Name: spatiotemporal subcellular manipulation of the microtubule cytoskeleton in the living preimplantation mouse embryo using photostatins
Uploaded: 2021-11-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr. Oliver Thorn-Seshold och Li Gao för att ha gett oss fotostatiner och råd om manuskriptberedning, Monash Production för filmstöd och Monash Micro Imaging för mikroskopistöd.
Detta arbete stöddes av National Health and Medical Research Council (NHMRC) projektbidrag APP2002507 till J.Z. och Canadian Institute for Advanced Research (CIFAR) Azrieli Scholarship till J.Z. Australian Regenerative Medicine Institute stöds av bidrag från delstatsregeringen i Victoria och den australiensiska regeringen.

Försöken godkändes av Monash Animal Ethics Committee under djuretiskt nummer 19143. Djur hölls i specifika patogenfria djurhusförhållanden på djuranläggningen (Monash Animal Research Platform) i strikt överensstämmelse med etiska riktlinjer.
1. Preimplantatorisk musembryosamling
<ol><li>Superäggula och para möss som beskrivits tidigare 16,18, i enlighet med de institutionella djuretiska riktlinjerna. O...

<ol>
	<li>Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-dependent+subcellular+organisation+of+pluripotent+cells.">Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells.</a> Development. 148 (20), (2021).</li><li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-organizing+centers:+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites.">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).</li><li>Galli, M., Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+size+determines+the+strength+of+the+spindle+assembly+checkpoint+during+embryonic+development.">Cell size determines the strength of the spindle assembly checkpoint during embryonic development.</a> Developmental Cell. 36 (3), 344-352 (2016).</li><li>Vazquez-Diez, C., Paim, L. M. G., FitzHarris, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-size-independent+spindle+checkpoint+failure+underlies+chromosome+segregation+error+in+mouse+embryos.">Cell-size-independent spindle checkpoint failure underlies chromosome segregation error in mouse embryos.</a> Current Biology. 29 (5), 865-873 (2019).</li><li>Baudoin, J. P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nocodazole-induced+changes+in+microtubule+dynamics+impair+the+morphology+and+directionality+of+migrating+medial+ganglionic+eminence+cells.">Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells.</a> Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).</li><li>Munz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+lose+their+functional+properties+after+paclitaxel+treatment.">Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).</li><li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs.">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li><li>Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomolar+concentrations+of+nocodazole+alter+microtubule+dynamic+instability+in+vivo+and+in+vitro.">Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro.</a> Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).</li><li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoswitchable+inhibitors+of+microtubule+dynamics+optically+control+mitosis+and+cell+death.">Photoswitchable inhibitors of microtubule dynamics optically control mitosis and cell death.</a> Cell. 162 (2), 403-411 (2015).</li><li>Gaspari, R., Prota, A. E., Bargsten, K., Cavalli, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+cis-+and+trans-Combretastatin+binding+to+tubulin.">Structural basis of cis- and trans-Combretastatin binding to tubulin.</a> Chem. 2 (1), 102-113 (2017).</li><li>Thorn-Seshold, O., Meiring, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocontrolling+microtubule+dynamics+with+photoswitchable+chemical+reagents.">Photocontrolling microtubule dynamics with photoswitchable chemical reagents.</a> ChemRxiv. , (2021).</li><li>Kopf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+control+cellular+shape+and+coherence+in+amoeboid+migrating+cells.">Microtubules control cellular shape and coherence in amoeboid migrating cells.</a> Journal of Cell Biology. 219 (6), 201907154 (2020).</li><li>Sawada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlexinD1+signaling+controls+morphological+changes+and+migration+termination+in+newborn+neurons.">PlexinD1 signaling controls morphological changes and migration termination in newborn neurons.</a> The EMBO Journal. 37 (4), 97404 (2018).</li><li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+microtubule+dynamics+directs+cell+mechanics+and+coordinates+forces+during+epithelial+morphogenesis.">Polarized microtubule dynamics directs cell mechanics and coordinates forces during epithelial morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 20 (10), 1126-1133 (2018).</li><li>Kepiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azidoblebbistatin,+a+photoreactive+myosin+inhibitor.">Azidoblebbistatin, a photoreactive myosin inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (24), 9402-9407 (2012).