Name: differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic beta-cell precursors in a 2d culture system
Uploaded: 2021-12-16T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System at JoVE.com

이 연구는 카타르 국립 연구 기금 (QNRF) (보조금 번호. NPRP10-1221-160041).

이 연구는 적절한 기관 연구 윤리위원회의 승인을 받았으며 1964 년 헬싱키 선언 및 이후 개정안 또는 유사한 윤리 기준에 명시된 윤리적 기준에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 HMC (no. 16260/16) 및 카타르 생물 의학 연구소 (QBRI) (no. 2016-003)의 기관 검토위원회 (IRB)의 승인을 받았습니다. 이 작업은 H1, H9 및 HUES8과 같은 hESC에 최적화되어 있습니다. 혈액 샘플은 충분한 정보에 입각 한 동의하에 Hama...

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이 연구는 PDX1 및 NKX6.1의 높은 공동 발현을 갖는 hPSC로부터 췌장 전구 세포를 생성하기위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 신선한 매트릭스에서 절반 밀도에서 hPSC 유래 내배엽의 해리 및 재 도금은 hPSC 유래 췌장 전구 세포에서 더 높은 PDX1 및 NKX6.1을 초래했습니다.
각 단계에 대한 성장 인자 칵테일은 P1-ND 27과 매우 유사하지만, FGF 및 레티노이드 신호 전달 및 BMP 및 고슴도치...

