Name: robust differentiation of human ipscs into a pure population of adipocytes to study adipocyte-associated disorders
Uploaded: 2022-02-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من خلال منحة من الصندوق القطري لرعاية البحث العلمي (رقم المنحة NPRP10-1221-160041). حصلت مريم أغادي على منحة دراسية من GSRA من الصندوق القطري لرعاية البحث العلمي (QNRF).

تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات البحث المؤسسي المناسبة وتم إجراؤها وفقا للمعايير الأخلاقية على النحو المنصوص عليه في إعلان هلسنكي لعام 1964 وتعديلاته اللاحقة أو المعايير الأخلاقية المماثلة. وتمت الموافقة على البروتوكول من قبل مجلس المراجعة المؤسسية التابع لمؤسسة حمد الطبية...

<ol>
	<li>Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+populations+and+sources+of+human+mesenchymal+stem+cells+(MSC):+A+comparison+of+adult+and+neonatal+tissue-derived+MSC.">Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).</li><li>Wagner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+replicative+senescence+have+related+effects+on+human+stem+and+progenitor+cells.">Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells.</a> PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).</li><li>Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+evaluation+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+bone+marrow.">Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow.</a> Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).</li><li>Trivedi, P., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+immunological+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells.</a> Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).</li><li>Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+multipotent+mesenchymal+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells.</a> PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).</li><li>Xiong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+adipocytes+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).</li><li>Cuaranta-Monroy, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+adipocytes+by+ascorbic+acid.">Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).</li><li>van Harmelen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+lipolytic+regulation+in+human+embryonic+stem+cell-derived+adipocytes.">Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes.</a> Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).</li><li>Noguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+and+engraftment+of+adipocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells.">In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).</li><li>Ahfeldt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+human+pluripotent+stem+cells+into+white+and+brown+adipocytes.">Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes.</a> Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).</li><li>Lee, Y. K., Cowan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+white+and+brown+adipocytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).</li><li>Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+different+types+of+diabetes+using+human+pluripotent+stem+cells.">Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).</li><li>Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+as+a+potential+tool+for+disease+modelling+and+cell+therapy+in+diabetes.">Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).</li><li>Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Generation+of+mesenchymal+stem+cells+and+adipocytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li><li>Karam, M., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+highly+efficient+protocol+for+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mesenchymal+stem+cells.">Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , (2020).</li><li>Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+E-cadherin+and+other+cell+adhesion+molecules+in+survival+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 6 (1), 59-70 (2012).</li><li>Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+endothelial+cell+proliferation+during+vasculogenesis.">Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis.</a> Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).</li><li>Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans+retinoic+acid+inhibits+proliferation+of+intestinal+epithelial+cells+by+inhibiting+expression+of+the+gene+encoding+Kruppel-like+factor+5.">All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5.</a> FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).</li><li>di Masi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+receptors:+from+molecular+mechanisms+to+cancer+therapy.">Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy.</a> Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).</li><li>Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+retinoic+acid+receptor+signaling+coordinates+lineage+commitment+of+spontaneously+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells+in+embryoid+bodies.">Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies.</a> FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).</li><li>De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+retinoic+acid+treatment+sustains+pluripotency+and+suppresses+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (1), 6 (2018).</li><li>Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lats1/2-mediated+alteration+of+hippo+signaling+pathway+regulates+the+fate+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).</li><li>Moldes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome-proliferator-activated+receptor+gamma+suppresses+Wnt/beta-catenin+signalling+during+adipogenesis.">Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis.</a> The Biochemical Journal. 376, 607-613 (2003).</li><li>Ross, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+adipogenesis+by+Wnt+signaling.">Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling.</a> Science. 289 (5481), 950-953 (2000).</li><li>Wang, Y. K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+and+mechanical+stimulation+in+the+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation.">Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).</li><li>Mohsen-Kanson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+brown+and+white+adipocytes:+role+of+Pax3.">Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3.</a> Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).</li><li>Billon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest.">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li><li>Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neural+crest+cell+fate+by+the+retinoic+acid+and+Pparg+signalling+pathways.">Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways.</a> Development. 137 (3), 389-394 (2010).</li><li>Ussar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASC-1,+PAT2,+and+P2RX5+are+cell+surface+markers+for+white,+beige,+and+brown+adipocytes.">ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes.</a> Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).</li><li>Festy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+protein+expression+between+human+adipose+tissue-derived+stromal+cells+and+mature+adipocytes.">Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).</li><li>Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptor+CD36+expression+contributes+to+adipose+tissue+inflammation+and+cell+death+in+diet-induced+obesity.">Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity.</a> PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).</li><li>Mesuret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+role+of+the+Alanine-Serine-Cysteine-1+transporter+(SLC7A10,+Asc-1)+for+glycine+inhibitory+transmission+and+respiratory+pattern.">A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).</li><li>Silverstein, R. L., Febbraio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36,+a+scavenger+receptor+involved+in+immunity,+metabolism,+angiogenesis,+and+behavior.">CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior.</a> Science Signaling. 2 (72), (2009).</li><li>Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+roles+of+decay-accelerating+factor,+membrane+cofactor+protein,+and+CD59+in+the+protection+of+human+endothelial+cells+against+complement-mediated+lysis.">Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis.</a> European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).</li><li>Davies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD59,+an+LY-6-like+protein+expressed+in+human+lymphoid+cells,+regulates+the+action+of+the+complement+membrane+attack+complex+on+homologous+cells.">CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).</li><li>Lapid, K., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form(ul)ation+of+adipocytes+by+lipids.">Form(ul)ation of adipocytes by lipids.</a> Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).</li><li>Aldridge, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+validation+for+the+assessment+of+adipogenesis+of+multipotential+stromal+cells--a+direct+comparison+of+four+different+methods.">Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods.</a> Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).</li><li>Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+sort+ESC-derived+adipocytes.">A simple method to sort ESC-derived adipocytes.</a> Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).</li><li>Costa, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cells+from+natural+niches+to+culture+conditions:+implications+for+further+clinical+uses.">Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).</li></ol>

