Name: culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system
Uploaded: 2022-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Dette arbeidet støttes av Canadian Space Agency (CSA), forskningsstipend (17ILSRA3, Immuno Profile). Forfattere vil gjerne anerkjenne og takke Dr. Roxanne Fournier (University of Toronto), Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) og Preteesh Mylabathula (University of Arizona) for deres hjelp med den første feilsøkingen av denne protokollen.

MERK: Følgende trinn skal fullføres inne i et sterilt biologisk sikkerhetsskap.
1. Fremstilling av fartøy for cellekultur
<ol><li>Ta dyrkningskarene ut av plastemballasjen. Merk hvert fartøy på felgen etter hvilken celletype/linje som brukes, enten det er kontroll (1G) eller behandling (SMG), og eventuell annen relevant informasjon.</li>
	<li>Stabiliser beholderen og åpne påfyllingsporten forsiktig, uten å berøre påfyllingsportens pinne / O-ring. Plasser hetten på...

<ol>
	<li>ElGindi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+the+force+be+with+you+(or+not):+the+immune+system+under+microgravity.">May the force be with you (or not): the immune system under microgravity.</a> Cells. 10 (8), 1941 (2021).</li><li>Chouk&#232;r, A., Ullrich, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+system+dysregulation+during+spaceflight:+potential+countermeasures+for+deep+space+exploration+missions.">Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Countermeasures-based+improvements+in+stress,+immune+system+dysregulation+and+latent+herpesvirus+reactivation+onboard+the+International+Space+Station+-+relevance+for+deep+space+missions+and+terrestrial+medicine.">Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine.</a> Neuroscience &amp; Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).</li><li>Herranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground-based+facilities+for+simulation+of+microgravity:+organism-specific+recommendations+for+their+use,+and+recommended+terminology.">Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology.</a> Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).</li><li>Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+current+microgravity+platforms+for+space+biology+research.">Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research.</a> Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).</li><li>Murphy, K., Weaver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology 9th Edition. , (2016).</li><li>Dedolph, R. R., Dipert, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+gravity+stimulus+nullification+by+clinostat+rotation.">The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation.</a> Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+suspension+culture:+the+rotating-wall+vessel.">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).</li><li>Crabb&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+proteomic+responses+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+to+spaceflight+conditions+involve+Hfq+regulation+and+reveal+a+role+for+oxygen.">Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).</li><li>Ulbrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+simulated+and+real+microgravity+on+bone+cells+and+mesenchymal+stem+cells.">The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).</li><li>Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+and+simulated+microgravity+cause+a+significant+reduction+of+key+gene+expression+in+early+T-cell+activation.">Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).</li><li>Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+cell+line+(NK-92)+with+phenotypical+and+functional+characteristics+of+activated+natural+killer+cells.">Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.</a> Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).</li><li>Williams, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+NK-92+cells+for+refractory+hematological+malignancies+relapsing+after+autologous+hematopoietic+cell.">A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell.</a> Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).</li><li>Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol">https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol</a> (2022)</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2022)</li><li>Mylabathula, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+disarms+human+NK-cells+and+inhibits+anti-tumor+cytotoxicity+in+vitro.">Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro.</a> Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+simulated+microgravity+on+primary+human+NK+cells.">Effects of simulated microgravity on primary human NK cells.</a> Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).</li><li>Shao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+effect+of+simulated+microgravity+on+the+cytotoxicity+of+NK+cells+following+the+DNA+methylation+of+NKG2D+and+the+expression+of+DAP10.">Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10.</a> Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).</li><li>Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+attachment-independent+biofilm+formation+and+repression+of+hfq+expression+by+low-fluid-shear+culture+of+Staphylococcus+aureus.">Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).</li><li>Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air+bubble-isolating+rotating+wall+vessel+bioreactor+for+improved+spheroid/organoid+formation.">An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).</li></ol>

Når menneskeheten forbereder seg på lengre romferder til månen og Mars, må det utføres mer forskning for å redusere alvorlige helserisiko hos astronauter. Et viktig aspekt av rommiljøet som påvirker menneskelig fysiologi er mikrogravitasjon. Her er det beskrevet en cellekulturmetode for å utsette lymfocytter for SMG ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig roterende cellekultursystem.
Denne protokollen inneholder noen kritiske trinn som kanskje må optimaliseres, avhengig av celletype...