</li><li>Zenker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microtubule-organizing+center+directing+intracellular+transport+in+the+early+mouse+embryo.">A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo.</a> Science. 357 (6354), 925-928 (2017).</li><li>White, M. D., Zenker, J., Bissiere, S., Plachta, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instructions+for+assembling+the+early+mammalian+embryo.">Instructions for assembling the early mammalian embryo.</a> Developmental Cell. 45 (6), 667-679 (2018).</li><li>Zenker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+actin+rings+zipper+the+mouse+embryo+for+blastocyst+formation.">Expanding actin rings zipper the mouse embryo for blastocyst formation.</a> Cell. 173 (3), 776-791 (2018).</li><li>Theisen, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+and+motor+proteins+support+zebrafish+neuronal+migration+by+directing+cargo.">Microtubules and motor proteins support zebrafish neuronal migration by directing cargo.</a> Journal of Cell Biology. 219 (10), 201908040 (2020).</li><li>Rulicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pronuclear+microinjection+of+mouse+zygotes.">Pronuclear microinjection of mouse zygotes.</a> Methods in Molecular Biology. 254, 165-194 (2004).</li><li>Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+mouse+oocytes.">Isolation and in vitro culture of mouse oocytes.</a> Bio-protocol. 11 (15), 4104 (2021).</li><li>Subramanian, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocytes+mount+a+noncanonical+DNA+damage+response+involving+APC-Cdh1-mediated+proteolysis.">Oocytes mount a noncanonical DNA damage response involving APC-Cdh1-mediated proteolysis.</a> Journal of Cell Biology. 219 (4), 201907213 (2020).</li><li>Mihajlovic, A. I., Bruce, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+cell-fate+decision+of+mouse+preimplantation+embryo+development:+integrating+cell+position+and+polarity.">The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity.</a> Open Biology. 7 (11), 170210 (2017).</li><li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+speed+of+GTP+hydrolysis+determines+GTP+cap+size+and+controls+microtubule+stability.">The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability.</a> Elife. 9, 51992 (2020).</li><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+photocontrol+of+microtubule+dynamics+and+integrity,+migration+and+mitosis,+by+the+potent+GFP-imaging-compatible+photoswitchable+reagents+SBTubA4P+and+SBTub2M.">In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M.</a> BioRxiv. bioRxiv. , (2021).</li><li>Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+strategy+and+vector+library+for+the+rapid+generation+of+modular+light-controlled+protein-protein+interactions.">Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).</li><li>van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+microtubule+dynamics.">Optogenetic control of microtubule dynamics.</a> Methods in Molecular Biology. 2101, 211-234 (2020).</li><li>Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+microtubule+dynamics+using+an+optogenetic+microtubule+plus+end-F-actin+cross-linker.">Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).</li><li>Kogler, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+rapid+and+reversible+optogenetic+perturbation+of+nuclear+proteins+in+living+embryos.">Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos.</a> Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).</li><li>Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+microtubule+cytoskeleton:+setting+up+and+working+with+an+ablation+system.">Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system.</a> Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).</li><li>Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+combretastatins+as+potent+tubulin+polymerization+inhibitors.">Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors.</a> Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).</li><li>Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promising+applications+of+tumor+spheroids+and+organoids+for+personalized+medicine.">Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine.</a> Cancers (Basel). 12 (10), 2727 (2020).</li><li>Scherer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+and+uptake+of+the+anticancer+drug+combretastatin+in+cell+spheroids+and+photoisomerization+in+gels+with+multiphoton+excitation.">Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003 (2015).</li></ol>

Mikrotubulinätverket är integrerat i en cells grundläggande inre arbete. Följaktligen presenterar detta utmaningar för att manipulera mikrotubulidynamiken i levande organismer, eftersom varje störning i nätverket tenderar att få omfattande konsekvenser för alla aspekter av cellulär funktion. Framväxten av fotoswitchbara mikrotubuli-riktade föreningar presenterar ett sätt att exakt manipulera cytoskelettet på en subcellulär nivå, med överlägsen kontroll för induktion och reversering av mikrotubulär til...