يحمل هذا البروتوكول أهمية قصوى نظرا لقدرته على توفير MSCs بإنتاجية وكفاءة عالية. أصبح هذا الإنتاج الضخم ل MSCs ممكنا من خلال الحضانة العابرة ل EBs المشتقة من iPSCs مع 10 ميكرومتر من RA14,15. عززت المعالجة العابرة ب 10 ميكرومتر من التهاب المفاصل الروماتويدي عائد MSC بمقدار ...

تعمل الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) كمورد انتقالي فعال لإنتاج خلايا من أصل الأديم المتوسط مثل الخلايا الشحمية والخلايا العظمية والخلايا الغضروفية ، والتي يمكن استخدامها بشكل أكبر لنمذجة الاضطرابات الوراثية الخاصة بكل منها. ومع ذلك ، اعتمدت الأساليب السابقة على الحصول على هذه MSCs من الأنسجة البالغة 1 ، مما فرض التحدي المتمثل في الحصول عليها بأعداد كبيرة من المتبرعين ، والحد من إبقائها قابلة للحياة وظيفيا في ظروف الزراعة المختبرية دون المستوى الأمثل 1,2. أنتجت هذه العقبات طلبا كبيرا على وجود بروتوكول لتوليد MSCs في المختبر. يمكن استخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) كمصدر قيم ل MSCs ، حيث تظهر خصائص MSC3،4،5. يمكن استخدام MSCs المشتقة من iPSCs كخيار علاجي في العديد من الأمراض. أيضا ، فإن قدرة MSCs المشتقة من iPSCs على توليد الخلايا الشحمية ، تجعلها نموذجا بشريا قيما في المختبر لدراسة تكوين الدهون البشرية والسمنة والاضطرابات المرتبطة بالخلايا الشحمية.
يمكن تصنيف بروتوكولات التمايز الحالية للخلايا الشحمية إلى مجموعتين ، إحداهما تتضمن تمايز الخلايا الشحمية باستخدام الكوكتيلات الكيميائية أو البروتينية التي تعطي عائدا ناتجا بنسبة 30٪ -60٪ 6،7،8،9 ، بينما تتضمن الأخرى التلاعب الجيني لتحريض قوي لعوامل النسخ الرئيسية التي تحكم تطور الخلايا الشحمية لإعطاء عائد 80٪ -90٪ 10 ، 11. ومع ذلك ، فإن التلاعب الجيني لا يلخص العملية الطبيعية لتمايز الخلايا الشحمية ، وغالبا ما يخفي النماذج الدقيقة التي تصل أثناء تكوين الدهون ، مما يجعلها غير فعالة لأغراض نمذجة المرض12،13. لذلك ، نقدم طريقة لفرز الخلايا الشحمية الناضجة المشتقة كيميائيا من الخلايا الشحمية غير الناضجة عن طريق وضع علامات على الخلايا الشحمية الحاملة للدهون باستخدام أحمر النيل.
نقدم هنا بروتوكولا يتضمن الحضانة العابرة للأجسام الجنينية المشتقة من iPSCs (EBs) مع حمض الريتينويك المتحولة بالكامل لإنتاج عدد كبير من MSCs سريعة التكاثر ، والتي يمكن استخدامها بشكل أكبر لتوليد الخلايا الشحمية14. نقدم أيضا طريقة لفرز الخلايا الشحمية الناضجة المشتقة كيميائيا من مجموعة التمايز غير المتجانسة عن طريق وضع علامات على قطرات الدهون الخاصة بها باستخدام صبغة محبة للدهون. أحمر النيل. وهذا من شأنه أن يسمح بتوليد مجموعة نقية من الخلايا الشحمية الناضجة مع وظائف محسنة لنمذجة الاضطرابات الأيضية المرتبطة بالخلايا الشحمية بدقة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adiponectin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22554</td>
			<td>Adipocyte maturation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD105</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>560839</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561712</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD19</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555415</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555824</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD44</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab93758</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td> 
			560975</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD73</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550256</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD90</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555596</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>233-FP</td>
