Name: differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic beta-cell precursors in a 2d culture system
Uploaded: 2021-12-16T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041).

Lo studio è stato approvato dal comitato etico di ricerca istituzionale competente ed eseguito seguendo gli standard etici stabiliti nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e nei suoi successivi emendamenti o standard etici comparabili. Il protocollo è stato approvato dall'Institutional Review Board (IRB) di HMC (n. 16260/16) e dal Qatar Biomedical Research Institute (QBRI) (n. 2016-003). Questo lavoro è ottimizzato per hESC come H1, H9 e HUES8. I campioni di sangue sono stati ottenuti da individui sani dall'ospedale...

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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+human+induced+pluripotent+stem+cell+line+(QBRIi009-A)+from+a+patient+with+a+heterozygous+deletion+of+FOXA2.">Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2.</a> Stem Cell Research. 42, 101705 (2020).</li><li>Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior-posterior+patterning+of+definitive+endoderm+generated+from+human+embryonic+stem+cells+depends+on+the+differential+signaling+of+retinoic+acid,+Wnt-,+and+BMP-signaling.">Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling.</a> Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).</li><li>Schroeder, I. 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Questo lavoro descrive un protocollo avanzato per la generazione di progenitori pancreatici da hPSC con un'elevata co-espressione di PDX1 e NKX6.1. La dissociazione e la riplaccatura dell'endoderma derivato da hPSC a metà densità sulla matrice fresca hanno portato a PDX1 e NKX6.1 più elevati nei progenitori pancreatici derivati da hPSC.
Sebbene il cocktail di fattori di crescita per ogni stadio sia molto simile a P1-ND 27, è stato dimostrato che un trattamento più esteso dello stadio 3 ch...