당뇨병은 전 세계적으로 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 복잡한 대사 장애입니다. 인슐린 보충은 당뇨병의 유일한 치료 옵션으로 간주됩니다. 더 진행된 경우는 전체 사체 췌장 또는 섬 1,2의 이식을 통해 달성되는 베타 세포 대체 요법으로 치료됩니다. 이식 요법을 둘러싼 몇 가지 문제, 예를 들어 조직의 가용성 및 질에 대한 제한, 면역 억제제에 대한 지속적인 필요성 외에도 이식 절차의 침습성. 이를 위해서는 베타 세포 대체 요법 2,3에 대한 새롭고 대안적인 옵션을 발견 할 필요가 있습니다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)는 최근 인간 췌장 생물학을 이해하기위한 유망한 도구로 부상했으며 이식 요법 4,5,6,7을위한 완전하지 않고 잠재적으로 개인화 된 소스로 부상했습니다. 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)를 포함한 hPSC는 높은 자체 재생 능력을 가지며 인체의 모든 조직 유형을 생성합니다. hESC는 배아의 내부 세포 덩어리에서 파생되고 hiPSC는 모든 체세포 4,8에서 재 프로그래밍됩니다.
지시 분화 프로토콜은 시험관 내에서 췌장 발달 단계를 통해 hPSC를 순차적으로 지시하는 hPSC로부터 췌장 베타 세포를 생성하도록 최적화됩니다. 이러한 프로토콜은 hPSC 유래 췌도 오가노이드를 생성합니다. 그들은 그 안에 췌장 베타 세포의 비율을 증가시키는 데 크게 향상되었지만 프로토콜의 효율성은 매우 다양합니다. NKX40+/인슐린+ 또는 C-펩타이드+ 세포 5,9,10,11,12,13의 ~5,9% 이상으로 증가하지 않습니다. 그러나, 생성 된 베타 세포는 전사 및 대사 프로파일 및 포도당 4,5,14에 대한 반응 측면에서 성인 인간 베타 세포와 완전히 동일하지 않다. hPSC 유래 베타 세포는 성인 인간 섬5에 비해 PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 및 KCNK3와 같은 주요 베타 세포 마커의 유전자 발현이 부족합니다. 또한 hPSC 유래 베타 세포는 포도당에 대한 반응으로 칼슘 신호 전달을 감소시켰습니다. 그들은 포도당 수준 증가에 반응하여 적절한 양의 인슐린을 분비하지 않는 공동 생성 된 다 호르몬 세포로 오염됩니다5. 한편, 췌도 전구체인 hPSC 유래 췌장 전구체는 베타 세포에 비해 시험관 내에서 더 효율적으로 생성될 수 있고, 생체 내에 이식되면 기능적인 인슐린 분비 베타 세포(15,16)로 성숙할 수 있다. 임상 시험은 현재 T1D 피험자의 이식시 안전성과 효능을 입증하는 데 중점을두고 있습니다.
특히, 동일한 췌장 전구 세포 내에서 전사 인자 PDX1 (췌장 및 십이지장 호메오 박스 1) 및 NKX6.1 (NKX6 호메오 박스 1)의 발현은 베타 세포 계통5에 대한 헌신에 결정적이다. NKX6.1을 발현하지 못하는 췌장 전구 세포는 다 호르몬 내분비 세포 또는 비 기능성 베타 세포17,18을 생성합니다. 따라서, 췌장 전구 단계에서 PDX1과 NKX6.1의 높은 동시 발현은 궁극적으로 다수의 기능적 베타 세포를 생성하는 데 필수적이다. 연구에 따르면 배아 체 또는 3D 배양은 분화 세포가 응집되는 췌장 전구 세포에서 PDX1 및 NKX6.1을 향상 시키며 PDX1 + / NKX6.1+ 인구의 40 % -80 % 사이에서 다양합니다12,19. 그러나 현탁 배양에 비해 2D 분화 배양은 더 비용 효율적이고 실현 가능하며 여러 세포주에 적용하기에 편리합니다5. 우리는 최근에 단층 분화 배양이 hPSC 유래 췌장 전구 세포 20,21,22를 공동 발현하는 PDX1+/NKX6.1+ 동시 발현의 최대90% 이상을 산출한다는 것을 보여주었습니다. 보고된 방법은 생성된 췌장 전구체에 높은 복제 능력을 부여하고 간 계통21과 같은 대체 운명 사양을 방지했습니다. 따라서, 본원에서, 이 프로토콜은 hPSCs를 PDX1 및 NKX6.1을 공동-발현하는 췌장 베타-세포 전구체로 분화시키기 위한 매우 효율적인 방법을 입증한다. 이 방법은 hPSC 유래 내배엽을 해리하고 세포 밀도를 조작한 다음 확장된 FGF 및 레티노이드 신호 전달과 고슴도치 억제를 통해 PDX1 및 NKX6.1 동시 발현을 촉진하는 기술을 활용합니다(그림 1). 이 방법은 이식 요법 및 질병 모델링을 위한 hPSC 유래 췌장 베타-세포 전구체의 확장가능한 생성을 촉진할 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL, conical, centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Tween 20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plates, flat bottom with lid</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL, conical, centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6- well culture plates, multidish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>0-7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>338-AC</td>
			<td>Reconstituted in 4 mM HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F55A12-C</td>
			<td>Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab47308</td>
			<td>Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 minus Vit A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR 99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td>Reconstituted in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>41965047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td></td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td>Reconstituted in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>345-FG</td>
			<td>Reconstituted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>23491-45-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F-12 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut SR serum replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid (vitamin C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A92902</td>
			<td>Reconstituted in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Aliquot the thawed stock and freeze at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB131</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10372019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SOX17</td>
			<td>ORIGENE</td>
			<td>CF500096</td>
			<td>Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 &#176;C for longer time or at 4 &#176;C for instant use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene filter units, 0.2 &#181;m PES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td>Reconstituted in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOGGIN</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td>Reconstituted in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable vacuum aspirator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-FOXA2</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3143</td>
			<td>Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Reconstituted in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>ReproCell</td>
			<td>04-0012-02</td>
			<td>Reconstituted in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE</td>
			<td>Stellar Scientific</td>
			<td>FSC-9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SANT-1</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4572</td>
			<td>Reconstituted in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 &#176;C for longer time or at 4 &#176;C for instant use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TALI Cellular Analysis Slide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tali image-based cytometer automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE 100 mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic beta-cell precursors in a 2d culture system