			<td>MSC culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C/EBPA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40761</td>
			<td>Adipocyte maturation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Torics</td>
			<td>1126</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FABP4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab93945</td>
			<td>Adipocyte maturation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td>MSC culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>MSC culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Basal media for preparing matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11885084</td>
			<td>MSC culturing media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Coating matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-alpha</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12561056</td>
			<td>Adipocyte differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nilered</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>19123</td>
			<td>Sorting marker for adipocyte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MSC/Adipocyte media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; 20X TBS Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28358</td>
			<td>wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPARG</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2443</td>
			<td>Adipocyte maturation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>Dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>MSC differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254/10</td>
			<td>hPSC culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roziglitazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A334901</td>
			<td>hPSC culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28314</td>
			<td>Permebealization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7942</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust differentiation of human ipscs into a pure population of adipocytes to study adipocyte-associated disorders

سمحت التطورات الحديثة في تقنية الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) بتوليد أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الشحمية. ومع ذلك ، فإن طرق التمايز الحالية لها كفاءة منخفضة ولا تنتج مجموعة متجانسة من الخلايا الشحمية. هنا ، نتحايل على هذه المشكلة باستخدام طريقة قائمة على الريتينويك بالكامل لإنتاج الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) ذات العائد العالي. من خلال تنظيم المسارات التي تحكم تكاثر الخلايا وبقائها والالتصاق ، تسمح استراتيجية التمايز الخاصة بنا بالتوليد الفعال للأجسام الجنينية (EBs) التي تتمايز إلى مجموعة نقية من MSCs متعددة القدرات. يوفر العدد الكبير من MSCs الناتجة عن هذه الطريقة مصدرا مثاليا لتوليد الخلايا الشحمية. ومع ذلك ، لا يزال عدم تجانس العينة الناتج عن تمايز الخلايا الشحمية يمثل تحديا. لذلك ، استخدمنا طريقة تعتمد على أحمر النيل لتنقية الخلايا الشحمية الناضجة الحاملة للدهون باستخدام FACS. سمحت لنا استراتيجية الفرز هذه بإنشاء طريقة موثوقة لنمذجة الاضطرابات الأيضية المرتبطة بالخلايا الشحمية باستخدام مجموعة من الخلايا الشحمية مع تقليل عدم تجانس العينة وتحسين وظائف الخلية.