Mikrotubuliarkitekturen varierar kraftigt mellan olika celltyper för att stödja olika funktioner 1,2. Dess dynamiska karaktär av tillväxt och krympning möjliggör snabb anpassning till extra- och intracellulära signaler och att svara på en cells ständigt föränderliga behov. Därför kan det betraktas som det "morfologiska fingeravtrycket" som spelar en nyckelroll i cellulär identitet.
Farmakologisk inriktning av mikrotubulicytoskelettet med hjälp av småmolekylära hämmare har lett till en uppsjö av grundläggande upptäckter inom utvecklingsbiologi, stamcellsbiologi, cancerbiologi och neurobiologi 3,4,5,6,7. Detta tillvägagångssätt, även om det är oumbärligt, presenterar olika begränsningar såsom toxicitet och effekter utanför målet. Till exempel är ett av de mest använda mikrotubuli-inriktningsmedlen, nokodazol, ett kraftfullt mikrotubuli-depolymeriserande läkemedel8. Småmolekylära hämmare såsom nokodazol är emellertid aktiva från appliceringstillämpningen och med tanke på mikrotubulicytoskelettets väsentliga natur för många kritiska cellulära funktioner kan global depolymerisering av mikrotubuli ge off-target-effekter, vilket kan vara olämpligt för många applikationer. Dessutom är nokodazolbehandling irreversibel om inte prover tvättas fria från läkemedlet, vilket förhindrar kontinuerlig levande avbildning och därmed exakt spårning av enskilda mikrotubulifilament.
Utvecklingen av ljusaktiverade föreningar började med skapandet av fotouncaged molekyler och har förebådat en ny era i inriktning och övervakning av effekterna av mikrotubulär tillväxthämning på ett exakt och spatiotemporalt kontrollerat sätt. En familj av reversibelt fotobytbara läkemedel, fotostatiner (PST), utvecklades genom att ersätta stilbenekomponenten i combretastatin A-4 med azobensen9. PST är inaktiva tills de tänds med UV-ljus, varigenom den inaktiva transkonfigurationen omvandlas till den aktiva cis-konfigurationen genom reversibel isomerisering. Cis-PST hämmar mikrotubulipolymerisation genom att binda till kolchicinbindningsstället för β-tubulin, blockera dess gränssnitt med β-tubulin och förhindra dimerisering som krävs för mikrotubulitillväxt10. Bland en kohort av PST har PST-1P uppstått som en blyförening eftersom den har den högsta styrkan, är helt vattenlöslig och visar en snabb början av bioaktivitet efter belysning.
Den mest effektiva trans- till cis-isomeriseringen av PST sker vid våglängder mellan 360-420 nm, vilket möjliggör dubbla alternativ för PST-aktivering. En 405 nm laserlinje på ett typiskt konfokalmikroskop kan administreras för optimal rumslig inriktning av mikrotubuli tillväxthämning. Möjligheten att fastställa platsen och tidpunkten för PST-aktivering genom 405 nm laserbelysning underlättar exakt tidsmässig och rumslig kontroll, vilket möjliggör störning av mikrotubulidynamik på en subcellulär nivå, inom subsekutsvarstiderna9. Alternativt, ett prisvärt LED UV-ljus tillåter belysning av hela organismen för att inducera organismomfattande störningar i mikrotubuliarkitekturen. Detta kan vara ett kostnadseffektivt alternativ för forskare för vilka den exakt tidsenad uppkomsten av hämning, snarare än rumslig inriktning, är målet. En annan egenskap hos PST är deras inaktivering på begäran genom att applicera grönt ljus med en våglängd i intervallet 510-540 nm9. Detta möjliggör spårning av mikrotubulifilament före, under och efter PST-medierade tillväxthämningar.
PST, även om det fortfarande är en relativt ny design, har använts i många in vitro-applikationer inom olika forskningsområden11, inklusive undersökning av nya mekanismer för cellmigration i amoeboider12, i neuroner isolerade från hjärnan hos den nyfödda musen13 och vingeepitelutveckling i Drosophila melanogaster14 . Andra ljusreaktiva läkemedel har visat sig vara värdefulla verktyg för riktade störningar i cellulär funktion. Till exempel användes en analog av blebbistatin, azidoblebbistatin, för förbättrad myosinhämning under belysning15,16. Detta belyser potentialen för nya upptäckter på grund av förmågan till spatiotemporalt kontrollerad hämning av cellulär funktion.
Levande 3D-organismer presenterar fantastiska men mer känsliga system för att manipulera mikrotubulidynamik på en heldjurs-, encells- eller subcellulär nivå under fysiologiska förhållanden. I synnerhet erbjuder det preimplantatoritiska musembryot exceptionell inblick i cellens inre arbete såväl som intercellulära relationer inom en organism17. Temporärt och rumsligt riktade konsekutiva cykler av aktivering och deaktivering av PST bidrog till karakteriseringen av interfasbron, en postcytokinetisk struktur mellan celler, som ett icke-centrosomalt mikrotubuliorganiserande centrum i det preimplantatoriska musembryot16. En liknande experimentell inställning visade involveringen av växande mikrotubuli i tätningen av musembryot för att möjliggöra blastocystbildning18. Vidare användes PST också i hela zebrafiskembryon för att undersöka neuronal cellmigration genom att hämma mikrotubulitillväxt i en delmängd av celler i bakhjärnen19.
Detta protokoll beskriver den experimentella installationen och användningen av PST-1P i det preimplantatorinationella musembryot. Instruktionerna som presenteras här kan också vägleda tillämpningen av PST för ett brett spektrum av mål som att studera kromosomsegregering och celldelning, handel med intracellulär last och cellmorfogenes och migration. Dessutom kommer sådana studier att hjälpa till med implementeringen av PST i organoidsystem, blastoider och andra embryomodeller som Caenorhabditis elegans och Xenopus laevis, samt potentiellt utöka användningen av PST för in vitro-fertiliseringsteknik .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td>For mouth aspiration apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slides - LabTek</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NUN155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cRNA encoding for EB3-dTomato</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dishes - 35mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic growth hormone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Tubal Fluid (HTF) medium</td>
			<td>Cosmo-Bio</td>
			<td>CSR-R-B071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Image Analysis Software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil W 2010</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>For use with microscope immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED torch - Red light</td>
			<td>Celestron</td>
			<td>93588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice - wild-type FVB/N, males and females</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary Pipettes - Kimble</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z543306</td>
			<td>For mouth aspiration apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-4008-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage In vitro Transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium</td>
			<td>Cosmo-Bio</td>
			<td>CSR-R-B074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotrophin</td>
			<td>Prospec Bio</td>
			<td>HOR-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PST-1P</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>B511361-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Black Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporal subcellular manipulation of the microtubule cytoskeleton in the living preimplantation mouse embryo using photostatins

