Name: spatiotemporal subcellular manipulation of the microtubule cytoskeleton in the living preimplantation mouse embryo using photostatins
Uploaded: 2021-11-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Oliver Thorn-Seshold e Li Gao por nos fornecerem fotostatinas e conselhos sobre preparação de manuscritos, Monash Production para suporte de filmagem e Monash Micro Imaging para suporte a microscopia.
Este trabalho foi apoiado pelo projeto do National Health and Medical Research Council (NHMRC) para a J.Z. e o Instituto Canadense de Pesquisa Avançada (CIFAR) Azrieli Scholarship para J.Z. O Instituto Australiano de Medicina Regenerativa é apoiado por subsídios do Governo do Estado de Victoria e do Governo Australiano.

Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal de Monash sob o número de ética animal 19143. Os animais foram alojados em condições específicas de casária animal sem patógenos na instalação animal (Monash Animal Research Platform) em estrita conformidade com as diretrizes éticas.
1. Coleção de embriões de camundongos pré-implantação
<ol><li>Camundongos superovulados e acasalados, conforme descrito anteriormente16,18...

<ol>
	<li>Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-dependent+subcellular+organisation+of+pluripotent+cells.">Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells.</a> Development. 148 (20), (2021).</li><li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-organizing+centers:+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites.">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).</li><li>Galli, M., Morgan, D. 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P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nocodazole-induced+changes+in+microtubule+dynamics+impair+the+morphology+and+directionality+of+migrating+medial+ganglionic+eminence+cells.">Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells.</a> Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).</li><li>Munz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+lose+their+functional+properties+after+paclitaxel+treatment.">Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).</li><li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs.">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li><li>Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. 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N., Ye, Y., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+mouse+oocytes.">Isolation and in vitro culture of mouse oocytes.</a> Bio-protocol. 11 (15), 4104 (2021).</li><li>Subramanian, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocytes+mount+a+noncanonical+DNA+damage+response+involving+APC-Cdh1-mediated+proteolysis.">Oocytes mount a noncanonical DNA damage response involving APC-Cdh1-mediated proteolysis.</a> Journal of Cell Biology. 219 (4), 201907213 (2020).</li><li>Mihajlovic, A. I., Bruce, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+cell-fate+decision+of+mouse+preimplantation+embryo+development:+integrating+cell+position+and+polarity.">The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity.</a> Open Biology. 7 (11), 170210 (2017).</li><li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+speed+of+GTP+hydrolysis+determines+GTP+cap+size+and+controls+microtubule+stability.">The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability.</a> Elife. 9, 51992 (2020).</li><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+photocontrol+of+microtubule+dynamics+and+integrity,+migration+and+mitosis,+by+the+potent+GFP-imaging-compatible+photoswitchable+reagents+SBTubA4P+and+SBTub2M.">In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M.</a> BioRxiv. bioRxiv. , (2021).</li><li>Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+strategy+and+vector+library+for+the+rapid+generation+of+modular+light-controlled+protein-protein+interactions.">Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).</li><li>van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+microtubule+dynamics.">Optogenetic control of microtubule dynamics.</a> Methods in Molecular Biology. 2101, 211-234 (2020).</li><li>Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+microtubule+dynamics+using+an+optogenetic+microtubule+plus+end-F-actin+cross-linker.">Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).</li><li>Kogler, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+rapid+and+reversible+optogenetic+perturbation+of+nuclear+proteins+in+living+embryos.">Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos.</a> Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).</li><li>Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+microtubule+cytoskeleton:+setting+up+and+working+with+an+ablation+system.">Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system.</a> Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).</li><li>Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+combretastatins+as+potent+tubulin+polymerization+inhibitors.">Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors.</a> Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).</li><li>Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promising+applications+of+tumor+spheroids+and+organoids+for+personalized+medicine.">Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine.</a> Cancers (Basel). 12 (10), 2727 (2020).</li><li>Scherer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+and+uptake+of+the+anticancer+drug+combretastatin+in+cell+spheroids+and+photoisomerization+in+gels+with+multiphoton+excitation.">Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003 (2015).</li></ol>

A rede de microtúbulos é parte integrante do funcionamento interno fundamental de uma célula. Consequentemente, isso apresenta desafios na manipulação da dinâmica dos microtúbulos em organismos vivos, pois qualquer perturbação à rede tende a ter consequências generalizadas para todos os aspectos da função celular. O surgimento de compostos de microtúbulos fototravavel apresenta uma maneira de manipular precisamente o citoesqueleto em um nível subcelular, com controle superior para a indução e reversão d...