تخطيط ومورفولوجيا الخلايا أثناء تمايز اللحمة المتوسطة: يتضمن تمايز iPSCs إلى MSCs مراحل مختلفة من التطور تمتد عبر تكوين EB وتمايز MSC وتوسيع MSC (الشكل 1). خلال هذه المراحل من التطور ، تكتسب الخلايا مورفولوجيا مختلفة بسبب المواد الكيميائية المحفزة المختلفة التي تتعرض لها. عند بدء ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders at JoVE.com

Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders

يسمح البروتوكول بتوليد مجموعة من الخلايا الشحمية النقية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs). يستخدم حمض الريتينويك للتمييز بين الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى خلايا جذعية وسيطة (MSCs) تستخدم لإنتاج الخلايا الشحمية. بعد ذلك ، يتم استخدام نهج الفرز على أساس تلطيخ النيل الأحمر للحصول على الخلايا الشحمية النقية.

تمايز قوي ل iPSCs البشرية إلى مجموعة نقية من الخلايا الشحمية لدراسة الاضطرابات المرتبطة بالخلايا الشحمية

Recent advances in induced pluripotent stem cell (iPSC) technology have allowed the generation of different cell types, including adipocytes. However, the ...

اعتمدت الأساليب السابقة على طرق شديدة التوغل للحصول على الخلايا الجذعية الوسيطة في المختبر ، ولكن تلك الخلايا الجذعية الوسيطة كان لها قيود على إنتاج مجموعة غير متجانسة من 30٪ بكفاءة تتراوح من 30 إلى 60٪ هنا ، نقدم بروتوكولا لإنتاج عدد كبير من الخلايا الجذعية الوسيطة سريعة التكاثر والتي يمكن أن تنتج مجموعة نقية من الخلايا الشحمية الناضجة عن طريق الفرز باستخدام أحمر النيل. عندما تصل iPSCs إلى التقاء 80٪ ، اغسل الخلايا باستخدام DPBS وأضف وسط تفكك يحتوي على EDTA. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.بعد دقيقة واحدة ، قم بشفط كاشف التفكك وضع الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إضافية. بعد ذلك ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة. أضف ملليلتر واحد من وسائط StemFlex لكل بئر واجمع الخلايا بعناية في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر.أجهزة الطرد المركزي الخلايا. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليقها برفق في ثلاثة ملليلتر من وسائط تمايز MSC التي تحتوي على 10 ميكرومول من مثبط الصخور. امزج تعليق الخلية ووزع 500 ميكرولتر لكل بئر في لوحة تثبيت منخفضة للغاية تبلغ 24 بئرا.ثم ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية. بعد 24 ساعة ، لحث الأجسام الجنينية التي تم الحصول عليها ، قم بجمعها في أنبوب سعة 15 ملليلتر واتركها تستقر. بعد 15 دقيقة ، قم بإزالة المادة الطافية وإضافة وسيط تمايز MSC المكمل بحمض الريتينويك 10 ميكرومولار.أعد تعليق الأجسام الجنينية برفق وقم بتوزيع 500 ميكرولتر لكل بئر في نفس لوحة التثبيت المنخفضة للغاية المكونة من 24 بئرا. ثم ضع اللوحة في الحاضنة. بعد 48 ساعة ، اجمع الأجسام الجنينية في أنبوب سعة 15 ملليلتر واتركها تستقر لمدة 15 دقيقة.ثم قم بإزالة المادة الطافية وإضافة وسيط تمايز MSC المكمل بحمض الريتينويك 0.1 ميكرومولار. بعد تعليق الأجسام الجنينية ، قم بتوزيع 500 ميكرولتر لكل بئر في نفس اللوحة المكونة من 24 بئرا وضع اللوحة في الحاضنة. بعد ثمان وأربعين ساعة من آخر علاج بحمض الريتينويك ، اجمع الأجسام الجنينية ، وأزل المادة الطافية ، وأضف وسط DMEM منخفض الجلوكوز بدون السيتوكينات.