Name: spatiotemporal subcellular manipulation of the microtubule cytoskeleton in the living preimplantation mouse embryo using photostatins
Uploaded: 2021-11-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins at JoVE.com

Los autores desean agradecer al Dr. Oliver Thorn-Seshold y Li Gao por proporcionarnos fotostatinas y consejos sobre la preparación de manuscritos, Monash Production por el apoyo a la filmación y Monash Micro Imaging por el apoyo a la microscopía.
Este trabajo fue apoyado por la subvención del proyecto APP2002507 del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC) a J.Z. y la Beca Azrieli del Instituto Canadiense de Investigación Avanzada (CIFAR) a J.Z. El Instituto Australiano de Medicina Regenerativa cuenta con el apoyo de subvenciones del Gobierno del Estado de Victoria y el Gobierno de Australia.

Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de Monash bajo el número de ética animal 19143. Los animales fueron alojados en condiciones específicas de hogar de animales libres de patógenos en la instalación de animales (Monash Animal Research Platform) en estricta conformidad con las pautas éticas.
1. Colección de embriones de ratón preimplantacionales
<ol><li>Ratones superovulados y de pareja descritos anteriormente16,18...

<ol>
	<li>Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-dependent+subcellular+organisation+of+pluripotent+cells.">Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells.</a> Development. 148 (20), (2021).</li><li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-organizing+centers:+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites.">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).</li><li>Galli, M., Morgan, D. 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A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs.">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li><li>Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+cell-fate+decision+of+mouse+preimplantation+embryo+development:+integrating+cell+position+and+polarity.">The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity.</a> Open Biology. 7 (11), 170210 (2017).</li><li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+speed+of+GTP+hydrolysis+determines+GTP+cap+size+and+controls+microtubule+stability.">The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability.</a> Elife. 9, 51992 (2020).</li><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+photocontrol+of+microtubule+dynamics+and+integrity,+migration+and+mitosis,+by+the+potent+GFP-imaging-compatible+photoswitchable+reagents+SBTubA4P+and+SBTub2M.">In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M.</a> BioRxiv. bioRxiv. , (2021).</li><li>Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+strategy+and+vector+library+for+the+rapid+generation+of+modular+light-controlled+protein-protein+interactions.">Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).</li><li>van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+microtubule+dynamics.">Optogenetic control of microtubule dynamics.</a> Methods in Molecular Biology. 2101, 211-234 (2020).</li><li>Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+microtubule+dynamics+using+an+optogenetic+microtubule+plus+end-F-actin+cross-linker.">Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).</li><li>Kogler, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+rapid+and+reversible+optogenetic+perturbation+of+nuclear+proteins+in+living+embryos.">Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos.</a> Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).</li><li>Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+microtubule+cytoskeleton:+setting+up+and+working+with+an+ablation+system.">Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system.</a> Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).</li><li>Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+combretastatins+as+potent+tubulin+polymerization+inhibitors.">Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors.</a> Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).</li><li>Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promising+applications+of+tumor+spheroids+and+organoids+for+personalized+medicine.">Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine.</a> Cancers (Basel). 12 (10), 2727 (2020).</li><li>Scherer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+and+uptake+of+the+anticancer+drug+combretastatin+in+cell+spheroids+and+photoisomerization+in+gels+with+multiphoton+excitation.">Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003 (2015).</li></ol>

La red de microtúbulos es parte integral del funcionamiento interno fundamental de una célula. En consecuencia, esto presenta desafíos en la manipulación de la dinámica de los microtúbulos en los organismos vivos, ya que cualquier perturbación en la red tiende a tener consecuencias generalizadas para todos los aspectos de la función celular. La aparición de compuestos fotoconmutables dirigidos a microtúbulos presenta una forma de manipular con precisión el citoesqueleto a nivel subcelular, con un control super...

