-Licht die Beleuchtung des gesamten Organismus, um eine organismusweite Störung der Mikrotubuli-Architektur zu induzieren. Dies kann eine kostengünstige Alternative für Forscher sein, für die der genau zeitlich abgestimmte Beginn der Hemmung und nicht das räumliche Targeting das Ziel ist. Ein weiteres Merkmal von PSTs ist ihre On-Demand-Inaktivierung durch Anlegen von grünem Licht einer Wellenlänge im Bereich von 510-540 nm9. Dies ermöglicht die Rückverfolgung von Mikrotubuli-Filamenten vor, während und nach der PST-vermittelten Wachstumshemmung.
PSTs, obwohl noch ein relativ neues Design, wurden in zahlreichen In-vitro-Anwendungen in verschiedenen Forschungsbereicheneingesetzt 11, einschließlich der Untersuchung neuer Mechanismen der Zellmigration in Amöboiden12, in Neuronen, die aus dem Gehirn der neugeborenen Mausisoliert wurden 13, und der Flügelepithelentwicklung in Drosophila melanogaster14 . Andere lichtreaktive Medikamente haben sich als wertvolle Werkzeuge zur gezielten Störung der Zellfunktion erwiesen. Zum Beispiel wurde ein Analogon von Blebbistatin, Azidoblebbistatin, zur verstärkten Myosinhemmung unter Beleuchtung15,16 verwendet. Dies unterstreicht das Potenzial für neue Entdeckungen aufgrund der Fähigkeit zur räumlich-zeitlich kontrollierten Hemmung der zellulären Funktion.
Lebende 3D-Organismen präsentieren hervorragende, aber empfindlichere Systeme, um die Dynamik von Mikrotubuli auf Ganztier-, Einzelzell- oder subzellulärer Ebene unter physiologischen Bedingungen zu manipulieren. Insbesondere der Präimplantationsmausembryo bietet einen außergewöhnlichen Einblick in das Innenleben der Zelle sowie in die interzellulären Beziehungen innerhalb eines Organismus17. Zeitlich und räumlich zielgerichtete aufeinanderfolgende Zyklen der Aktivierung und Deaktivierung von PSTs trugen zur Charakterisierung der Interphasenbrücke, einer postzytokinetischen Struktur zwischen Zellen, als nicht-zentrosomales Mikrotubuli-organisierendes Zentrum im Präimplantationsmausembryobei 16. Ein ähnlicher Versuchsaufbau zeigte die Beteiligung wachsender Mikrotubuli an der Versiegelung des Mausembryos, um die Blastozystenbildung zu ermöglichen18. Darüber hinaus wurden PSTs auch in ganzen Zebrafischembryonen verwendet, um die neuronale Zellmigration zu untersuchen, indem das Wachstum von Mikrotubuli in einer Untergruppe von Zellen im Hinterhirn gehemmtwurde 19.
Dieses Protokoll beschreibt den experimentellen Aufbau und die Verwendung von PST-1P im Präimplantations-Mausembryo. Die hier vorgestellten Anweisungen können auch die Anwendung von PSTs für eine breite Palette von Zielen wie die Untersuchung der Chromosomensegregation und Zellteilung, des Handels mit intrazellulärer Fracht sowie der Zellmorphogenese und -migration leiten. Darüber hinaus werden solche Studien die Implementierung von PSTs in Organoidsystemen, Blastoiden und anderen Embryomodellen wie Caenorhabditis elegans und Xenopus laevis unterstützen und möglicherweise die Verwendung von PSTs für In-vitro-Fertilisationstechnologien erweitern.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td>For mouth aspiration apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slides - LabTek</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NUN155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cRNA encoding for EB3-dTomato</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dishes - 35mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic growth hormone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Tubal Fluid (HTF) medium</td>
			<td>Cosmo-Bio</td>
			<td>CSR-R-B071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Image Analysis Software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil W 2010</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>For use with microscope immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED torch - Red light</td>
			<td>Celestron</td>
			<td>93588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice - wild-type FVB/N, males and females</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary Pipettes - Kimble</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z543306</td>
			<td>For mouth aspiration apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-4008-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage In vitro Transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium</td>
			<td>Cosmo-Bio</td>
			<td>CSR-R-B074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotrophin</td>
			<td>Prospec Bio</td>
			<td>HOR-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PST-1P</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>B511361-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Black Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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spatiotemporal subcellular manipulation of the microtubule cytoskeleton in the living preimplantation mouse embryo using photostatins