أعد تعليق وتوزيع 500 ميكرولتر من تعليق الخلية برفق لكل بئر في نفس لوحة التثبيت المنخفضة للغاية المكونة من 24 بئرا ، ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية. بعد 48 ساعة ، لطلاء الأجسام الجنينية المشتقة من iPSC ، اجمع الأجسام الجنينية في أنبوب سعة 15 ملليلتر ، واسمح لها بالاستقرار ، ثم قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليقها في ملليلتر من وسط تمايز MSC الجديد. بعد ذلك ، قم بنقل التعليق إلى بئرين من صفيحة ستة آبار مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية.بعد خمسة أيام ، استبدل الوسائط المستهلكة بوسط تمايز MSC جديد يحتوي على 2.5 نانوجرام لكل ملليلتر من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي واستمر في تمايز MCS لمدة تصل إلى 11 و 15 يوما. عندما تصل الأجسام الجنينية المطلية إلى التقاء 80 إلى 90٪ ، قم بتمريرها عن طريق الغسيل باستخدام DPBS ، وإضافة Trypsin-EDTA ، وتحضينها عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. أخرج التربسين-EDTA من الطبق واحتضانه مرة أخرى عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.بعد ذلك ، أضف وسائط ملليلتر واحدة لكل بئر. بعد ثلاث دقائق ، اجمع الخلايا باستخدام وسائط تمايز MSC في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر وطرد مركزي للخلايا. ثم أعد تعليق الخلايا في وسط تمايز MSC يحتوي على عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي وقم بطلاء الخلايا على ألواح مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي بنسبة واحد إلى ثلاثة.بعد أن تصل MSCs إلى التقاء 90٪ ، استمر في زراعتها لمدة 48 ساعة أخرى للسماح لها بالخضوع لفترة من توقف النمو. ثم قم بإزالة الوسيط وغسل الخلايا باستخدام DBPS. بعد الغسيل ، أضف وسط تمايز الخلايا الشحمية الكامل إلى اللوحة واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية.قم بتغيير الوسيط كل يوم لمدة 14 يوما. التفريق بين MSCs المشتقة من iPSC إلى خلايا دهنية. لفرز الخلايا الشحمية باستخدام أحمر النيل ، قم بإعداد محلول عمل أحمر النيل في DMSO كما هو موضح في مخطوطة النص.قبل الاستخدام ، قم بإذابة محلول المخزون وإعادة تكوينه في DPBS للوصول إلى تركيز محلول عمل 300 نانومولار. في أو بعد اليوم 14 من تمايز الخلايا الشحمية ، تخلص من الوسط من الخلايا واغسله باستخدام DPBS. ثم أضف حل العمل الأحمر النيل.غطي اللوحة واحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية. بعد 15 دقيقة ، استبدل محلول النيل الأحمر ب Trypsin-EDTA واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة أربع دقائق. ثم اجمع الخلايا باستخدام DMEM التي تحتوي على 5٪ FBS في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي للخلايا.قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في DPBS بكثافة 1 مليون خلية لكل ملليلتر. ثم باستخدام فارز FACS ، اعزل الخلايا الموجبة لأحمر النيل باستخدام قناة FL-1. اجمع الخلايا التي تم فرزها وأعد زراعتها في وسائط تمايز الخلايا الشحمية أو انتقل إلى استخراج الحمض النووي الريبي متبوعا بالتحليل الكمي لعلامات تمايز الخلايا الشحمية.