Name: high-speed video microscopy analysis for first-line diagnosis of primary ciliary dyskinesia
Uploaded: 2022-01-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-speed Video Microscopy Analysis for First-line Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia at JoVE.com

Мы хотим выразить особую благодарность детской медсестре г-же Йоханне Юванкоски за ее отличную помощь с чистками зубов. Мы также хотели бы выразить особую благодарность профессору Хеймуту Омрану (Университетская клиника Мюнстера, Великобритания) за предоставление разрешения на использование схематической фигуры нормального цилиарного движения с их веб-сайта. Наконец, мы хотели бы поблагодарить г-на Алана Брауна БА (с отличием), PGCE, за корректуру рукописи.

Заявление об этике:
Это исследование было одобрено местным комитетом по этике (69/2017) и было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией.
1. Сбор и транспортировка респираторных эпителиальных клеток
<ol><li>Чистки<ol>
<li>Перед чисткой зубов вве?...

<ol>
	<li>Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia.</a> Cilia. 4 (1), 2 (2015).</li><li>Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia:+An+update+on+clinical+aspects,+genetics,+diagnosis+and+future+treatment+strategies.">Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 135 (2017).</li><li>Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+novel+mutations+in+the+DNAH11+gene+in+primary+ciliary+dyskinesia+(CILD7)+with+considerable+variety+in+the+clinical+and+beating+cilia+phenotype.">Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype.</a> BMC Medical Genetics. 21 (1), 237 (2020).</li><li>Knowles, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+DNAH11+in+patients+with+primary+ciliary+dyskinesia+with+normal+ciliary+ultrastructure.">Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure.</a> Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).</li><li>Boon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia:+critical+evaluation+of+clinical+symptoms+and+diagnosis+in+patients+with+normal+and+abnormal+ultrastructure.">Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11 (2014).</li><li>Kouis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+primary+ciliary+dyskinesia+in+consecutive+referrals+of+suspected+cases+and+the+transmission+electron+microscopy+detection+rate:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis.</a> Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).</li><li>Marthin, J. K., Nielsen, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+nasal+nitric+oxide+technique+as+first-line+test+for+primary+ciliary+dyskinesia.">Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).</li><li>Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+diagnostic+testing+in+primary+ciliary+dyskinesia.">Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).</li><li>Lucas, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Respiratory+Society+guidelines+for+the+diagnosis+of+primary+ciliary+dyskinesia.">European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090 (2017).</li><li>Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERS+and+ATS+diagnostic+guidelines+for+primary+ciliary+dyskinesia:+similarities+and+differences+in+approach+to+diagnosis.">ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis.</a> European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066 (2019).</li><li>Kouis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effectiveness+analysis+of+three+algorithms+for+diagnosing+primary+ciliary+dyskinesia:+a+simulation+study.">Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142 (2019).</li><li>Rubbo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+high-speed+video+analysis+to+diagnose+primary+ciliary+dyskinesia.">Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia.</a> Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).</li><li>Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+technique+to+diagnose+primary+ciliary+dyskinesia.">Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia.</a> The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).</li><li>Chilvers, M. A., Rutman, A., O&#180;Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+cilia+and+ciliated+epithelial+ultrastructure+in+healthy+children+and+young+adults.">Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults.</a> Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).</li><li>Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+methods+in+primary+ciliary+dyskinesia.">Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia.</a> Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).</li><li>Ballenger, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+effect+of+cigarette+smoke+on+human+respiratory+cilia.">Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia.</a> New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).</li><li>Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cigarette+smoking+on+nasal+mucociliary+clearance+and+ciliary+beat+frequency.">Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency.</a> Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).</li><li>Kobbernagel, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+azithromycin+maintenance+therapy+in+primary+cilia+dyskinesia+(BESTCILIA):+a+multicentre,+double-blind,+randomised,+placebo-controlled+phase+3+trial.">Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial.</a> Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).</li><li>Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+macrolide+antibiotics+on+ciliary+motility+in+rabbit+airway+epithelium+in-vitro.">Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).</li><li>Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+cells+harvested+with+nasal+brushing:+a+method+for+evaluating+ciliary+function.">Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function.</a> Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).</li><li>Pifferi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+cell+culture+method+for+the+diagnosis+of+atypical+primary+ciliary+dyskinesia.">Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia.</a> Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).</li><li>Hirst, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+primary+ciliary+dyskinesia+epithelial+cells+at+air+liquid+interface+can+alter+ciliary+phenotype+but+remains+a+robust+and+informative,+diagnostic+aid.">Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid.</a> PLoS One. 9 (2), 89675 (2014).</li><li>Papon, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ciliary+beating+in+primary+ciliary+dyskinesia:+a+pilot+study.">Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78 (2012).</li><li>Smith, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia+FA:+a+research+tool+for+automated,+high-throughput+measurement+of+ciliary+beat+frequency+using+freely+available+software.">Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software.</a> Cilia. 1 (8), 14 (2012).</li><li>Sampaio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliar+Move:+new+software+for+evaluating+ciliary+beat+frequency+helps+find+novel+mutations+by+a+Portuguese+multidisciplinary+team+on+primary+ciliary+dyskinesia.">Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia.</a> European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792 (2021).</li><li>Mullowney, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia+and+neonatal+respiratory+distress.">Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress.</a> Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).</li><li>Leigh, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+nasal+nitric+oxide+measurement+as+a+test+for+primary+ciliary+dyskinesia.">Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia.</a> Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).</li></ol>