Romfart har vist seg å påvirke mange aspekter av menneskelig fysiologi, inkludert immunsystemet. Mange studier har vist bevis på immundysregulering som følge av romfart in vivo og eksponering for simulert mikrogravitasjon (SMG) in vitro 1,2,3,4. Et viktig aspekt av rommiljøet som påvirker menneskelig fysiologi er mikrogravitasjon. Mikrogravitasjon refererer til "vektløsheten" som oppleves på grunn av lave gravitasjonskrefter i rommiljøet5. Når menneskeheten forbereder seg på lengre romferder til månen og Mars, må det utføres mer forskning for å redusere alvorlige helserisiko hos astronauter.
Reelle mikrogravitasjonsforhold for vitenskapelig forskning kan oppnås i rommet ombord på Den internasjonale romstasjonen (ISS) eller i nanosatellitter lansert i bane; Imidlertid kan disse alternativene være utrolig kostbare og komplekse å orkestrere. Gitt de nåværende begrensningene ved å utføre biologisk forskning i rommet, finnes det flere alternativer for å indusere ekte mikrogravitasjon og SMG på jorden. Det finnes store operasjoner som kan produsere korte perioder med ekte mikrogravitasjon på jorden, inkludert falltårn, parabolsk flyging og lydende raketter. Imidlertid er disse metodene ikke altfor egnet for å studere effekten av mikrogravitasjon på biologiske systemer, hovedsakelig på grunn av deres korte perioder med mikrogravitasjonsbehandling (dvs. sekunder til 20 minutter). Disse metodene er nærmere omtalt andre steder 5,6. Alternativer som er egnet for biologisk cellekultur inkluderer småskala enheter som 2D klinostater eller roterende veggfartøy (RWV) enheter og 3D klinostater eller tilfeldige posisjoneringsmaskiner (RPM). Disse enhetene kan settes opp i cellekulturinkubatorer opprettholdt ved 37 ° C og 5% CO2, og de roterer cellekulturen enten på en horisontal akse (2D) eller på to vinkelrette akser (3D) 5. Det er imidlertid viktig å understreke at disse dyrkingsmetodene produserer SMG i motsetning til ekte mikrogravitasjon, som er mest mulig oppnådd i rommet for biologiske forskningssammenhenger.
Målet med det nåværende papiret er å skissere trinnene for å utsette lymfocytter til SMG ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig RWV-enhet (Table of Materials), som faller under 2D-klinostatklassifiseringen. Selv om det er en generell protokoll tilgjengelig fra produsenten for bruk av denne enheten, har den nåværende artikkelen som mål å dekke feilsøkings- og optimaliseringstrinnene mer detaljert. Denne artikkelen dekker også teorien bak hvordan denne enheten fungerer for å produsere SMG i suspensjonscellekultur, spesielt med lymfocytter. I denne sammenhengen refererer suspensjonscellekultur til celler som vokser fritt i supplerte kulturmedier, uten å feste seg til ytterligere stillas. Mange celletyper dyrkes i suspensjonscellekultur, inkludert lymfocytter. Lymfocytter er celler i immunsystemet, inkludert T, B og Natural Killer (NK) celler, som ligger i lymfoide organer og blodet7.
RWV 2D-klinostaten beskrevet her opererer på prinsippet om tidsgjennomsnittlig gravitasjonsvektornullifikasjon 5,6,8,9, hvorved tyngdevektoren randomiseres gjennom rotasjon av cellekulturen på en horisontal akse. Dette oppnås ved å matche rotasjonshastigheten til kulturbeholderen til cellens sedimentasjonshastighet. Så lenge rotasjonshastigheten til kulturbeholderen er godt tilpasset cellens sedimenteringshastighet, holdes cellene i fritt fall og ute av stand til å sedimentere, slik det oppleves i rommiljøet. Etter en innledende fartsfase når mediet i kulturbeholderen til slutt "solid kroppsrotasjon" over tid. Denne horisontale rotasjonen induserer også laminær strømning i cellekulturbeholderen. Dette