Il diabete è una malattia metabolica complessa che colpisce milioni di persone in tutto il mondo. L'integrazione di insulina è considerata l'unica opzione di trattamento per il diabete. I casi più avanzati sono trattati con la terapia sostitutiva delle cellule beta, ottenuta attraverso il trapianto di pancreas cadaverico intero o isole 1,2. Diverse questioni circondano la terapia dei trapianti, come la limitazione della disponibilità e della qualità del tessuto, l'invasività delle procedure di trapianto oltre alla continua necessità di immunosoppressori. Ciò richiede la necessità di scoprire opzioni nuove e alternative per la terapia sostitutiva delle cellule beta 2,3. Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono recentemente emerse come uno strumento promettente per comprendere la biologia del pancreas umano e come fonte non esaustiva e potenzialmente più personalizzata per la terapia dei trapianti 4,5,6,7. Le hPSC, comprese le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC), hanno un'elevata capacità di autorinnovamento e danno origine a qualsiasi tipo di tessuto del corpo umano. Le hESCs sono derivate dalla massa cellulare interna dell'embrione e le hiPSC sono riprogrammate da qualsiasi cellula somatica 4,8.
I protocolli di differenziazione diretta sono ottimizzati per generare cellule beta pancreatiche da hPSC che dirigono sequenzialmente le hPSC attraverso gli stadi di sviluppo pancreatici in vitro. Questi protocolli generano organoidi di isole derivati da hPSC. Mentre sono notevolmente migliorati nell'aumentare la proporzione di cellule beta pancreatiche al loro interno, l'efficienza dei protocolli è altamente variabile. Non aumenta a più di ~ 40% delle cellule NKX6.1 + / INSULIN + o C-PEPTIDE + 5,9,10,11,12,13. Tuttavia, le cellule beta generate non sono del tutto identiche alle cellule beta umane adulte in termini di profili trascrizionali e metabolici e della loro risposta al glucosio 4,5,14. Le cellule beta derivate da hPSC mancano di espressione genica di marcatori chiave delle cellule beta come PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 e KCNK3 rispetto alle isole 5 dell'uomoadulto. Inoltre, le cellule beta derivate da hPSC hanno diminuito la segnalazione del calcio in risposta al glucosio. Sono contaminati dalle cellule poliormonali co-generate che non secernono quantità appropriate di insulina in risposta all'aumento dei livelli di glucosio5. D'altra parte, i progenitori pancreatici derivati da hPSC, che sono precursori delle isole, potrebbero essere generati in modo più efficiente in vitro rispetto alle cellule beta e, una volta trapiantati in vivo, potrebbero maturare in cellule beta funzionali che secernono insulina15,16. Gli studi clinici sono attualmente focalizzati sulla dimostrazione della loro sicurezza ed efficacia dopo il trapianto in soggetti T1D.
In particolare, l'espressione dei fattori di trascrizione PDX1 (Pancreatic and Duodenal Homeobox 1) e NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) all'interno della stessa cellula progenitrice pancreatica è cruciale per l'impegno verso una linea cellulare beta5. I progenitori pancreatici che non riescono ad esprimere NKX6.1 danno origine a cellule endocrine poliormonali o cellule beta non funzionali17,18. Pertanto, un'elevata co-espressione di PDX1 e NKX6.1 nello stadio progenitore pancreatico è essenziale per generare un gran numero di cellule beta funzionali. Gli studi hanno dimostrato che un corpo embrioide o una coltura 3D migliora PDX1 e NKX6.1 nei progenitori pancreatici in cui le cellule differenzianti sono aggregate, variando tra il 40% -80% della popolazione PDX1+/NKX6.1+12,19. Tuttavia, rispetto alle colture in sospensione, le colture di differenziazione 2D sono più economiche, fattibili e convenienti per l'applicazione su più linee cellulari5. Abbiamo recentemente dimostrato che le colture di differenziazione monostrato producono più del 90% di PDX1+/NKX6.1+ co-espressione dei progenitori pancreatici derivati da hPSC20,21,22. Il metodo riportato ha conferito un'elevata capacità di replicazione ai progenitori pancreatici generati e ha impedito specifiche di destino alternativo come la linea epatica21. Pertanto, questo protocollo dimostra un metodo altamente efficiente per la differenziazione delle hPSCs in precursori delle cellule beta pancreatiche che co-esprimono PDX1 e NKX6.1. Questo metodo utilizza la tecnica di dissociazione dell'endoderma derivato da hPSC e manipolazione della densità cellulare, seguita da una segnalazione estesa di FGF e retinoidi, nonché dall'inibizione di Hedgehog per promuovere la co-espressione di PDX1 e NKX6.1 (Figura 1). Questo metodo può facilitare una generazione scalabile di precursori delle cellule beta pancreatiche derivate da hPSC per la terapia dei trapianti e la modellizzazione della malattia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL, conical, centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Tween 20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plates, flat bottom with lid</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL, conical, centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6- well culture plates, multidish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>0-7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>338-AC</td>
			<td>Reconstituted in 4 mM HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F55A12-C</td>
			<td>Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab47308</td>
			<td>Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 minus Vit A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR 99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td>Reconstituted in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>41965047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td></td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td>Reconstituted in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>345-FG</td>
			<td>Reconstituted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>23491-45-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F-12 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut SR serum replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid (vitamin C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A92902</td>
			<td>Reconstituted in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Aliquot the thawed stock and freeze at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB131</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10372019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SOX17</td>
			<td>ORIGENE</td>
			<td>CF500096</td>
			<td>Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 &#176;C for longer time or at 4 &#176;C for instant use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene filter units, 0.2 &#181;m PES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td>Reconstituted in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOGGIN</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td>Reconstituted in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable vacuum aspirator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-FOXA2</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3143</td>
			<td>Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Reconstituted in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>ReproCell</td>
			<td>04-0012-02</td>
			<td>Reconstituted in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE</td>
			<td>Stellar Scientific</td>
			<td>FSC-9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SANT-1</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4572</td>
			<td>Reconstituted in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 &#176;C for longer time or at 4 &#176;C for instant use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TALI Cellular Analysis Slide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tali image-based cytometer automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE 100 mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic beta-cell precursors in a 2d culture system

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono uno strumento eccellente per studiare lo sviluppo pancreatico precoce e studiare i fattori genetici che contribuiscono al diabete. Le cellule secernenti insulina derivate da hPSC possono essere generate per la terapia cellulare e la modellizzazione della malattia, tuttavia, con efficienza e proprietà funzionali limitate. I progenitori pancreatici derivati da hPSC che sono precursori delle cellule beta e di altre cellule endocrine, quando co-esprimono i due fattori di trascrizione PDX1 e NKX6.1, specificano i progenitori delle cellule beta funzionali che secernono insulina sia in vitro che in vivo. I progenitori pancreatici derivati da hPSC sono attualmente utilizzati per la terapia cellulare nei pazienti con diabete di tipo 1 come parte di studi clinici. Tuttavia, le procedure attuali non generano un'alta percentuale di NKX6.1 e progenitori pancreatici, portando alla cogenerazione di cellule endocrine non funzionali e poche cellule sensibili al glucosio e secernenti insulina. Questo lavoro ha quindi sviluppato un protocollo avanzato per la generazione di progenitori pancreatici derivati da hPSC che massimizzano la co-espressione di PDX1 e NKX6.1 in un monostrato 2D. I fattori come la densità cellulare, la disponibilità di matrice fresca e la dissociazione delle cellule endodermiche derivate da hPSC sono modulati che hanno aumentato i livelli di PDX1 e NKX6.1 nei progenitori pancreatici generati e ridotto al minimo l'impegno ad alternare la linea epatica. Lo studio evidenzia che la manipolazione dell'ambiente fisico della cellula durante la differenziazione in vitro può influire sulla specificazione del lignaggio e sull'espressione genica. Pertanto, l'attuale protocollo ottimizzato facilita la generazione scalabile di progenitori co-espressivi PDX1 e NKX6.1 per la terapia cellulare e la modellazione della malattia.