Das Mikrotubuli-Zytoskelett bildet das Gerüst einer Zelle und ist grundlegend für den intrazellulären Transport, die Zellteilung und die Signaltransduktion. Traditionelle pharmakologische Störungen des allgegenwärtigen Mikrotubuli-Netzwerks, die beispielsweise Nocodazol verwenden, können verheerende Folgen für jede Zelle haben. Reversibel photoschaltbare Mikrotubuli-Inhibitoren haben das Potenzial, die Einschränkungen zu überwinden, indem sie die Umsetzung von Arzneimittelwirkungen in einer räumlich-zeitlich kontrollierten Weise ermöglichen. Eine solche Familie von Medikamenten sind die Azobenol-basierten Photostatine (PSTs). Diese Verbindungen sind unter dunklen Bedingungen inaktiv und binden bei Beleuchtung mit UV-Licht an die Colchicin-Bindungsstelle des β-Tubulins und blockieren die Mikrotubulipolymerisation und den dynamischen Umsatz. Hier soll die Anwendung von PSTs im 3-dimensionalen (3D) lebenden Präimplantations-Mausembryo das Mikrotubuli-Netzwerk auf subzellulärer Ebene stören. Dieses Protokoll enthält Anweisungen für den Versuchsaufbau sowie Lichtaktivierungs- und Deaktivierungsparameter für PSTs mit konfokaler Lebendzellmikroskopie. Dies gewährleistet die Reproduzierbarkeit und ermöglicht es anderen, dieses Verfahren auf ihre Forschungsfragen anzuwenden. Innovative Fotoschalter wie PSTs können sich zu leistungsstarken Werkzeugen entwickeln, um das Verständnis des dynamischen intrazellulären Mikrotubuli-Netzwerks voranzutreiben und das Zytoskelett in Echtzeit nicht-invasiv zu manipulieren. Darüber hinaus können sich PSTs in anderen 3D-Strukturen wie Organoiden, Blastoiden oder Embryonen anderer Spezies als nützlich erweisen.

In Übereinstimmung mit dem Protokoll wurden Präimplantations-Mausembryonen mit cRNA für EB3 mikroinjiziert, die mit rot fluoreszierenden dTomato (EB3-dTomato) markiert wurde. Dies ermöglicht die Visualisierung wachsender Mikrotubuli, da EB3 an polymerisierende Mikrotubuli plus ends24 bindet.
Die Experimente wurden 3 Tage nach der Befruchtung (E3) durchgeführt, wenn der Mausembryo aus 16 Zellen besteht. Abhängig von der zu untersuchenden wissenschaftlichen Frageste...

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Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

Typische Mikrotubuli-Inhibitoren, die in der Grundlagen- und angewandten Forschung weit verbreitet sind, haben weitreichende Auswirkungen auf Zellen. In jüngster Zeit haben sich Photostatine zu einer Klasse von photoschaltbaren Mikrotubuli-Inhibitoren entwickelt, die in der Lage sind, mikrotubuli augenblicklich, reversibel, räumlich-zeitlich präzise zu manipulieren. Dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll beschreibt die Anwendung von Photostatinen in einem 3D-lebenden Präimplantations-Mausembryo.

Raumzeitliche subzelluläre Manipulation des Mikrotubuli-Zytoskeletts im lebenden Präimplantations-Mausembryo mittels Photostatinen

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. ...