La arquitectura de los microtúbulos varía ampliamente entre los diferentes tipos de células para admitir diversas funciones 1,2. Su naturaleza dinámica de crecimiento y contracción permite una rápida adaptación a las señales extra e intracelulares y responder a las necesidades siempre cambiantes de una célula. Por lo tanto, se puede considerar como la "huella morfológica" que juega un papel clave en la identidad celular.
La orientación farmacológica del citoesqueleto de microtúbulos utilizando inhibidores de moléculas pequeñas ha llevado a una gran cantidad de descubrimientos fundamentales en biología del desarrollo, biología de células madre, biología del cáncer y neurobiología 3,4,5,6,7. Este enfoque, si bien es indispensable, presenta varias limitaciones, como la toxicidad y los efectos fuera del objetivo. Por ejemplo, uno de los agentes dirigidos a los microtúbulos más utilizados, el nocodazol, es un potente fármaco despolimerizante de microtúbulos8. Sin embargo, los inhibidores de moléculas pequeñas como el nocodazol están activos desde el momento de la aplicación y, dada la naturaleza esencial del citoesqueleto de microtúbulos para muchas funciones celulares críticas, la despolimerización global de microtúbulos puede producir efectos fuera del objetivo, que pueden ser inadecuados para muchas aplicaciones. Además, el tratamiento con nocodazol es irreversible a menos que las muestras se laven libres del medicamento, lo que impide la obtención continua de imágenes en vivo y, por lo tanto, el seguimiento preciso de los filamentos de microtúbulos individuales.
El desarrollo de compuestos activados por la luz comenzó con la creación de moléculas fotouncatadas y ha anunciado una nueva era en la orientación y el monitoreo de los efectos de la inhibición del crecimiento de microtúbulos de una manera precisa y controlada espaciotemporalmente. Una familia de fármacos fotoconmutables reversiblemente, las fotostatinas (PST), se desarrollaron reemplazando el componente de estilbeno de la combretastatina A-4 con azobenceno9. Los PST están inactivos hasta la iluminación con luz UV, por lo que la transconfiguración inactiva se convierte en la configuración cis activa por isomerización reversible. Los Cis-PST inhiben la polimerización de microtúbulos al unirse al sitio de unión de colchicina de β-tubulina, bloqueando su interfaz con β-tubulina y previniendo la dimerización requerida para el crecimiento de microtúbulos10. Entre una cohorte de PST, PST-1P ha surgido como un compuesto de plomo, ya que tiene la mayor potencia, es totalmente soluble en agua y muestra un rápido inicio de bioactividad después de la iluminación.
La isomerización trans-a cis más efectiva de los PST ocurre en longitudes de onda entre 360-420 nm, lo que permite opciones duales para la activación de PST. Se puede administrar una línea láser de 405 nm en un microscopio confocal típico para una orientación espacial óptima de la inhibición del crecimiento de microtúbulos. La capacidad de identificar la ubicación y el momento de la activación de PST a través de la iluminación láser de 405 nm facilita el control temporal y espacial preciso, lo que permite la interrupción de la dinámica de los microtúbulos a nivel subcelular, dentro de los tiempos de respuesta de menos de un segundo9. Alternativamente, una luz UV LED asequible permite que la iluminación de todo el organismo induzca la interrupción de la arquitectura de los microtúbulos en todo el organismo. Esta puede ser una alternativa rentable para los investigadores para quienes el inicio de la inhibición en el momento preciso, en lugar de la orientación espacial, es el objetivo. Otra característica de los PST es su inactivación bajo demanda mediante la aplicación de luz verde de una longitud de onda en el rango de 510-540 nm9. Esto permite el rastreo de filamentos de microtúbulos antes, durante y después de la inhibición del crecimiento mediada por PST.
Los PST, aunque todavía son un diseño relativamente reciente, se han utilizado en numerosas aplicaciones in vitro en diversos campos de investigación11, incluida la investigación de nuevos mecanismos de migración celular en ameboides12, en neuronas aisladas del cerebro del ratón recién nacido13 y el desarrollo del epitelio del ala en Drosophila melanogaster14 . Otros medicamentos reactivos a la luz han demostrado ser herramientas valiosas en la interrupción dirigida de la función celular. Por ejemplo, se utilizó un análogo de blebbistatina, azidoblebbistatina, para mejorar la inhibición de la miosina bajo iluminación15,16. Esto destaca el potencial de nuevos descubrimientos debido a la capacidad de inhibición espaciotemporánea controlada de la función celular.
Los organismos 3D vivos presentan sistemas excelentes pero más delicados para manipular la dinámica de los microtúbulos a nivel de todo el animal, una sola célula o subcelular en condiciones fisiológicas. En particular, el embrión de ratón preimplantacional ofrece una visión excepcional del funcionamiento interno de la célula, así como de las relaciones intercelulares dentro de un organismo17. Los ciclos consecutivos de activación y desactivación de PST dirigidos temporal y espacialmente contribuyeron a la caracterización del puente interfase, una estructura postcitocinética entre células, como un centro organizador de microtúbulos no centrosómicos en el embrión de ratón preimplantacional16. Una configuración experimental similar demostró la participación de los microtúbulos en crecimiento en el sellado del embrión de ratón para permitir la formación de blastocistos18. Además, los PST también se utilizaron en embriones enteros de pez cebra para investigar la migración de células neuronales mediante la inhibición del crecimiento de microtúbulos en un subconjunto de células en el cerebro posterior19.
Este protocolo describe la configuración experimental y el uso de PST-1P en el embrión de ratón preimplantacional. Las instrucciones presentadas aquí también pueden guiar la aplicación de los PST para una amplia gama de objetivos, como el estudio de la segregación cromosómica y la división celular, el tráfico de carga intracelular y la morfogénesis y migración celular. Además, dichos estudios ayudarán a la implementación de PST en sistemas organoides, blastoides y otros modelos embrionarios como Caenorhabditis elegans y Xenopus laevis, así como potencialmente ampliarán el uso de PST para tecnologías de fertilización in vitro .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td>For mouth aspiration apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slides - LabTek</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NUN155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cRNA encoding for EB3-dTomato</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dishes - 35mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic growth hormone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Tubal Fluid (HTF) medium</td>
			<td>Cosmo-Bio</td>
			<td>CSR-R-B071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Image Analysis Software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil W 2010</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>For use with microscope immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED torch - Red light</td>
			<td>Celestron</td>
			<td>93588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice - wild-type FVB/N, males and females</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary Pipettes - Kimble</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z543306</td>
			<td>For mouth aspiration apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-4008-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage In vitro Transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium</td>
			<td>Cosmo-Bio</td>
			<td>CSR-R-B074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotrophin</td>
			<td>Prospec Bio</td>
			<td>HOR-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PST-1P</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>B511361-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Black Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporal subcellular manipulation of the microtubule cytoskeleton in the living preimplantation mouse embryo using photostatins