I risultati mostrano che il protocollo ottimizzato P2-D (Figure 1A) ha migliorato l'efficienza di differenziazione dei progenitori pancreatici sovraregolando la co-espressione di PDX1 e NKX6.1 (Figura 2A, B e Figura 3A). In particolare, i risultati hanno mostrato che la dissociazione delle cellule endodermiche e il loro replating sulla matrice di membrana fresca insieme a una maggiore durata dello stadio 3 hanno mig...

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Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

Il presente protocollo descrive un metodo potenziato per aumentare la co-espressione dei fattori di trascrizione PDX1 e NKX6.1 nei progenitori pancreatici derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in monostrati planari. Ciò si ottiene reintegrando la matrice fresca, manipolando la densità cellulare e dissociando le cellule endodermiche.

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in precursori di cellule beta pancreatiche in un sistema di coltura 2D

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

Questo protocollo ottimizzato ha migliorato la generazione di precursori delle cellule beta pancreatiche da cellule staminali pluripotenti umane, che possono essere utilizzate per la terapia cellulare per il diabete e lo studio dei meccanismi molecolari alla base della biogenesi del diabete. Questa è una tecnica fattibile in quanto viene utilizzata per le colture monostrato 2D. È facile da applicare ed è coerente tra più linee di cellule staminali pluripotenti di controllo e derivate dal paziente.Questi precursori delle cellule beta trapiantati in un paziente diabetico possono maturare in cellule beta che secernono insulina e possono potenzialmente invertire l'iperglicemia. Pertanto, l'aumento delle percentuali di progenitori pancreatici generati utilizzando il nostro protocollo può essere utilizzato per la terapia cellulare per il diabete. Questo protocollo avanzato può essere utilizzato per studiare lo sviluppo pancreatico umano precoce in individui sani e in pazienti diabetici, il che è difficile a causa della carenza di campioni di tessuto.Quando le cellule staminali pluripotenti umane o le colonie di hPSC hanno raggiunto il 70-80% di confluenza, lavarle due volte con PBS caldo all'interno del cappuccio di coltura tissutale. Quindi aspirare il tampone utilizzando un aspiratore a vuoto portatile. Quindi, aggiungere il mezzo di differenziazione dello stadio uno contenente CHIR-99021 alle colonie e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 24 ore.Il giorno successivo, sostituire il supporto esaurito con il mezzo di differenziazione della fase uno senza CHIR-99021. Dopo aver aspirato il mezzo esaurito e lavato due volte le cellule dell'endoderma definitivo con PBS caldo, ruotare la piastra per rimuovere eventuali detriti cellulari. Quindi fissare le celle aggiungendo il 4% di paraformaldeide e posizionare la piastra su uno shaker bidimensionale.Dopo la fissazione, lavare le celle con soluzione salina tamponata TRIS contenente 0,5% Tween e posizionare la piastra sullo shaker. Quindi permeabilizzare le celle fisse aggiungendo una generosa quantità di PBS contenente lo 0,5% di Triton X-100 e riposizionare la piastra sullo shaker. Quindi, aggiungere tampone bloccante appena preparato alle cellule permeabilizzate e incubare la piastra per un'ora sullo shaker.Quindi aggiungere anticorpi primari diluiti alle cellule bloccate e posizionare la piastra sullo shaker a quattro gradi Celsius con un leggero scuotimento. Il giorno seguente dopo aver aspirato la soluzione di anticorpi primari, lavare i pozzetti tre volte con TBST per 10 minuti ciascuno sullo shaker. Quindi, aggiungi gli anticorpi secondari.Coprire la piastra con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce e posizionare la piastra sullo shaker a temperatura ambiente per un'ora. Quindi aspirare la soluzione anticorpale secondaria e lavare i pozzetti macchiati con TBST sullo shaker per 10 minuti, mantenendo la piastra coperta con un foglio. Successivamente, per colorare i nuclei, aggiungere la soluzione di Hoechst ai pozzetti e posizionare la piastra sullo shaker.Dopo due o tre minuti, aspirare la soluzione di Hoechst e sciacquare i pozzetti due volte con PBS. Infine, aggiungi PBS alle cellule colorate e visualizzale usando un microscopio a fluorescenza invertita al buio. Il primo giorno della seconda fase, dissociare le cellule endodermiche derivate da hPSC lavandole prima con PBS caldo e quindi aggiungendo un millilitro di soluzione enzimatica calda per pozzetto di una piastra a sei pozzetti.Posizionare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre-cinque minuti o fino a quando le cellule iniziano a staccarsi l'una dall'altra. Dissociare i fogli staccati o il monostrato di cellule nei pozzetti e raccogliere le celle staccate