skaper et "lavskjær" miljø, gitt at skjærspenningen indusert på cellene ved laminær strømning er mye mindre enn den turbulente strømningen. Men gitt at klinostaten ikke er et perfekt system, er det noen små, laminære væskebevegelser introdusert, noe som påfører minimal skjærspenning på cellene. Som sådan blir cellene suspendert i media dratt med av denne strømmen under rotasjon. Under horisontal rotasjon virker tyngdekraftvektoren på cellene og bringer dem inn i en oscillerende bane, som visualisert i figur 1. En annen liten kilde til skjærspenning er forårsaket av at cellene "faller" gjennom mediet, forårsaker laminær strøm rundt cellene. Når kulturbeholderen roterer på en horisontal akse, roterer tyngdekraftvektoren som cellene opplever, også. Over tid er denne roterende tyngdevektoren gjennomsnittlig for å nærme seg null; dette fenomenet kalles tidsgjennomsnittlig gravitasjonsvektornullifikasjon og induserer en tilstand på SMG 5,6,8,9. Denne enheten har blitt brukt til å studere effekten av SMG på mange typer celler, hvorav noen er dekket i referanser10,11,12. Du finner flere eksempler på enhetsprodusentens nettsted.
Denne RWV-enheten bruker spesialiserte "high aspect ratio vessels" (HARVs) tilgjengelig gjennom enhetsprodusenten. Disse HARVene holder 10 ml cellekultur hver; Imidlertid er 50 ml HARV også tilgjengelig. Enten 10 ml eller 50 ml HARV kan brukes, avhengig av hvor mange celler som trengs for å fullføre eventuelle nedstrøms eksperimentelle analyser, som er skissert nærmere i diskusjonsdelen. HARV-ene er laget av polykarbonat og inkluderer en silikonoksygeneringsmembran for å tillate gassutveksling under cellekultur. Dette opprettholder pH-verdien i cellemediet og muliggjør effektiv cellulær respirasjon. Det er en hovedfyllingsport og to kappede sprøyteporter på forsiden av fartøyet (figur 2A). Etter lasting av cellekulturen gjennom hovedfyllingsporten, lastes to sprøyter på fartøyet for å hjelpe til med boblefjerning. Ved bruk av 10 ml kar fungerer to 3 ml sprøyter godt. En sprøyte er festet til enheten tom, med sprøyten helt nedtrykt, og den andre er festet fylt med 3 ml cellekultur (figur 2E). Disse brukes i kombinasjon for å fjerne bobler fra karet, noe som er viktig for å opprettholde SMG-behandlingen. Generelt anbefales det å sette opp to negative kontroller, som kan refereres til som "Kolbe" -kontrollen og "1G" -kontrollen. "Kolbe" -kontrollen tilsvarer celler som dyrkes i en standard T25 suspensjonscellekulturkolbe. 1G-kontrollen tilsvarer celler som dyrkes i det spesialiserte 10 ml kulturfartøyet, som ganske enkelt plasseres i inkubatoren (dvs. uten å bli utsatt for SMG-behandlingen). Se diskusjonsdelen for mer informasjon om kontroller.
Metoden beskrevet her passer for enhver forsker som ønsker å studere effekten av SMG på lymfocytter, med et spesifikt fokus på NK-celler ved hjelp av NK92-cellelinjen13. Resultatene fra disse studiene kan hjelpe oss med å bedre forstå og redusere de negative effektene av romfart på det menneskelige immunsystemet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td>Gamma sterilized culture vessels (4/box)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok tip syringes (3 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>For attaching to the 10 mL HARVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92 Cell-line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4D</td>
			<td>Rotating wall vessel device; 2D clinostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 suspension culture flasks</td>
			<td>Sarsedt</td>
			<td>83.3910.502</td>
			<td>For flask control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system