El citoesqueleto de microtúbulos forma el marco de una célula y es fundamental para el transporte intracelular, la división celular y la transducción de señales. La interrupción farmacológica tradicional de la red de microtúbulos ubicuos utilizando, por ejemplo, nocodazol puede tener consecuencias devastadoras para cualquier célula. Los inhibidores de microtúbulos fotoconmutables reversiblemente tienen el potencial de superar las limitaciones al permitir que los efectos de los medicamentos se implementen de una manera controlada espaciotemporalmente. Una de esas familias de medicamentos son las fotostatinas a base de azobenceno (PST). Estos compuestos son inactivos en condiciones de oscuridad, y al iluminarse con luz UV, se unen al sitio de unión a la colchicina de β-tubulina y bloquean la polimerización del microtúbulo y la rotación dinámica. Aquí, la aplicación de PST en el embrión de ratón preimplantacional vivo de 3 dimensiones (3D) se establece para interrumpir la red de microtúbulos a nivel subcelular. Este protocolo proporciona instrucciones para la configuración experimental, así como parámetros de activación y desactivación de la luz para PST que utilizan microscopía confocal de células vivas. Esto asegura la reproducibilidad y permite a otros aplicar este procedimiento a sus preguntas de investigación. Los fotointerruptores innovadores como los PST pueden evolucionar como herramientas poderosas para avanzar en la comprensión de la red dinámica de microtúbulos intracelulares y para manipular de forma no invasiva el citoesqueleto en tiempo real. Además, los PST pueden resultar útiles en otras estructuras 3D como organoides, blastoides o embriones de otras especies.