Dieses Protokoll ist das erste seiner Art, das Photostatine auf den lebenden Präimplantationsmausembryo anwendet und die Verwendung von lichtschaltbaren Medikamenten auf anderen physiologischen 3D-Systemen berücksichtigt. Lichtschaltbare Photostatine ermöglichen die Manipulation des Mikrotubuli-Wachstums in Raum und Zeit und können wieder in einen Aus-Zustand umgewandelt werden. Unbeabsichtigtes Aussetzen von Photostatinen gegenüber blauem Licht vor dem Experiment kann sie vorzeitig aktivieren.Daher empfehlen wir, bei der Vorbereitung Ihrer Proben jederzeit in völliger Dunkelheit oder bei rotem Licht zu arbeiten. Unter strengen dunklen Bedingungen, bei denen nur rotes Licht zur Beleuchtung verwendet wird, beginnen Sie mit der Herstellung von Vorrats- und Zwischenarbeitslösung von PST-1P in Reinstwasser. Wie im Textmanuskript beschrieben.Verdünnen Sie dann PST-1P in frischem KSOM, um die Endkonzentration von 40 zu erreichen, M.To bereiten Sie den Kammerobjektträger für die Live-Bildgebung vor, fügen Sie 10 L PST-1P-behandeltes KSOM in die Mitte eines Brunnens hinzu, um ein halbkugelförmiges Tröpfchen zu bilden. Um zu verhindern, dass das Tröpfchen verdunstet, bedecken Sie es mit ausreichend Mineralöl. Wickeln Sie dann die vorbereitete Kulturschale lose in Folie oder legen Sie die Kulturschale in einen nicht luftdichten, undurchsichtigen Behälter im Inkubator, um sicherzustellen, dass keine Lichteinwirkung erfolgt.Stellen Sie nach dem Transfer der Embryonen in den PST-1P-behandelten KSOM-Tropfen sicher, dass die Embryonen in der Mitte des Tröpfchens gruppiert und auf dem Boden der Schale abgelegt werden. Sobald die Tauchobjektivlinse vorbereitet ist, montieren Sie den Kammerschieber auf dem Mikroskop in einer Umgebungskammer. Auf 37 ° C und 5% CO2 eingestellt und in völliger Dunkelheit, um sicherzustellen, dass sich alle PST-1Ps in der inaktiven Transkonfiguration befinden und dass Embryonen auf den Boden der Schale sinken können.Verwenden Sie eine Rotlichtlampe, um die Objektivlinse in Kontakt mit dem Tauchmedium zu positionieren. Suchen Sie dann den Rand des Tröpfchens des Mediums und positionieren Sie das Objektiv direkt darüber. Mit dem Live-Scanning-Modus und einem 561-nm-Laser lokalisieren Sie die Embryonen im Tröpfchen.Verwenden Sie Bühnencontroller und Live-Scanning-Modus, um die Start- und Endpunkte für die Aufnahme eines Z-Stacks des gesamten Embryos festzulegen. Passen Sie die Laserleistungseinstellungen bis zu maximal 5% entsprechend Ihrem Signal an. Und stellen Sie den digitalen Offset auf maximal 0,900 ein, entsprechend Ihrem Signal, um das Aussehen der EB3-dTomato-Kometen zu optimieren.Minimieren Sie Hintergrundgeräusche. Stellen Sie das Loch auf 2 m. Pixelauflösung bei 512 x 512.Und die Pixelverweilzeit liegt bei 3,15 s. Und stellen Sie den Zoom auf 2x ein. Erwerben Sie einen Z-Stapel des gesamten Embryos mit 1 m Abschnittsintervallen, um die Bereiche des Mikrotubuliwachstums im gesamten Organismus zu beurteilen.Öffnen Sie für EB3-dTomato-Kometenverfolgungsexperimente das 3D-Z-Stack-Bild und erhöhen Sie den Zoom auf das Dreifache. Und zeichnen Sie einen rechteckigen ROI um den spezifischen subzellulären Bereich von Interesse. Erfassen Sie dann den Zeitrafferfilm einer einzelnen Z-Ebene unter Verwendung der eingestellten Parameter mit einem Zeitintervall von 500 ms.Um PST-1P zu aktivieren, wechseln Sie zu einem 405-nm-Laser und erfassen Sie einen weiteren Zeitraffer, wobei der Laser auf 10% Leistung eingestellt ist, Lochblende maximal geöffnet ist, Pixelauflösung von 512 x 512, die Pixelverweilzeit von 3,15 s, Zoom von dreimal, in einem Zeitintervall von 500 ms, und stellen Sie 20 Bilder ein, die erfasst werden sollen. Wechseln Sie unmittelbar nach der Aktivierung zurück zum 561-nm-Laser und wiederholen Sie die Erfassung, wie zuvor gezeigt, um den Verlust von EB3-dTomato-Kometen nach der Aktivierung von PST-1P zu