Gitt de nåværende begrensningene ved å utføre biologisk forskning i rommet, finnes det noen alternativer for å utsette cellekultur for simulert mikrogravitasjon (SMG) på jorden. Disse alternativene varierer i deres metoder, prinsipper og egnethet for bruk med suspensjonscellekultur. Her beskrives en cellekulturmetode for å utsette lymfocytter for simulert mikrogravitasjon ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig roterende cellekultursystem, også kjent som en 2D-klinostat eller en roterende veggbeholder (RWV) -enhet. Denne cellekulturmetoden benytter prinsippet om tidsgjennomsnittlig gravitasjonsvektornullifisering for å simulere mikrogravitasjon ved å rotere cellene på en horisontal akse. Cellene dyrket i dette systemet kan høstes og benyttes i mange forskjellige eksperimentelle analyser for å vurdere effekten av simulert mikrogravitasjon på cellulær funksjon og fysiologi. Dyrkingsteknikken kan variere noe avhengig av celletype eller linje som brukes, men metoden beskrevet her kan brukes på enhver suspensjonstype cellekultur.

Denne dyrkingsmetoden anses som vellykket hvis 1) spredningen av cellene er omtrent konsistent på tvers av kontrollgruppene (og ideelt sett alle eksperimentelle grupper), 2) spredningen er hensiktsmessig gitt såtettheten, behandlingslengden og doblingstiden til celletypen / linjen, og 3) levedyktigheten til de høstede cellene er 85% eller høyere (tabell 1 ). Ideelt sett bør de resulterende cellene være så sunne som de ville være i standard cellekultur, spesielt for bruk i etterfølgende eksperime...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

Dette er en trinnvis veiledning for bruk av et kommersielt tilgjengelig roterende cellekultursystem for å dyrke lymfocytter i simulert mikrogravitasjon ved bruk av spesialiserte engangskulturbeholdere. Denne dyrkingsmetoden kan anvendes på enhver suspensjon-type cellekultur.

Dyrking av lymfocytter i simulert mikrogravitasjon ved hjelp av et roterende cellekultursystem