인간 만능 줄기 세포 (hPSC)는 초기 췌장 발달을 연구하고 당뇨병의 유전 적 기여자를 조사하기위한 훌륭한 도구입니다. hPSC 유래 인슐린 분비 세포는 세포 치료 및 질병 모델링을 위해 생성될 수 있지만, 제한된 효율성 및 기능적 특성을 갖는다. 베타 세포 및 기타 내분비 세포의 전구체인 hPSC 유래 췌장 전구세포는 두 전사 인자 PDX1 및 NKX6.1을 동시 발현할 때 시험관 내 및 생체 내 모두에서 기능적인 인슐린 분비 베타 세포에 대한 전구세포를 지정합니다. hPSC 유래 췌장 전구 세포는 현재 임상 시험의 일환으로 제1형 당뇨병 환자의 세포 치료에 사용됩니다. 그러나 현재의 절차는 NKX6.1 및 췌장 전구 세포의 높은 비율을 생성하지 않아 비 기능성 내분비 세포의 공동 생성과 포도당 반응성, 인슐린 분비 세포가 거의 없습니다. 따라서 이 연구는 2D 단층에서 PDX1과 NKX6.1의 동시 발현을 최대화하는 hPSC 유래 췌장 전구세포를 생성하기 위한 향상된 프로토콜을 개발했습니다. 세포 밀도, 신선한 기질의 가용성 및 hPSC 유래 내배엽 세포의 해리와 같은 요인이 조절되어 생성된 췌장 전구 세포에서 PDX1 및 NKX6.1 수준을 증가시키고 대체 간 계통에 대한 헌신을 최소화합니다. 이 연구는 시험관 내 분화 중에 세포의 물리적 환경을 조작하는 것이 계통 사양 및 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있음을 강조합니다. 따라서, 현재 최적화된 프로토콜은 세포 치료 및 질병 모델링을 위한 PDX1 및 NKX6.1 공동-발현 전구세포의 스케일러블한 생성을 용이하게 한다.

결과는 최적화된 프로토콜 P2-D(그림 1A)가 PDX1 및 NKX6.1 동시 발현을 상향조절하여 췌장 전구체 분화 효율성을 향상시켰음을 보여줍니다(그림 2A, B 및 그림 3A). 특히, 결과는 내배엽 세포의 해리와 새로운 막 기질에서의 재 도금이 이전에 발표 된 연구에서 수정 된 비 해리 프로토콜 (P1-ND)과 비교하여 hPSC 유래 췌장 전구 ...

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Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

본 프로토콜은 평면 단일층에서 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로부터 유래된 췌장 전구세포에서 PDX1 및 NKX6.1 전사 인자의 동시 발현을 증가시키는 향상된 방법을 기술한다. 이것은 신선한 매트릭스를 보충하고, 세포 밀도를 조작하고, 내배엽 세포를 해리시킴으로써 달성됩니다.