De acuerdo con el protocolo, los embriones de ratón preimplantacionales fueron microinyectados con ARNc para EB3, marcados con dTomato fluorescente rojo (EB3-dTomato). Esto permite la visualización de microtúbulos en crecimiento a medida que EB3 se une a los microtúbulos polimerizantes más los extremos24.
Los experimentos se realizaron 3 días después de la fertilización (E3) cuando el embrión de ratón está compuesto por 16 células. Se puede utilizar cualquie...

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Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

Los inhibidores típicos de los microtúbulos, utilizados ampliamente en la investigación básica y aplicada, tienen efectos de gran alcance en las células. Recientemente, las fotostatinas surgieron como una clase de inhibidores de microtúbulos fotoconmutables, capaces de manipular instantáneamente, reversible y espaciotemporalmente precisa de microtúbulos. Este protocolo paso a paso detalla la aplicación de fotostatinas en un embrión de ratón preimplantacional vivo en 3D.

Manipulación subcelular espaciotemporal del citoesqueleto de microtúbulos en el embrión de ratón vivo preimplantacional utilizando fotostatinas

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. ...

Este protocolo es el primero de su tipo en aplicar fotostatinas en el embrión de ratón vivo preimplantacional, y considera que utiliza el uso de medicamentos conmutables por luz en otros sistemas fisiológicos 3D. Las fotostatinas conmutables por luz permiten la manipulación del crecimiento de microtúbulos, en el espacio y el tiempo, y se convierten de nuevo a un estado apagado. Exponer involuntariamente las fotostatinas a la luz azul, antes del experimento, puede activarlas prematuramente.Por eso aconsejamos trabajar en completa oscuridad, o en condiciones de luz roja, en todo momento a la hora de preparar tus muestras. En condiciones estrictas de oscuridad, utilizando solo luz roja para la iluminación, comience a hacer una solución de trabajo intermedia y de stock de PST-1P en agua ultrapura. Como se describe en el texto manuscrito.Luego, diluya PST-1P en KSOM fresco para lograr la concentración final de 40 M.To prepare la diapositiva de la cámara para imágenes en vivo, agregue 10 L de KSOM tratado con PST-1P en el centro de un pozo, para formar una gota hemisférica. Para evitar que la gota se evapore, cúbrala con suficiente aceite mineral. Luego, envuelva libremente el plato de cultivo preparado en papel de aluminio, o coloque el plato de cultivo en un recipiente opaco no hermético en la incubadora para garantizar que no haya exposición a la luz.Después de transferir los embriones a la gota de KSOM tratada con PST-1P, asegúrese de que los embriones se agrupen en el centro de la gota y se asienten en el fondo del plato. Una vez preparada la lente del objetivo de inmersión, monte el portaobjetos de la cámara en el microscopio, dentro de una cámara ambiental. Establecido en 37 C y 5% de CO2, y en completa oscuridad, para garantizar que todos los PST-1P estén en la transconfiguración inactiva, y que los embriones puedan hundirse en el fondo del plato.Utilice una antorcha de luz roja para colocar la lente del objetivo en contacto con el medio de inmersión. Luego, ubique el borde de la gota del medio y coloque el objetivo directamente sobre él. Usando el modo de escaneo en vivo y un láser de 561 nm, localice los embriones dentro de la gota.Utilice controladores de etapa y el modo de escaneo en vivo para establecer los puntos de inicio y final para adquirir una pila z de todo el embrión. Ajuste la configuración de potencia del láser hasta un máximo del 5% de acuerdo con su señal. Y ajuste el desplazamiento digital a un máximo de 0.900, de acuerdo con su señal, para optimizar la apariencia de los cometas EB3-dTomato.Minimizar el ruido de fondo. Coloque el agujero de alfiler a 2 m. Resolución de píxeles a 512 por 512.Y el tiempo de permanencia de píxeles en 3.15 s. Y ajuste el zoom a 2x. Adquirir una pila z de todo el embrión con intervalos de sección de 1 m para evaluar las áreas de crecimiento de microtúbulos en todo el organismo.Para los experimentos de seguimiento de cometas EB3-dTomato, abra la imagen 3D z-stack, aumente el zoom a tres veces. Y dibuje un ROI rectangular alrededor del área subcelular específica de interés. Luego, adquiera la película de lapso de tiempo de un solo plano z, utilizando los parámetros establecidos, con el intervalo de tiempo de 500 ms.Para