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

Denne teknikken lar oss studere effekten av simulert mikrogravitasjon på immunceller for å hjelpe oss bedre å forstå hvordan aspekter av rommiljøet påvirker menneskelig fysiologi på molekylært nivå. Denne teknikken er økonomisk gjennomførbar og er relativt enkel å sette opp og vedlikeholde sammenlignet med å sende cellekultur til verdensrommet eller andre metoder for å utsette cellekultur for simulert mikrogravitasjon på jorden. Det anbefales å gå sakte mens du fyller fartøyene for å unngå overløp og søl.Etter innledende boblefjerning, sørg for at karene er helt fulle ved å bruke sprøytene. Dette vil minimere sjansene for stor bobledannelse gjennom hele behandlingen. Begynn med å ta dyrkningskarene ut av plastemballasjen.Merk hvert fartøy på felgen i henhold til celletypen eller linjen som brukes, enten det er i kontrollen eller behandlingen, og annen relevant informasjon. Stabiliser beholderen og åpne påfyllingsporten forsiktig uten å berøre påfyllingsportens hetteplugg eller O-ringen. Plasser hetten på en etanolpute med pinnen eller O-ringen vendt opp mens fartøyet er fylt.Ikke fjern hettene fra sprøyteportene. Legg beholderen med 10 ml av passende komplette medier for cellekulturen ved hjelp av en steril serologisk pipet, og plasser hetten forsiktig på fyllporten. Forsikre deg om at sprøyteporthettene og fylleporten er ordentlig lukket.Deretter plasserer du de fylte karene i en inkubator mens du utfører de påfølgende trinnene for å prime karene for cellekultur. Hent medieprimede fartøy fra inkubatoren. For en kolbekontroll, last en T25 suspensjonskulturkolbe med 10 ml cellekultur fra stambestanden tilberedt ovenfor.Tilsett 10 ml stamcellekultur til et separat 15 ml konisk rør, som skal brukes til å fylle sprøytene. Skru av sprøyteporthettene for å fjerne dem fra beholderen og sørg for at stoppekranene er i åpen stilling. Stabiliser beholderen og åpne påfyllingsporten forsiktig uten å berøre påfyllingsportens hetteplugg eller O-ringen.Plasser hetten på en etanolpute med pinnen eller O-ringen vendt opp mens fartøyet fylles. Forsikre deg om at stoppekranene er i åpen stilling. Fartøyet kan tømmes ved å helle mediet fra fartøyet i en avfallsbeholder ved hjelp av en serologisk pipette.Alternativt kan du aspirere mediet ved hjelp av et sterilt glass forbi pipetten som er festet til et vakuumsystem. Når du bruker en pipette eller vakuumsystemet, må du ikke berøre oksygeneringsmembranen, da dette kan skade den og gjøre beholderen ubrukelig. Lukk det 50 ml koniske røret som inneholder den tilberedte stamcellekulturen tett, og snu det forsiktig et par ganger for å blande innholdet grundig.Trekk opp 10 ml cellekulturlager fra 50 ml røret med en ny, steril serologisk pipette. Ta opp fartøyet og vipp det, slik at fyllingsporten er mot toppen. Dispenser deretter cellekulturbeholdningen forsiktig inn i karet gjennom fyllporten.Fyll fartøyet helt til spissen av påfyllingsporten, mens du vipper fartøyet ned igjen for å unngå søl. Vær forsiktig så du ikke berører oksygeneringsmembranen med pipetten, da den er svært skjør. Når fartøyet er lastet, setter du forsiktig på påfyllingsporthetten igjen uten å berøre O-ringen.Ta den første 3 ml sprøyten ut av pakningen og pump den et par ganger for å løsne den. Fest deretter sprøyten til en av sprøyteportene, og pass på at sprøyten er trykket helt inn. Lukk det kjegleformede 15 ml kjegleformede røret som inneholder 10 ml alikotcellekultur, og snu det forsiktig opp ned noen ganger for å blande innholdet grundig.Fjern også den andre sprøyten på 3 ml fra pakningen og pump den noen ganger. Deretter forsiktig halvt nedsenket denne sprøyten i cellekulturen fra 15 ml konisk rør og trekke opp litt kultur. Minimer luftbobler ved å putte sprøyten helt tilbake i slangen og trekke opp 3 ml kultur.Fest den fylte sprøyten til den gjenværende sprøyteporten, og desinfiser sprøytene forsiktig og rundt fylleporten med en etanolpute. Ikke få etanol på oksygeneringsmembranen. Gjenta prosessen for de gjenværende fartøyene.Hvis det er litt utilstrekkelig cellekultur igjen i det 50 ml koniske røret for det siste fartøyet, gjenvinn den gjenværende mengden fra det 15 ml koniske røret som brukes til å laste sprøytene. Sørg for at stoppekranene i sprøyteporten er lukket for å begrense migrasjonen av celler og bobler fra sprøytene inn i karene. Snu fartøyet opp ned og treff den siden et par ganger for å samle de første boblene.Snu fartøyet raskt tilbake til ansiktet oppover, og deretter i en liten vinkel vendt bort, slik at boblene flyter til oppsiden av fartøyet. Manøvrer boblene under porten med den tomme sprøyten, og se dem begynne å komme inn i havnen. Åpne begge sprøyteportstoppekranene.Slå forsiktig på beholderen for å oppmuntre boblene til å flyte opp i den tomme sprøyten. Sug langsomt opp de større boblene med den tomme sprøyten mens du forsiktig trykker inn hele sprøyten for å opprettholde trykket i beholderen, slik