2D 배양 시스템에서 인간 만능줄기세포를 췌장 베타세포 전구체로 분화

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

이 최적화된 프로토콜은 인간 만능 줄기 세포로부터 췌장 베타 세포 전구체의 생성을 향상시켰으며, 이는 당뇨병에 대한 세포 치료 및 당뇨병 생물 발생을 강조하는 분자 메커니즘 조사에 사용될 수 있습니다. 이것은 2D 단층 배양에 사용되므로 실현 가능한 기술입니다. 적용하기 쉽고 여러 대조군 및 환자 유래 만능 줄기 세포주에서 일관됩니다.이러한 베타 세포 전구체는 당뇨병 환자에게 이식될 때 인슐린 분비 베타 세포로 성숙할 수 있으며 잠재적으로 고혈당증을 역전시킬 수 있습니다. 따라서, 우리의 프로토콜을 사용하여 생성 된 췌장 전구 세포의 증가 된 비율은 당뇨병에 대한 세포 치료에 사용될 수 있습니다. 이 향상된 프로토콜은 조직 샘플 부족으로 인해 어려운 당뇨병 환자뿐만 아니라 건강한 개인의 초기 인간 췌장 발달을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.인간 다 능성 줄기 세포 또는 hPSC 콜로니가 70-80 % 합류에 도달하면 조직 배양 후드 내부의 따뜻한 PBS로 두 번 씻으십시오. 그런 다음 휴대용 진공 흡인기를 사용하여 버퍼를 흡입합니다. 다음으로, CHIR-99021을 함유하는 1단계 분화 배지를 콜로니에 첨가하고, 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양한다.다음날, 사용한 배지를 CHIR-99021이 없는 1단계 분화 배지로 교체하십시오. 사용한 배지를 흡인하고 최종 내배엽 세포를 따뜻한 PBS로 두 번 세척한 후 플레이트를 소용돌이쳐 세포 파편을 제거합니다. 그런 다음 4% 파라포름알데히드를 추가하여 세포를 고정하고 플레이트를 2차원 셰이커에 놓습니다.고정 후, 0.5% Tween을 함유하는 TRIS 완충 식염수로 세포를 세척하고, 플레이트를 쉐이커에 놓는다. 그런 다음 0.5% Triton X-100을 포함하는 넉넉한 양의 PBS를 추가하여 고정된 세포를 투과시키고 플레이트를 셰이커에 다시 놓습니다. 다음으로, 새로 준비된 차단 완충액을 투과화된 세포에 첨가하고, 플레이트를 진탕기 상에서 1시간 동안 인큐베이션한다.그런 다음 희석 된 1 차 항체를 차단 된 세포에 넣고 부드럽게 흔들면서 섭씨 4도에서 셰이커에 플레이트를 놓습니다. 다음날 1차 항체 용액을 흡인한 후 웰을 TBST로 셰이커에서 각각 10분 동안 3회 세척합니다. 다음으로 2 차 항체를 추가하십시오.빛으로부터 보호하기 위해 접시를 알루미늄 호일로 덮고 접시를 실온에서 1시간 동안 셰이커에 놓습니다. 그런 다음 2 차 항체 용액을 흡인하고 플레이트를 호일로 덮은 상태로 쉐이커에서 TBST로 염색 된 웰을 10 분 동안 세척합니다. 다음으로, 핵을 염색하기 위해, Hoechst 용액을 웰에 첨가하고 플레이트를 셰이커에 놓습니다.2-3 분 후, Hoechst 용액을 흡인하고 PBS로 웰을 두 번 헹굽니다. 마지막으로 염색된 세포에 PBS를 추가하고 어두운 곳에서 도립 형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영합니다. 2단계 첫째 날, hPSC 유래 내배엽 세포를 먼저 따뜻한 PBS로 세척한 다음 6웰 플레이트의 웰당 따뜻한 효소 용액 1밀리리터를 추가하여 해리합니다.플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3-5분 동안 또는 세포가 서로 분리되기 시작할 때까지 놓습니다. 웰에서 분리 된 시트 또는 단층의 세포를 해리하고 기저 단계 하프 배지를 사용하여 15 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브에서 분리 된 세포를 함께 수집합니다. 그런 다음 세포를 스핀다운하고 상청액을 버리고 1밀리리터의 멸균 PBS를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.