A arquitetura de microtúbulos varia amplamente entre diferentes tipos de células para suportar diversas funções 1,2. Sua natureza dinâmica de crescimento e encolhimento permite uma rápida adaptação a pistas extra e intracelulares e responder às necessidades em constante mudança de uma célula. Assim, pode ser considerada como a "impressão digital morfológica" desempenhando um papel fundamental na identidade celular.
O direcionamento farmacológico do citoesqueleto microtúbulo usando inibidores de pequenas moléculas levou a uma infinidade de descobertas fundamentais na biologia do desenvolvimento, biologia de células-tronco, biologia do câncer e neurobiologia 3,4,5,6,7. Essa abordagem, embora indispensável, apresenta várias limitações, como toxicidade e efeitos fora do alvo. Por exemplo, um dos agentes de microtúbula mais utilizados, nocodazole, é uma poderosa droga despolimerizadora de microtúbulos8. No entanto, inibidores de pequenas moléculas como o nocodazol são ativos desde o momento da aplicação e, dada a natureza essencial do citoesqueleto microtúbulo para muitas funções celulares críticas, a despolimerização global de microtúbulos pode produzir efeitos fora do alvo, que podem ser inadequados para muitas aplicações. Além disso, o tratamento do nocodazol é irreversível, a menos que as amostras sejam lavadas livre da droga, prevenindo imagens vivas contínuas e, portanto, o rastreamento preciso de filamentos microtúbulos individuais.
O desenvolvimento de compostos ativados pela luz começou com a criação de moléculas fotouncaged e anunciou uma nova era na segmentação e monitoramento dos efeitos da inibição do crescimento de microtúbulos de forma precisa e espacialmente controlada. Uma família de drogas reversivelmente fotowitchable, fotostatinas (PSTs), foram desenvolvidas substituindo o componente de stilbene da combretastatina A-4 por azobenzeno9. Os PSTs estão inativos até a iluminação com luz UV, pela qual a configuração trans inativa se converte na configuração cis ativa por isomerização reversível. Os Cis-PSTs inibem a polimerização de microtúbulos ligando-se ao local de ligação colchicina de β-tubulina, bloqueando sua interface com β-tubulina e prevenindo a dimerização necessária para o crescimento de microtúbulos10. Entre uma coorte de PSTs, pst-1P emergiu como um composto de chumbo, pois tem a maior potência, é totalmente solúvel em água, e mostra um rápido início de bioatividade após a iluminação.
A trans-isomerização mais eficaz de PSTs ocorre em comprimentos de onda entre 360-420 nm, o que permite duas opções para ativação de PST. Uma linha laser de 405 nm em um microscópio confocal típico pode ser administrada para o direcionamento espacial ideal da inibição do crescimento de microtúbulos. A capacidade de identificar a localização e o tempo da ativação do PST através da iluminação laser de 405 nm facilita o controle temporal e espacial preciso, permitindo a interrupção da dinâmica dos microtúbulos em um nível subcelular, dentro do vezes de resposta sub-segundo9. Alternativamente, uma luz LED UV acessível permite que a iluminação do organismo inteiro induza a interrupção em todo o organismo da arquitetura do microtúbulo. Esta pode ser uma alternativa econômica para pesquisadores para os quais o início precisamente cronometrado da inibição, em vez de direcionamento espacial, é o objetivo. Outra característica dos PSTs é sua inativação sob demanda, aplicando luz verde de um comprimento de onda na faixa de 510-540 nm9. Isso permite o rastreamento de filamentos microtúbulos antes, durante e depois da inibição de crescimento mediada pelo PST.
Os PSTs, embora ainda um projeto relativamente recente, têm sido usados em inúmeras aplicações in vitro em diversos campos de pesquisa11, incluindo a investigação de novos mecanismos de migração celular em ameebóides12, em neurônios isolados do cérebro do camundongo recém-nascido13, e desenvolvimento de epitélio de asa em Drosophila melanogaster14 . Outras drogas leves reativas provaram ser ferramentas valiosas na interrupção direcionada da função celular. Por exemplo, um análogo de blebbistatina, azidoblebbistatin, foi usado para a inibição aprimorada da mosina sob iluminação15,16. Isso destaca o potencial para novas descobertas devido à capacidade de inibição espacialmente controlada da função celular.
Organismos 3D vivos apresentam sistemas soberbos e ainda mais delicados para manipular a dinâmica dos microtúbulos em um nível animal inteiro, unicelular ou subcelular em condições fisiológicas. Em particular, o embrião do rato de pré-implantação oferece uma visão excepcional do funcionamento interno da célula, bem como das relações intercelulares dentro de um organismo17. Ciclos consecutivos de ativação e desativação de PSTs contribuíram para a caracterização da ponte interfase, uma estrutura pós-citocinética entre as células, como um centro-organizador de microtúbulos não centrosômicos no embrião de camundongos pré-implantação16. Uma configuração experimental semelhante demonstrou o envolvimento de microtúbulos crescentes na vedação do embrião do rato para permitir a formação de blastocisto18. Além disso, os PSTs também foram usados em embriões inteiros de zebrafish para investigar a migração de células neuronais inibindo o crescimento de microtúbulos em um subconjunto de células no cérebro traseiro19.
Este protocolo descreve a configuração experimental e o uso de PST-1P no embrião do rato de pré-implantação. As instruções aqui apresentadas também podem orientar a aplicação de PSTs para uma ampla gama de objetivos, como o estudo da segregação de cromossomo e divisão celular, tráfico de carga intracelular e morfogênese celular e migração. Além disso, tais estudos auxiliarão a implementação de PSTs em sistemas organoides, blastóides e outros modelos de embriões, como Caenorhabditis elegans e Xenopus laevis, bem como potencialmente expandirão o uso de PSTs para tecnologias de fertilização in vitro .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td>For mouth aspiration apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slides - LabTek</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NUN155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cRNA encoding for EB3-dTomato</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dishes - 35mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic growth hormone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Tubal Fluid (HTF) medium</td>
			<td>Cosmo-Bio</td>
			<td>CSR-R-B071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Image Analysis Software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil W 2010</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>For use with microscope immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED torch - Red light</td>
			<td>Celestron</td>
			<td>93588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice - wild-type FVB/N, males and females</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary Pipettes - Kimble</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z543306</td>
			<td>For mouth aspiration apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-4008-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage In vitro Transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium</td>
			<td>Cosmo-Bio</td>
			<td>CSR-R-B074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotrophin</td>
			<td>Prospec Bio</td>
			<td>HOR-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PST-1P</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>B511361-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Black Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporal subcellular manipulation of the microtubule cytoskeleton in the living preimplantation mouse embryo using photostatins