Здесь описан и обсужден процесс диагностики ПХД с использованием HSVMA в свете диагностики первой линии. Несмотря на то, что HSVMA относительно проста в установлении, экономически эффективна11 и является надежным методом в опытных руках12, HSVMA не является диагностич?...

Первичная цилиарная дискинезия (ПХД) является редким наследственным генетическим заболеванием, которое вызывает нарушения в движении бьющихся ресничек. Если его не диагностировать, это приводит к серьезному повреждению легких в более позднем возрасте из-за серьезного нарушения MCC. В прошлом его распространенность, по оценкам, находилась в диапазоне от 1:4000 до 50 000. Из-за неуклонного улучшения диагностики и растущей осведомленности о состоянии, обновления о распространенности ПХД предполагают, что он может быть гораздо более распространенным и, вероятно, в диапазоне от 1:4000 до 20000 вместо 1,2. Тем не менее, пациенты с ПХД все еще недодиагностированы или диагностированы слишком поздно 1,3. Таким образом, младенцы с врожденным situs inversus и / или гетеротаксией или перинатальной ринореей, респираторным дистрессом новорожденных, заложенным носом и трудностями кормления должны быть подозреваемыми для PCD. В более позднем возрасте хронический отит, рецидивирующая пневмония, риносинусит и хронический, типичный влажный кашель из-за нарушения MCC являются отличительными симптомами PCD, которые в сочетании с бронхоэктазами и нарушением функции легких продолжаются во взрослом возрасте2.
Пациенты с подозрением на наличие ПХД могут быть диагностированы с помощью различных диагностических инструментов. В прошлом TEM считалась золотым стандартом для диагностики первой линии. Однако до 30% случаев ПХД не показывают аномальной ультраструктуры 1,3,4,5,6, требующей иного диагностического подхода. Поэтому все большее число центров и руководящих принципов Европейского респираторного общества (ERS) предлагают комбинацию назального оксида азота (nNO) и HSVMA в качестве диагностики первой линии 1,7,9,10. HSVMA и nNO также являются наиболее экономически эффективными вариантами идентификации пациента с PCD11. Однако, даже если генетическое тестирование было включено в диагностику, следует иметь в виду, что в настоящее время не существует отдельного теста или комбинации тестов, которые могут исключить ПХД со 100% уверенностью 8,9,10.
Из доступных диагностических вариантов HSVMA является единственным тестом, который фокусируется на живых, покрытых ресничками респираторных клетках и оценивает цилиарный паттерн биения (CBP) и частоту цилиарного биения (CBF). В отличие от ТЕА, результаты HSVMA доступны быстро, обычно в день тестирования, тогда как результаты TEM могут поступать через несколько месяцев после взятия образца. HSVMA может применяться для всех возрастных групп, тогда как nNO требует высокой степени соответствия; попытки использовать его в возрасте до 5 лет обычно оказываются безуспешными10. В опытных руках HSVMA обладает отличной чувствительностью и специфичностью для диагностики PCD на 100% и 96% соответственно12.
В этой статье описывается пошаговая процедура выполнения HSVMA, включая сбор дыхательных клеток, покрытых ресничками, из нижней носовой раковины, сохранение собранных клеток в питающей клетки среде для транспортировки к месту исследования и процесс микроскопического видеоанализа для определения CBF и CBP. Кроме того, показаны некоторые видеоклипы от пациентов, сравнивающие нормальные CBP и CBF с аномальной функцией ресничек (Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7 и Video 8).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amoxiciline-clavulanic acid</td>
			<td>Orion Oyj</td>
			<td></td>
			<td>40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera Software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td>HCI Image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold pack</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>for preservation and transport</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential interference microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Inverted, cell observer microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitial High Speed Video Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td>Orca Flash 4.0, digital camera type C11440</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10565018</td>
			<td>basal cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom microwell dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>cuvette for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Unit</td>
			<td>Carl Zeiss/PeCon</td>
			<td>810-450001</td>
			<td>Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interdental brush 0.6 mm</td>
			<td>Doft</td>
			<td>872267</td>
			<td>Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>100x/1.46, &#945; Plan-Apochromat DIC objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small polystyrene box with lid</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>for transport</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-speed video microscopy analysis for first-line diagnosis of primary ciliary dyskinesia