insieme in un tubo di polipropilene da 15 millilitri utilizzando il mezzo media dello stadio basale. Quindi ruotare le cellule verso il basso, scartare il surnatante e risospendere il pellet usando un millilitro di PBS sterile.Dopo aver contato le celle usando un contatore automatico, ruotare di nuovo le celle e scartare il surnatante. Quindi risospendere il pellet nel volume appropriato del mezzo di differenziazione dello stadio due contenente un inibitore di Rock. Placcare le cellule risospese su una a 50 piastre rivestite di matrice di membrana e incubarle a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.Dopo 24 ore, sostituire il mezzo con il mezzo di differenziazione di fase due senza l'inibitore di Rock. Alla fine della quarta fase, staccare le cellule come dimostrato in precedenza e raccoglierle in un tubo da 15 millilitri. Quindi ruotare le cellule, scartare il surnatante, lavare le cellule con PBS e dissociarle in singole cellule.Dopo aver contato le celle utilizzando un contatore automatico delle celle, ruotare nuovamente le celle e risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS refrigerato. Quindi, aggiungere due millilitri di etanolo refrigerato all'80% a goccia con il tubo su un vortice impostato a velocità medio-bassa. Chiudere saldamente il tappo e posizionare il tubo leggermente inclinato sullo shaker a quattro gradi Celsius durante la notte.Il giorno dopo, girare le cellule e lavare il pellet con PBS per dissociare eventuali grumi di cellule fisse. Quindi bloccare le celle fisse per almeno un'ora a temperatura ambiente o quattro gradi Celsius durante la notte sullo shaker. Successivamente, per colorare i marcatori progenitori pancreatici, distribuire 200.000 cellule per condizione, compresi i controlli isotipi appropriati, i controlli anticorpali non colorati e secondari in una piastra inferiore a V a 96 pozzetti.Quindi ruotare brevemente la piastra e capovolgere la piastra con un movimento rapido per scartare il surnatante senza perdere i pellet. Quindi, incubare le cellule negli anticorpi primari per almeno due ore a temperatura ambiente su uno shaker con un leggero scuotimento. Quindi lavare le cellule macchiate tre volte con TBST pipettando su e giù nei pozzetti.Centrifugare nuovamente le cellule, scartare il surnatante e aggiungere anticorpi secondari alle cellule. Dopo un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente, lavare le cellule macchiate due volte con TBST. Quindi ruotare la piastra, raccogliere le cellule colorate in 100 microlitri di PBS in tubi fax protetti dalla luce ed eseguire i campioni su una macchina per citometria a flusso.Rispetto al metodo non ottimizzato, il protocollo ottimizzato ha migliorato l'efficienza di differenziazione dei progenitori pancreatici aumentando la co-espressione di PDX 1 e NKX 6.1. In particolare, la dissociazione delle cellule endodermiche e il loro replating sulla matrice di membrana fresca, insieme a una maggiore durata del terzo stadio, hanno migliorato l'espressione di NKX 6.1 nei progenitori pancreatici derivati da hPSC rispetto al protocollo non dissociato. I progenitori pancreatici generati utilizzando il protocollo ottimizzato hanno anche aumentato il numero di cellule SOX9 positive rispetto al metodo non dissociato.Inoltre, il metodo ottimizzato ha anche generato una percentuale maggiore di cellule proliferative NKX 6.1 positive che hanno co-espresso il marcatore di proliferazione Ki67. Al fine di migliorare l'efficienza, è fondamentale dissociare l'endoderma derivato da HbA1 e quindi estendere la durata del trattamento di fase tre con segnalazione dell'amiloide FGF e inibizione di Hedgehog. La generazione scalabile di progenitori pancreatici utilizzando questo protocollo avanzato ha facilitato gli studi sul miglioramento dell'efficienza e della maturazione delle cellule beta pancreatiche derivate da cellule staminali pluripotenti umane e ha permesso la modellazione di diversi tipi di diabete.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Coltura umane pluripotenti e neurali cellule staminali in un sistema di coltura cellulare chiuso per base e preclinica di ricerca

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Differenziazione efficiente delle pluripotenti cellule staminali per NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; progenitori pancreatici

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differenziazione delle cellule staminali mesenchimali umane in funzionale del Cardiomyocyte-come le cellule

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Differenziazione diretta di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Isolamento delle cellule staminali mesenchimali del tessuto adiposo di ratto per la differenziazione in cellule produttrici di insulina

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...