O citoesqueleto microtúbulo forma a estrutura de uma célula e é fundamental para o transporte intracelular, divisão celular e transdução de sinais. A ruptura farmacológica tradicional da onipresente rede de microtúbulos usando, por exemplo, nocodazol pode ter consequências devastadoras para qualquer célula. Inibidores de microtúbulos reversivelmente fotossceráveis têm o potencial de superar as limitações, permitindo que os efeitos medicamentosos sejam implementados de forma espacialmente controlada. Uma dessas famílias de drogas é a fotostatina baseada em azobenzeno (PSTs). Esses compostos são inativos em condições escuras, e após a iluminação com luz UV, eles se ligam ao local de ligação colchicina de β-tubulina e bloqueiam a polimerização de microtúbulos e a rotatividade dinâmica. Aqui, a aplicação de PSTs no embrião de rato de pré-implantação ao vivo 3D (3D) é definida para interromper a rede de microtúbulos em um nível subcelular. Este protocolo fornece instruções para a configuração experimental, bem como parâmetros de ativação e desativação de luz para PSTs usando microscopia confocal de células vivas. Isso garante a reprodutibilidade e permite que outras pessoas apliquem esse procedimento às suas questões de pesquisa. Fotossensíveis inovadores como os PSTs podem evoluir como ferramentas poderosas para avançar na compreensão da rede dinâmica de microtúbulos intracelulares e manipular não invasivamente o citoesqueleto em tempo real. Além disso, os PSTs podem ser úteis em outras estruturas 3D, como organoides, blastóides ou embriões de outras espécies.