Mikrotubulicytoskelettet utgör ramen för en cell och är grundläggande för intracellulär transport, celldelning och signaltransduktion. Traditionell farmakologisk störning av det allestädes närvarande mikrotubulinätverket med användning av till exempel nokodazol kan få förödande konsekvenser för vilken cell som helst. Reversibelt fotoswitchbara mikrotubulihämmare har potential att övervinna begränsningarna genom att göra det möjligt att implementera läkemedelseffekter på ett spatiotemporalt kontrollerat sätt. En sådan familj av läkemedel är de azobensenbaserade fotostatinerna (PST). Dessa föreningar är inaktiva under mörka förhållanden, och vid belysning med UV-ljus binder de till kolchicinbindningsstället för β-tubulin och blockerar mikrotubulipolymerisation och dynamisk omsättning. Här är tillämpningen av PST i det 3-dimensionella (3D) levande preimplantatoribiorembryot inställt på att störa mikrotubulinätverket på en subcellulär nivå. Detta protokoll ger instruktioner för experimentell installation, samt ljusaktiverings- och avaktiveringsparametrar för PST med hjälp av konfokalmikroskopi med levande celler. Detta säkerställer reproducerbarhet och gör det möjligt för andra att tillämpa denna procedur på sina forskningsfrågor. Innovativa fotoswitchar som PST kan utvecklas som kraftfulla verktyg för att främja förståelsen av det dynamiska intracellulära mikrotubulinätverket och för att icke-invasivt manipulera cytoskelettet i realtid. Dessutom kan PST vara användbara i andra 3D-strukturer såsom organoider, blastoider eller embryon från andra arter.