자동 카운터를 사용하여 세포를 계수한 후 세포를 다시 회전시키고 상청액을 버립니다. 그런 다음 암석 억제제를 함유하는 적절한 부피의 2단계 분화 배지에 펠릿을 재현탁시킨다. 재현탁된 세포를 1 내지 50개의 멤브레인 매트릭스 코팅된 플레이트에 플레이팅하고 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 배양한다.24시간 후, 암석 억제제가 없는 2단계 분화 배지로 배지를 교체합니다. 4 단계가 끝나면 앞에서 설명한대로 세포를 분리하고 15 밀리리터 튜브에 수집합니다. 그런 다음 세포를 회전시키고 상청액을 버리고 PBS로 세포를 씻고 단일 세포로 해리시킵니다.자동 세포 카운터를 사용하여 세포를 계수한 후 세포를 다시 회전시키고 200마이크로리터의 냉각된 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 다음으로, 2 밀리리터의 냉각 된 80 % 에탄올을 저속에서 중간 속도로 설정된 와류에 튜브와 함께 현명하게 떨어 뜨립니다. 캡을 단단히 닫고 셰이커에 약간 기울어진 튜브를 섭씨 4도에서 밤새 놓습니다.다음날 세포를 회전시키고 PBS로 펠릿을 세척하여 고정 된 세포 덩어리를 해리시킵니다. 그런 다음 고정 된 셀을 실온 또는 섭씨 4도에서 밤새 적어도 1 시간 동안 쉐이커에서 차단하십시오. 다음으로, 췌장 전구체 마커에 대한 염색을 위해, 적절한 이소타입 대조군, 염색되지 않은, 및 2차 항체 대조군을 포함하는 조건당 200, 000개의 세포를 96 웰 V 바닥 플레이트에 분배한다.그런 다음 플레이트를 짧게 돌리고 빠른 동작으로 플레이트를 뒤집어 펠릿을 잃지 않고 상청액을 버립니다. 다음으로, 세포를 1차 항체 중 실온에서 적어도 2시간 동안 진탕기에서 부드럽게 진탕하면서 배양한다. 그런 다음 염색된 세포를 웰에서 위아래로 피펫팅하여 TBST로 3회 세척합니다.세포를 다시 원심분리하고, 상청액을 버리고, 세포에 2차 항체를 첨가한다. 실온에서 30분간 배양한 후, 염색된 세포를 TBST로 2회 세척하였다. 그런 다음 플레이트를 회전시키고 염색된 세포를 100 마이크로리터의 PBS로 빛보호된 팩스 튜브에 수집하고 유세포분석 기계에서 샘플을 실행합니다.최적화되지 않은 방법과 비교하여 최적화된 프로토콜은 PDX 1 및 NKX 6.1 동시 발현을 상향조절하여 췌장 전구체 분화 효율을 향상시켰습니다. 특히, 내배엽 세포의 분리와 신선한 막 기질에서의 재 도금은 3 단계의 더 긴 지속 시간과 함께 비 해리 프로토콜에 비해 hPSC 유래 췌장 전구 세포에서 NKX 6.1 발현을 향상 시켰습니다. 최적화된 프로토콜을 사용하여 생성된 췌장 전구세포는 또한 해리되지 않은 방법에 비해 SOX9 양성 세포의 수를 증가시켰습니다.또한, 최적화된 방법은 또한 증식 마커 Ki67을 동시 발현하는 증식성 NKX 6.1 양성 세포의 더 높은 비율을 생성하였다. 효율성을 높이기 위해서는 HbA1 유래 내배엽을 해리시킨 다음 FGF 아밀로이드 신호 전달 및 고슴도치 억제로 3 단계 치료 기간을 연장하는 것이 중요합니다. 이 향상된 프로토콜을 사용하여 확장 가능한 췌장 전구 세포의 생성은 인간 다 능성 줄기 세포 유래 췌장 베타 세포의 효율성과 성숙을 개선하는 연구를 촉진하고 다양한 유형의 당뇨병을 모델링 할 수있었습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

기본 및 전임상 연구 밀폐 세포 배양 시스템에서 인간 다 능성 및 신경 줄기 세포를 배양

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

연구

발생학

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

인슐린 생성 세포로 분화를 위한 쥐 지방조직 중간엽 줄기세포의 분리

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...