De acordo com o protocolo, os embriões de camundongos pré-implantação foram microinjetados com cRNA para EB3, marcado com dTomato fluorescente vermelho (EB3-dTomato). Isso permite a visualização de microtúbulos em crescimento à medida que o EB3 se liga ao microtúbulo polimerizador mais termina24.
Os experimentos foram realizados 3 dias após a fertilização (E3) quando o embrião do camundongo é composto por 16 células. Qualquer outro estágio de desenvolvim...

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Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

Inibidores típicos de microtúbulos, amplamente utilizados em pesquisas básicas e aplicadas, têm efeitos de longo alcance nas células. Recentemente, as fotostatinas surgiram como uma classe de inibidores de microtúbulos fotossentaráveis, capazes de manipulação instantânea, reversível e espacialmente precisa de microtúbulos. Este protocolo passo a passo detalha a aplicação de fotostatinas em um embrião de rato de pré-implantação 3D vivo.

Manipulação subcelular espiostemporal do Citoesqueleto microtubulo no embrião do rato de pré-implantação vivo usando Fotostatinas

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. ...

Este protocolo é o primeiro de seu tipo a aplicar fotostatinas no embrião de camundongos pré-implantação vivo, e considerar usos para usar drogas comutação leve em outros sistemas fisiológicos 3D. Fotostatinas comutação de luz permitem a manipulação do crescimento de microtúbulos, no espaço e no tempo, e são convertidas de volta para um estado fora. Expor involuntariamente fotostatinas à luz azul, antes do experimento, pode ativá-las prematuramente.Por isso, aconselhamos trabalhar em completa escuridão, ou condições de luz vermelha, o tempo todo ao preparar suas amostras. Em condições escuras estritas, utilizando apenas luz vermelha para iluminação, comece a fazer estoque e solução de trabalho intermediária de PST-1P em água ultrapura. Como descrito no manuscrito do texto.Em seguida, diluir PST-1P em KSOM fresco para alcançar a concentração final de 40 M.To preparar o slide de câmara para imagens ao vivo, adicionar 10 L de KSOM tratado PST-1P no centro de um poço, para formar uma gotícula hemisférica. Para evitar que a gotícula evapore, cubra-a com óleo mineral suficiente. Em seguida, enrole livremente o prato de cultura preparado em papel alumínio, ou coloque o prato de cultura em um recipiente opaco não hermético na incubadora para garantir que não haja exposição à luz.Depois de transferir os embriões para a queda de KSOM tratada pelo PST-1P, certifique-se de que os embriões estão agrupados no centro da gotícula e acomodados no fundo do prato. Uma vez que a lente objetiva de imersão é preparada, monte o deslizamento da câmara no microscópio, dentro de uma câmara ambiental. Definido em 37 C e 5% de CO2, e em completa escuridão, para garantir que todos os PST-1Ps estejam na configuração transaativa inativa, e que os embriões possam afundar até o fundo do prato.Use uma tocha de luz vermelha para posicionar a lente objetiva em contato com o meio de imersão. Em seguida, localize a borda da gota do meio e posicione o objetivo diretamente sobre ele. Usando o modo de varredura ao vivo, e um laser de 561 nm, localize os embriões dentro da gotícula.Use controladores de palco e modo de digitalização ao vivo para definir os pontos de partida e fim para adquirir uma pilha z de todo o embrião. Ajuste as configurações de alimentação a laser até um máximo de 5% de acordo com o seu sinal. E defina deslocamento digital para um máximo de 0,900, de acordo com o seu sinal, para otimizar a aparência dos cometas EB3-dTomato.Minimize o ruído de fundo. Coloque o orifício em 2 m. Resolução do pixel em 512 por 512.E o tempo de pixels em 3.15 s. E defina o zoom em 2x. Adquira uma pilha z de todo o embrião com intervalos de seção de 1 m para avaliar as áreas de crescimento de microtúbulos em todo o organismo.Para experimentos de rastreamento de cometas EB3-dTomato, abra a imagem 3D z-stack, aumente o zoom para três vezes. E desenhe um ROI retangular em torno da área subcelular específica