عند بدء التمايز ، تكون الخلايا المطلية بالتعليق مستديرة ذات حدود خلية محددة وقطرها صغير إلى متوسط الحجم. ويلاحظ بقاء الأجسام الجنينية من خلال سلوك الانتشار السريع الذي يؤدي إلى ظهور المزيد من MSCs. يتم الاحتفاظ بسلوك الانتشار السريع هذا ، جنبا إلى جنب مع مورفولوجيتها الغريبة والممدودة ، حتى بعد تمرير MSCs على ألواح جديدة مغلفة بالمصفوفة.ينتج عن التمايز الجيد MSCs موثوقة بكفاءة تعبير تزيد عن 90٪ لعلامات سطح اللحمة المتوسطة CD73 و CD44 و CD90. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر تقييم الخلايا لعدم وجود علامات سطحية تصور النمط الظاهري المكونة للدم CD14 و CD34 و CD19 كفاءة تعبير أقل من 1٪ ، ويشير التعبير العالي في التوزيع السيتوبلازمي ل FABP4 ، وهو علامة للخلايا الشحمية المتمايزة نهائيا ، إلى نضجها التنموي. بالإضافة إلى ذلك ، يشير التعبير العالي عن الأديبونيكتين ، وهو علامة أخرى لنضج الخلايا الشحمية ، إلى أن الخلايا الشحمية وظيفية بما يكفي للخضوع لتخزين الدهون وتكوين الدهون استجابة لإشارات الجلوكوز.عند التلوين ، يرتبط أحمر النيل حصريا بالخلايا الشحمية الناضجة الحاملة للدهون ، مما يجعله أداة فعالة لفرز الخلايا الشحمية الناضجة باستخدام قياس التدفق الخلوي المنشط بالفلورسنت. تظهر الخلايا الموجبة لأحمر النيل تنظيما كبيرا لعلامات النضج بمقدار ضعفين على الأقل مقارنة بالخلايا غير المصنفة. يجب أن تكون لطيفا جدا أثناء جمع الخلايا أثناء تكوين الجسم الجنيني وتفكك الخلايا الوسيطة لأن ذلك سيؤثر بشكل كبير على كفاءة البقاء على قيد الحياة بعد تفكك الخلايا الجذعية الوسيطة.يمكن إخضاع السكان النقيين للخلايا الشحمية التي تم الحصول عليها من المرضى الحاملين للطفرات لتسلسل وظيفي وكامل للنسخ لتحديد المسارات التنظيمية والإشارات المتأثرة بطفرة معينة دون أن تتأثر البيانات بعدم تجانس العينة. ستسمح هذه التقنية بتوليد خلايا جذعية وسيطة قابلة للتطوير في المختبر ، مما يلغي الحاجة إلى حصادها من المتبرعين البشريين لتمييزها بسهولة إلى الخلايا الشحمية والخلايا الغضروفية والخلايا العظمية لفهم التسبب في الأمراض المرتبطة بالأنسجة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

جيل من الخلايا الجذعية الدهنية لجسم الإنسان من خلال فقد التمايز من الناضجة الخلايا الشحمية في الثقافات السقف

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

التفريق بين الخط خلية SH-SY5Y العصبية الإنسان

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

في المختبر تمايز متعددة القدرات البشرية الخلايا الجذعية إلى خلايا الأرومة الغاذية

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

جيل المستمدة IPSC-Organoids الدماغ البشري لنموذج اضطرابات النمو العصبي في وقت مبكر

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

في المختبر تمايز الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة إلى الفنية كارديوميوسيتي مثل الخلايا

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

قمع الإشارات برو تليفية يقوي التي تعالج بوساطة معامل إعادة برمجة الخلايا الليفية الجنينية الماوس في Cardiomyocytes المستحث

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في خلايا الكبد

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

كفاءه التمايز العصبي باستخدام ثقافة خليه واحده من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

التمايز الموجه للخلايا البطانية الدموية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...