Первичная цилиарная дискинезия (ПХД) является врожденным расстройством, преимущественно наследуемым по аутосомно-рецессивному признаку. Расстройство вызывает нарушение движения ресничек, что приводит к серьезному нарушению мукоцилиарного клиренса (MCC). Если диагноз не диагностирован или поставлен слишком поздно, состояние приводит к развитию бронхоэктазов и серьезному повреждению легких в более позднем возрасте. Большинство методов диагностики ПХД отнимают много времени и требуют значительных экономических ресурсов для их установления. Высокоскоростной видеомикроскопический анализ (HSVMA) является единственным диагностическим инструментом для визуализации и анализа живых респираторных клеток с бьющимися ресничками in vitro. Он быстрый, экономичный и, в опытных руках, очень надежный в качестве диагностического инструмента для ПХД. Кроме того, классические диагностические меры, такие как просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ), не применимы к некоторым мутациям, поскольку морфологические изменения отсутствуют. 
В данной работе описывается процесс сбора респираторных эпителиальных клеток, дальнейшая подготовка образца и процесс HSVMA. Мы также описываем, как очищенные клетки можно успешно удерживать невредимыми и бить, сохраняя их в питательной среде для хранения и транспортировки к месту исследования в тех случаях, когда клиника не обладает оборудованием для выполнения HSVMA. Также показаны видео с патологическими паттернами биения от пациентов с мутацией в гене тяжелой цепи 11 (DNAH11), которая не может быть диагностирована с помощью ТЭМ; результат неубедительной HSVMA из-за инфекции верхних дыхательных путей, а также неудачного расчесывания с наложением эритроцитов. В этой статье мы хотели бы призвать каждое подразделение, занимающееся пульмонологическими пациентами и редкими заболеваниями легких, выполнять HSVMA в рамках своей повседневной диагностики PCD или отправлять образцы в центр, специализирующийся на выполнении HSVMA.

Видео 1 и Видео 2 показывают нормальный контроль, где CBF и CBP находятся в нормальном диапазоне (см. Рисунок 1). Видео 3, Видео 4, Видео 5 и Видео 6 представляют два случая пациентов с ПХД с гомозиготной мутацией в <em...

Watch this Scientific Journal Video about High-speed Video Microscopy Analysis for First-line Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia at JoVE.com

High-speed Video Microscopy Analysis for First-line Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia

Высокоскоростной видеомикроскопический анализ является относительно простым в выполнении, быстрым, экономичным и, в опытных руках, достаточно надежным инструментом для первой линии диагностики первичной цилиарной дискинезии, который должен быть доступен в каждом центре, занимающемся диагностикой и лечением тяжелых заболеваний легких.

Высокоскоростной видеомикроскопический анализ для диагностики первой линии первичной цилиарной дискинезии

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the ...