at oksygeneringsmembranen ikke sprekker. Gjenta denne prosessen noen ganger for å sikre at alle boblene fjernes.Når boblene er effektivt fjernet, lukker du sprøyteportstoppekranene. Behold sprøytene på under behandlingen for å muliggjøre påfølgende boblefjerning, slik at volumet i begge sprøytene er tilnærmet likt. Tørk forsiktig av overflaten på den roterende basen og båndkabelen med 70 % etanol.Kontroller at båndkabelen er koblet til strømforsyningen. Plasser den roterende basen i inkubatoren, og fest båndkabelen til basen. Plasser strømforsyningen i nærheten, men utenfor inkubatoren.Fest SMG-behandlingsbeholderen ved å stille opp fartøyets gjenger til den roterende pinnen og forsiktig vri den roterende pinnen på basen mot klokken. Forsikre deg om at fartøyet er festet sikkert. Oppretthold inkubatoren ved ca. 100% fuktighet ved å fylle vannbrettet med autoklav RO-vann.Juster inkubatorens rotasjonshastighet for å matche sedimenteringshastigheten til cellene, slik at cellene ikke faller gjennom mediet. På den første behandlingsdagen, sjekk for bobledannelse med noen timers mellomrom som beskrevet i tekstmanuskriptet. Fjern boblene minst en gang om dagen fremover til slutten av ønsket behandlingslengde.Når den planlagte behandlingslengden er utløpt, stopp rotasjonen og demonter apparatet. Fjern behandlingsbeholderen ved å holde beholderen forsiktig stasjonær mens du dreier den roterende pinnen på enheten med urviseren. Ta kontrollkolben, kontrollen og det behandlede fartøyet inn i et sterilt biologisk sikkerhetsskap.Ta hvert fartøy unntatt kontrollkolben og snu den, slik at den vender nedover. Deretter slår du den forsiktig for å bringe alle cellene til suspensjon. Snu deretter fartøyet på siden med fylleporten mot bunnen, og slå den igjen for å lede cellene mot fyllingsporten for effektiv aspirasjon.Håndter hvert fartøy individuelt. Skru av sprøytene fra de to portene og dispenser dem i biologisk farlig avfall. Åpne stoppekranene på sprøyteportene.Fjern forsiktig påfyllingsporthetten og trekk opp innholdet med en steril 10 ml serologisk pipette, og vipp beholderen når den tømmes. Dispenser innholdet i alle kontroll- og behandlingsgruppene i individuelt merkede 15 ml koniske rør. Lukk hvert rør og snu dem forsiktig noen ganger for å sikre at de er riktig blandet.Bruk den foretrukne metoden for å bestemme konsentrasjonen og levedyktigheten til den resulterende cellekulturen for å forberede seg på påfølgende eksperimentelle analyser. NK-92-cellelinjens startlevedyktighet og setetetthet ble sammenlignet med den resulterende sluttlevedyktigheten og sluttkonsentrasjonene. Etter en 72-timers SMG-behandling ble to forekomster av negative og positive resultater sammenlignet.Til sammenligning var det optimale konsentrasjonsområdet for NK-92-cellelinjen som ble brukt mellom 0, 3 og 1, 2 millioner celler per milliliter med en doblingstid på rundt to til tre dager. Spredning i SMG-behandlingsgruppen var omtrent lik på tvers av kontroll- og behandlingsgruppene. Disse parametrene var avgjørende for nedstrøms eksperimentell suksess, og de resulterende cellene fra de to kontrollgruppene utførte tilsvarende i nedstrøms eksperimentelle analyser.Det er avgjørende å overvåke og ta hensyn til bobledannelse gjennom hele behandlingsforløpet, spesielt i cellekulturen som utsettes for simulert mikrogravitasjon. Stor bobledannelse kan forårsake forstyrrelser i væskedynamikken i fartøyet, og dette vil i hovedsak den simulerte mikrogravitasjonstilstanden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primær Neuron Kultur System for studier av herpes simplex virus ventetid og reaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Dyrking Microglia fra Neonatal og voksne sentralnervesystemet

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

Isolasjon og Th17 Differensiering av naive CD4 T-lymfocytter

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Vurdere Medfødt Sensing av HIV-1 infiserte CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler ved Plasmacytoid dendrittiske celler ved hjelp av en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Visualisering av IL-22-uttrykke lymfocytter Bruke Reporter Mus

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Molekylær diffusjon i plasmamembraner Primære lymfocytter målt ved fluorescens korrelasjon spektroskopi

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infeksiøs Cell Culture System og<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylaktisk Effekt av Interferon

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Rapid Kvantifisering av Mitogen-indusert blastogenese i T-lymfocytter for Identifisere Immunmodulerende legemidler

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolere lymfocytter fra musen liten Intestinal immunsystemet

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Rensing av High Yield ekstracellulære vesicle preparater bort fra virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...