de interesse. Em seguida, adquira o filme de lapso de tempo de um único z-plane, usando os parâmetros definidos, com o intervalo de tempo de 500 ms.Para ativar o PST-1P, mude para um laser de 405 nm e adquira outro lapso de tempo, com o conjunto laser a 10% de potência, o pinhole aberto no máximo, resolução de pixels de 512 por 512, o tempo de 3,15 s, zoom de três vezes, em um intervalo de tempo de 500 ms, e definir 20 quadros a serem adquiridos. Imediatamente após a ativação, mude de volta para laser de 561 nm, e repita a aquisição, como demonstrado anteriormente, para confirmar a perda de cometas EB3-dTomato após a ativação do PST-1P. Agora, para reverter o PST-1P de volta ao seu trans-estado inativos, engaje um laser de 514 nm e adquira outro lapso de tempo com parâmetros definidos.Para visualizar a recuperação dos cometas EB3-dTomato, mude de volta para laser de 561 nm e repita a aquisição. Em embriões de controle não tratados, antes da iluminação com um laser de 405 nm, o sinal EB3-dTomato era alto dentro de todo o citoplasma da célula, exceto a área nuclear. Após a iluminação, não foram detectadas alterações no sinal.Indicando que o laser de 405 nm não causou danos fotográficos à dinâmica do embrião ou microtúbulo. Durante o tratamento PST-1P de embriões em estágio de 16 células, sob estritas condições escuras, foi detectada forte expressão EB3-dTomato na imagem 3D, demonstrando que o PST-1P inativo não provocou inibição da polimerização de microtúbulos em condições escuras. Antes da ativação do PST-1P, a imagem de lapso de tempo de um único z-plane confirmou forte expressão EB3-dTomato e polimerização microtúbula em uma região subcelular.Após a ativação da luz de 405 nm, em segundos, foi detectada uma redução no sinal do cometa EB3-dTomato. E a recuperação do sinal foi alcançada após a desativação do PST-1P, usando um laser de 514 nm. Os embriões micro injetados com EB3-dTomato, e incubados com PST-1P, mostraram potencial embrionário normal, desenvolvendo-se para o estágio blastocisto.E dinâmica normal de microtúbulos durante a mitose. Indicando a não toxicidade de um PST-1P ativo para o embrião. Nos filmes adquiridos de lapso de tempo, a rotulagem EB3-dTomato apareceu como estruturas semelhantes a cometas, e permitiu o rastreamento de filamentos microtúbulos crescentes.Em embriões tratados PST-1P, mantidos em condições escuras, cometas individuais EB3-dTomato emanados da ponte interfase, que funciona como um centro organizador de microtúbulos não-centrosoômicos no embrião inicial do rato. Uma pilha de t mostra cometas EB3-dTomato na região da ponte interfase. Após a ativação do PST-1P, os cometas EB3-dTomato foram reduzidos na base da ponte interfásica e na pilha t.Lembre-se que a luz branca pode ativar PST-1P prematuramente. Então use apenas fontes de luz vermelha para visibilidade. A luz verde também desativa PST-1P, por isso evite usar marcadores de rótulo fluorescentes verdes.Esta técnica tem sido usada em drosophila, ameba, camundongos e múltiplos sistemas in vitro, para direcionar o crescimento de microtúbulos a fim de estudar a migração celular e a formação de tecidos.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Medir a estabilidade da proteína em Viver embriões Zebrafish Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Biologia do Desenvolvimento

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Os ensaios

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivação das linhas de células-tronco de embriões pré-implantação do rato

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

Eficácia do ar despojamento em dois peixes salmonídeos, truta arco-íris (Oncorhynchus Mykiss) e truta (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Transferência de embriões minimamente invasivos e vitrificação embrionária na fase de embrião ideal em modelo de coelho

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In Vitro Reconstituição de Padrões de Contato celular espacial com caenorhabditis isolado elegans embrião blastômeros e contas adesivas de poliestireno

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...