I enlighet med protokollet mikroinjicerades preimplantationsmusembryon med cRNA för EB3, märkta med röd fluorescerande dTomato (EB3-dTomato). Detta möjliggör visualisering av växande mikrotubuli eftersom EB3 binder till polymeriserande mikrotubuli plus slutar24.
Experimenten utfördes 3 dagar efter befruktningen (E3) då musembryot består av 16 celler. Alla andra preimplantatorisk utvecklingsstadium kan användas, beroende på vilken vetenskaplig fråga som ska u...

Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins at JoVE.com

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

Typiska mikrotubulihämmare, som används i stor utsträckning i grundforskning och tillämpad forskning, har långtgående effekter på celler. Nyligen framkom fotostatiner som en klass av fotoväxlingsbara mikrotubulihämmare, som kan momentan, reversibel, spatiotemporalt exakt manipulation av mikrotubuli. Detta steg-för-steg-protokoll beskriver tillämpningen av fotostatiner i ett 3D-levande preimplantatorembryo.

Spatiotemporal subcellulär manipulation av mikrotubulicytoskelettet i det levande preimplantatoriska musembryot med hjälp av fotostatiner

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. ...

Detta protokoll är det första i sitt slag som applicerar fotostatiner på det levande preimplantatoriska musembryot och gäller användningsområden för att använda ljusväxlande läkemedel på andra 3D-fysiologiska system. Ljusomkopplingsbara fotostatiner möjliggör manipulation av mikrotubuli tillväxt, i rum och tid, och omvandlas tillbaka till ett avstängt tillstånd. Oavsiktligt utsätta fotostatiner för blått ljus, före experimentet, kan aktivera dem i förtid.Så vi rekommenderar att du arbetar i fullständigt mörker eller rött ljus hela tiden när du förbereder dina prover. Under strikta mörka förhållanden, med endast rött ljus för belysning, börja göra lager och mellanliggande arbetslösning av PST-1P i ultrarent vatten. Som beskrivs i textmanuskriptet.Späd sedan PST-1P i färsk KSOM för att uppnå den slutliga koncentrationen på 40 M.To förbereda kammarbilden för levande avbildning, tillsätt 10 liter PST-1P-behandlad KSOM i mitten av en brunn för att bilda en halvklotformad droppe. För att förhindra att droppen avdunstar, täck den med tillräcklig mineralolja. Linda sedan löst in den beredda odlingsskålen i folie eller placera odlingsskålen i en icke-lufttät ogenomskinlig behållare i inkubatorn för att säkerställa ingen ljusexponering.Efter överföring av embryon till pst-1P-behandlad KSOM-droppe, se till att embryon är grupperade i mitten av droppen och sedimenterade till botten av skålen. När nedsänkningsmållinsen är förberedd, montera kammarbilden på mikroskopet, inuti en miljökammare. Inställd på 37 C och 5% CO2, och i fullständigt mörker, för att säkerställa att alla PST-1Ps är i den inaktiva transkonfigurationen och att embryon kan sjunka till botten av skålen.Använd en ficklampa med rött ljus för att placera objektivlinsen i kontakt med nedsänkningsmediet. Leta sedan upp kanten på mediets droppe och placera målet direkt över det. Använd live-scanning-läget och en 561 nm laser, lokalisera embryon i droppen.Använd scenkontroller och live-scanning-läge för att ställa in start- och slutpunkter för att skaffa en z-stack av hela embryot. Justera lasereffektinställningarna upp till maximalt 5% enligt din signal. Och ställ in digital förskjutning till högst 0,900, enligt din signal, för att optimera utseendet på EB3-dTomato-kometer.Minimera bakgrundsbruset. Ställ in nålhålet på 2 m. Pixelupplösning vid 512 till 512.Och pixelns uppehållstid vid 3, 15 s. Och ställ in zoomen på 2x. Skaffa en z-stack av hela embryot med 1 m sektionsintervall för att bedöma områdena för mikrotubuli tillväxt i hela organismen.För EB3-dTomato kometspårningsexperiment, öppna 3D z-stackbilden, öka zoomen till tre gånger. Och rita en rektangulär ROI runt det specifika subcellulära intresseområdet. Skaffa sedan time lapse-filmen för ett enda z-plan, med hjälp av de inställda parametrarna, med ett tidsintervall på 500 ms.För att aktivera PST-1P, byt till en 405 nm-laser och skaffa en annan time-lapse, med lasern inställd på 