Высокоскоростной видеомикроскопический анализ является надежным инструментом для диагностики первой линии первичной цилиарной дискинезии. Эта техника относительно проста в выполнении, быстра, экономична, а в опытных руках еще очень надежный инструмент. И он применим для пациентов всех возрастных групп.Видеомикроскопия также выявляет вторичную цилиарную функцию. Как, например, из-за бактериальных или вирусных инфекций. Но он в основном использовался для диагностики первичной цилиарной дискинезии.Ученые используют этот метод также для визуализации внутриклеточных процессов или биологических функций в живых клетках. Помочь мне в этой процедуре будет г-жа Тина Перомаа, наш лаборант.Перед сбором дыхательных эпителиальных клеток попросите больного тщательно высморкаться. Когда пациент будет готов, держите голову пациента неподвижной одной рукой и используйте межзубную щетку размером 0,6 миллиметра в другой руке, чтобы расчесать нижнюю носовую раковину ноздри, чтобы собрать достаточное количество полосок эпителиальных клеток. Опустите собранные клеточные полоски в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую DMEM, питаемый клетками.После закрытия крышки микроцентрифуги проведите трубку к источнику света и встряхните трубку, чтобы обнаружить собранные клеточные полоски и конгломераты. Позже поместите микроцентрифужные трубки с правильно закрытыми крышками в полистирольную коробку. Перед плотным закрытием коробки убедитесь, что трубки закреплены внутри коробки.Затем добавьте холодный пакет в коробку, избегая замораживания образца. После извлечения микроцентрифужных трубок, содержащих образцы, из полистирольной коробки поместите одну трубку под капот нагревательного блока микроскопа, чтобы прогреть до 37 градусов цельсия для высокоскоростного анализа видеомикроскопии или HSVMA. Далее запустите камеру и программное обеспечение видеоблока на компьютере.Используйте пипетку, чтобы взять небольшой образец и поместить две капли образца в кювету. Накройте кювет крышкой, прежде чем поместить ее под микроскоп. Используйте масляную иммерсионную линзу с 100-кратным увеличением и нанесите каплю погружного масла на поверхность оптики.Приближаясь к дну тарелки с помощью линзы микроскопа, ищите кластеры клеток без эритроцитов и с низким содержанием слизи. После поиска репрезентативной области интереса, или ROI, сосредоточьтесь на одной группе бьющихся ресничек с наибольшими движениями ресничек и запишите видеоряд. Записывайте клетки с биением ресничек сбоку и сверху.Репрезентативный анализ показывает нормальные движения ресничек, видимые сбоку и сверху. Образец первичной цилиарной дискинезии, или пациента с ПХД, с мутацией в гене DNAH11 продемонстрировал классический жесткий минимально движущийся паттерн цилиарного биения. При взгляде сбоку и выше.У другого пациента с ПХД с той же мутацией наблюдалась другая гиперкинетическая, но неэффективная картина биющихся ресничек. Патологический паттерн цилиарного биения и частота цилиарного биения также наблюдались у пациента с рецидивирующими инфекциями верхних дыхательных путей. Если процедура чистки зубов проводилась строго, анализ HSVMA не мог быть выполнен, так как реснитчатые эпителиальные клетки были покрыты покрытием эритроцитов.Наиболее важным шагом в процедуре является получение достаточного количества дыхательных клеток из щеток и сохранение этого материала хорошо сохранившимся для видеоанализа. Оставшийся материал может быть использован для выполнения электронной микроскопии или иммунофлоресцентной микроскопии для обнаружения возможных структурных дефектов в ресничках или для выявления дефектов и синтеза цилиарных белков.

Research

JoVE Journal

Medicine

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis

FISH для подготовки к имплантации генетическая диагностика

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a ...

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves' Muntjac Deer

Трансабдоминальное УЗИ для диагностики беременности в Ривз 'Мунтжак олень

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

Оценка механизмов сосудистой контроля использования видео микроскопии изолированных сопротивления артериях крыс

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Hydra, a Computer-Based Platform for Aiding Clinicians in Cardiovascular Analysis and Diagnosis

Гидра, компьютер-платформа для помогая врачам в сердечно-сосудистой системы анализа и диагностики

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Иммунофлуоресценция Маркировка человека и Минин Нейтрофил Внеклеточные ловушки в парафин-встроенные ткани

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

Тестирование ацетилхолина с последующим использованием аденозина для инвазивной диагностики коронарных вазомоторных расстройств

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Measurement of Myocardial Lactate Production for Diagnosis of Coronary Microvascular Spasm

Измерение продукции лактата в миокарде для диагностики микроваскулярного спазма коронарных артерий

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina ...

Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

Тест активации базофилов для диагностики аллергии

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

Сбор, расширение и дифференциация первичных моделей эпителиальных клеток носа человека для количественной оценки частоты биения ресничек

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...