bestätigen. Um PST-1P nun wieder in seinen inaktiven Trans-Zustand zu versetzen, schalten Sie einen 514-nm-Laser ein und erfassen Sie einen weiteren Zeitraffer mit festgelegten Parametern.Um die Wiederherstellung von EB3-dTomato-Kometen zu visualisieren, wechseln Sie zurück zu einem 561-nm-Laser und wiederholen Sie die Erfassung. In unbehandelten Kontrollembryonen war das EB3-dTomato-Signal vor der Beleuchtung mit einem 405-nm-Laser im gesamten Zytoplasma der Zelle mit Ausnahme des Kernbereichs hoch. Nach der Beleuchtung wurden Veränderungen im Signal nicht erkannt.Dies deutet darauf hin, dass der 405-nm-Laser keine Photoschäden am Embryo oder die Mikrotubulidynamik verursacht hat. Während der PST-1P-Behandlung von Embryonen im 16-Zellstadium unter strengen dunklen Bedingungen wurde im 3D-Bild eine starke EB3-dTomato-Expression festgestellt, was zeigt, dass inaktives PST-1P keine Hemmung der Mikrotubulipolymerisation unter dunklen Bedingungen hervorruft. Vor der Aktivierung von PST-1P bestätigte die Zeitraffer-Bildgebung einer einzelnen Z-Ebene eine starke EB3-dTomato-Expression und Mikrotubuli-Polymerisation in einer subzellulären Region.Nach 405 nm Lichtaktivierung wurde innerhalb von Sekunden eine Verringerung des EB3-dTomato-Kometensignals festgestellt. Und die Wiederherstellung des Signals wurde bei der Deaktivierung von PST-1P mit einem 514-nm-Laser erreicht. Die Embryonen, die mit EB3-dTomato mikroinjiziert und mit PST-1P inkubiert wurden, zeigten ein normales embryonales Potenzial und entwickelten sich bis zum Blastozystenstadium.Und normale Mikrotubuli-Dynamik während der Mitose. Anzeige der Nichttoxizität eines aktiven PST-1P für den Embryo. In den erworbenen Zeitrafferfilmen erschien die EB3-dTomato-Etikettierung als kometenartige Strukturen und ermöglichte die Verfolgung wachsender Mikrotubuli-Filamente.In PST-1P-behandelten Embryonen, die unter dunklen Bedingungen gehalten wurden, gingen einzelne EB3-dTomato-Kometen von der Interphasenbrücke aus, die im frühen Mausembryo als nicht-zentrosomales Mikrotubuli-Organisationszentrum fungiert. Ein T-Stack zeigt EB3-dTomato-Kometen im Bereich der Interphasenbrücke. Nach der Aktivierung von PST-1P wurden EB3-dTomato-Kometen an der Basis der Interphasenbrücke und im t-Stack reduziert.Denken Sie daran, dass weißes Licht PST-1P vorzeitig aktivieren kann. Verwenden Sie also nur rote Lichtquellen für die Sichtbarkeit. Grünes Licht deaktiviert auch PST-1P, also vermeiden Sie bitte die Verwendung von grün fluoreszierenden Etikettenmarkierungen.Diese Technik wurde in Drosophila, Amöben, Mäusen und mehreren In-vitro-Systemen eingesetzt, um das Wachstum von Mikrotubuli zu bekämpfen, um die Zellmigration und die Gewebebildung zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Mess Protein Stabilität in Wohnzebrafischembryonen unter Einsatz von Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em&gt; In Vivo</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead Implantation im Zebrafischembryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifizierung von Erythromyeloid Progenitoren und deren Nachkommen in der Maus Embryo Durch Durchflusszytometrie

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Ableitung von Stammzelllinien aus Präimplantations Mausembryonen

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

Wirksamkeit der Luft Stripping in zwei Lachsfische Fisch Regenbogenforelle (Oncorhynchus Mykiss) und Bachforelle (Salmo Trutta Morpha Fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimal invasiven Embryotransfer und Embryo-Vitrifizierung auf der Optimal-Botn-Bühne im Kaninchenmodell

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In Vitro Rekonstitution von räumlichen Zellkontaktmustern mit isolierten Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeren und Klebstoff Polystyrol Perlen

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...