10% effekt, pinhole öppnade maximalt, pixelupplösning på 512 med 512, pixelns uppehållstid på 3,15 s, zoom på tre gånger, med ett tidsintervall på 500 ms och ställ in 20 ramar som ska förvärvas. Omedelbart efter aktiveringen, byt tillbaka till 561 nm laser och upprepa förvärvet, som visats tidigare, för att bekräfta förlusten av EB3-dTomato-kometer efter aktivering av PST-1P. Nu, för att vända PST-1P tillbaka till sitt inaktiva transtillstånd, koppla in en 514 nm laser och skaffa en annan time-lapse med inställda parametrar.För att visualisera återhämtningen av EB3-dTomato-kometer, byt tillbaka till 561 nm laser och upprepa förvärvet. I obehandlade kontrollembryon, före belysning med en 405 nm laser, var EB3-dTomato-signalen hög inom hela cellens cytoplasma, utom kärnområdet. Efter belysning upptäcktes inte förändringar i signalen.Indikerar att 405 nm-lasern inte orsakade fotoskador på embryot eller mikrotubulidynamiken. Under PST-1P-behandling av embryon i 16-cellstadiet, under strikta mörka förhållanden, detekterades starkt EB3-dTomato-uttryck i 3D-bilden, vilket visade att inaktiv PST-1P inte framkallade hämning av mikrotubuli polymerisation under mörka förhållanden. Före aktivering av PST-1P bekräftade time-lapse-avbildningen av ett enda z-plan starkt EB3-dTomato-uttryck och mikrotubulipolymerisation i en subcellulär region.Efter 405 nm ljusaktivering, inom några sekunder, detekterades en minskning av EB3-dTomato kometsignalen. Och återhämtning av signalen uppnåddes vid avaktivering av PST-1P, med användning av en 514 nm laser. Embryona mikroinjicerade med EB3-dTomato och inkuberade med PST-1P visade normal embryonal potential och utvecklades till blastocyststadiet.Och normal mikrotubuli dynamik under mitos. Indikerar icke-toxicitet hos en aktiv PST-1P till embryot. I de förvärvade time-lapse-filmerna uppträdde EB3-dTomato-märkning som kometliknande strukturer och möjliggjorde spårning av växande mikrotubulifilament.I PST-1P-behandlade embryon, som hölls under mörka förhållanden, utgick enskilda EB3-dTomato-kometer från interfasbron, som fungerar som ett icke-centrosomalt mikrotubuliorganiserande centrum i det tidiga musembryot. En t-stack visar EB3-dTomato-kometer i området för interfasbron. Efter aktivering av PST-1P reducerades EB3-dTomato-kometer vid basen av interfasbron och i t-stacken.Kom ihåg att vitt ljus kan aktivera PST-1P i förtid. Så använd endast röda ljuskällor för synlighet. Grönt ljus inaktiverar också PST-1P, så undvik att använda gröna fluorescerande etikettmarkörer.Denna teknik har använts i drosophila, amöba, möss och flera in vitro-system för att rikta in sig på mikrotubulitillväxt för att studera cellmigration och vävnadsbildning.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Mätning Protein Stabilitet i Living Zebrafish embryon Använda Fluorescens Decay Efter Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering av Thymic Settling stamfäder i Mouse Embryo Använda<em&gt; In Vivo</em&gt; Och<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyser

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead Implantation i zebrafisk embryot

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subcellulära strukturer i vardagsZebraFish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analys av proteinuttryck att studera Lineage Specifikation i mus Preimplantatorisk embryon

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikation av erytromyeloidprogenitorer och deras avkomma i musembryo med flödescytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Härledning av stamcellslinjer från musembryon preimplantatorisk

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

Effektiviteten i den luft som strippar i två laxfisk, regnbåge (Oncorhynchus Mykiss) och öring (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimalinvasiv embryoöverföring och embryo-förglasning vid det optimala embryonala steget i Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In vitro-beredning av rumslig cell kontakt mönster med isolerad Caenorhabditis elegans embryo Blastomeres och lim polystyren pärlor

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...