activar PST-1P, cambie a un láser de 405 nm y adquiera otro lapso de tiempo, con el láser configurado al 10% de potencia, estenopeico abierto al máximo, resolución de píxeles de 512 por 512, el tiempo de permanencia de píxeles de 3.15 s, zoom de tres veces, en un intervalo de tiempo de 500 ms y configure 20 cuadros para adquirir. Inmediatamente después de la activación, vuelva a cambiar al láser de 561 nm y repita la adquisición, como se demostró anteriormente, para confirmar la pérdida de cometas EB3-dTomato después de la activación de PST-1P. Ahora, para revertir PST-1P a su transestado inactivo, active un láser de 514 nm y adquiera otro lapso de tiempo con parámetros establecidos.Para visualizar la recuperación de los cometas EB3-dTomato, vuelva a cambiar al láser de 561 nm y repita la adquisición. En embriones de control no tratados, antes de la iluminación con un láser de 405 nm, la señal EB3-dTomato era alta dentro de todo el citoplasma de la célula, excepto el área nuclear. Después de la iluminación, no se detectaron cambios en la señal.Indicando que el láser de 405 nm no causó daño fotográfico a la dinámica embrionaria o de microtúbulos. Durante el tratamiento PST-1P de embriones en etapa de 16 células, bajo estrictas condiciones oscuras, se detectó una fuerte expresión de EB3-dTomato en la imagen 3D, lo que demuestra que pst-1P inactivo no provocó la inhibición de la polimerización de microtúbulos en condiciones oscuras. Antes de la activación de PST-1P, la imagen de lapso de tiempo de un solo plano z confirmó una fuerte expresión de EB3-dTomato y polimerización de microtúbulos en una región subcelular.Después de la activación de la luz de 405 nm, en cuestión de segundos, se detectó una reducción en la señal del cometa EB3-dTomato. Y la recuperación de la señal se logró tras la desactivación de PST-1P, utilizando un láser de 514 nm. Los embriones micro inyectados con EB3-dTomato, e incubados con PST-1P, mostraron un potencial embrionario normal, desarrollándose hasta la etapa de blastocisto.Y la dinámica normal de los microtúbulos durante la mitosis. Indicando no toxicidad de un PST-1P activo para el embrión. En las películas de lapso de tiempo adquiridas, el etiquetado EB3-dTomato apareció como estructuras similares a cometas y permitió el seguimiento de filamentos de microtúbulos en crecimiento.En embriones tratados con PST-1P, mantenidos en condiciones de oscuridad, los cometas EB3-dTomato individuales emanaron del puente interfase, que actúa como un centro organizador de microtúbulos no centrosómicos en el embrión de ratón temprano. Una pila en T muestra cometas EB3-dTomato en la región del puente interfase. Tras la activación de PST-1P, los cometas EB3-dTomato se redujeron en la base del puente interfase y en la pila en T.Recuerde que la luz blanca puede activar PST-1P prematuramente. Por lo tanto, use solo fuentes de luz roja para la visibilidad. La luz verde también desactiva PST-1P, así que evite usar marcadores de etiquetas fluorescentes verdes.Esta técnica se ha utilizado en drosophila, ameba, ratones y múltiples sistemas in vitro, para atacar el crecimiento de microtúbulos con el fin de estudiar la migración celular y la formación de tejidos.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso<em&gt; En Vivo</em&gt; Y<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayos

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Análisis cuantitativo de la expresión de la proteína para el Estudio de la especificación del linaje de ratón de preimplantación de embriones

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identificación de progenitores eritromioideos y su progenie en el embrión de ratón por citometría de flujo

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivación de líneas de células madre de embriones de preimplantación de ratón

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

Eficacia de la extracción de aire en dos peces salmónidos, trucha arco iris (Oncorhynchus Mykiss) y trucha (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Transferencia de embriones mínimamente invasiva y vitrificación de embriones en la etapa óptima del embrión en el modelo Rabbit

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Reconstitución in Vitro de patrones de contacto de células espaciales con Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres aislados y perlas de poliestireno adhesivo

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...