Name: robust differentiation of human ipscs into a pure population of adipocytes to study adipocyte-associated disorders
Uploaded: 2022-02-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi è stata sostenuta dalla borsa di studio GSRA del Qatar National Research Fund (QNRF).

Lo studio è stato approvato dal comitato etico di ricerca istituzionale competente ed eseguito seguendo gli standard etici stabiliti nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e nei suoi successivi emendamenti o standard etici comparabili. Il protocollo è stato approvato dall'Institutional Review Board (IRB) di HMC (n. 16260/16) e QBRI (n. 2016-003). Questo lavoro è ottimizzato anche per hESC come H1 e H9. I campioni di sangue sono stati ottenuti da individui sani con pieno consenso informato. Le iPSC sono generate da c...

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	<li>Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+populations+and+sources+of+human+mesenchymal+stem+cells+(MSC):+A+comparison+of+adult+and+neonatal+tissue-derived+MSC.">Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).</li><li>Wagner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+replicative+senescence+have+related+effects+on+human+stem+and+progenitor+cells.">Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells.</a> PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).</li><li>Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. 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M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+as+a+potential+tool+for+disease+modelling+and+cell+therapy+in+diabetes.">Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).</li><li>Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Generation+of+mesenchymal+stem+cells+and+adipocytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li><li>Karam, M., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+highly+efficient+protocol+for+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mesenchymal+stem+cells.">Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , (2020).</li><li>Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+E-cadherin+and+other+cell+adhesion+molecules+in+survival+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 6 (1), 59-70 (2012).</li><li>Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. 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L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+retinoic+acid+receptor+signaling+coordinates+lineage+commitment+of+spontaneously+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells+in+embryoid+bodies.">Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies.</a> FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).</li><li>De Angelis, M. T., Parrotta, E. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+adipogenesis+by+Wnt+signaling.">Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling.</a> Science. 289 (5481), 950-953 (2000).</li><li>Wang, Y. K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+and+mechanical+stimulation+in+the+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation.">Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).</li><li>Mohsen-Kanson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+brown+and+white+adipocytes:+role+of+Pax3.">Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3.</a> Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).</li><li>Billon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest.">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li><li>Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. 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M., vander Westhuyzen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptor+CD36+expression+contributes+to+adipose+tissue+inflammation+and+cell+death+in+diet-induced+obesity.">Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity.</a> PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).</li><li>Mesuret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+role+of+the+Alanine-Serine-Cysteine-1+transporter+(SLC7A10,+Asc-1)+for+glycine+inhibitory+transmission+and+respiratory+pattern.">A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).</li><li>Silverstein, R. L., Febbraio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36,+a+scavenger+receptor+involved+in+immunity,+metabolism,+angiogenesis,+and+behavior.">CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior.</a> Science Signaling. 2 (72), (2009).</li><li>Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+roles+of+decay-accelerating+factor,+membrane+cofactor+protein,+and+CD59+in+the+protection+of+human+endothelial+cells+against+complement-mediated+lysis.">Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis.</a> European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).</li><li>Davies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD59,+an+LY-6-like+protein+expressed+in+human+lymphoid+cells,+regulates+the+action+of+the+complement+membrane+attack+complex+on+homologous+cells.">CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).</li><li>Lapid, K., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form(ul)ation+of+adipocytes+by+lipids.">Form(ul)ation of adipocytes by lipids.</a> Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).</li><li>Aldridge, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+validation+for+the+assessment+of+adipogenesis+of+multipotential+stromal+cells--a+direct+comparison+of+four+different+methods.">Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods.</a> Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).</li><li>Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+sort+ESC-derived+adipocytes.">A simple method to sort ESC-derived adipocytes.</a> Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).</li><li>Costa, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cells+from+natural+niches+to+culture+conditions:+implications+for+further+clinical+uses.">Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).</li></ol>

Questo protocollo riveste un'importanza fondamentale grazie alla sua capacità di fornire MSC in termini di rendimento ed efficienza elevati. Questa produzione su larga scala di MSC è stata resa possibile dall'incubazione transitoria di EB derivate da iPSCs con 10 μM di RA14,15. Il trattamento transitorio con 10 μM di RA ha aumentato la resa MSC da 11,2 a 1542 volte14,15, con questo protocollo applicab...

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) agiscono come un'efficace risorsa transitoria per la produzione di cellule di origine mesodermica come adipociti, osteociti e condrociti, che potrebbero essere ulteriormente utilizzate per modellare le rispettive malattie genetiche. Tuttavia, gli approcci precedenti si basavano sul raggiungimento di queste MSC da tessuti adulti 1, il che imponeva la sfida di ottenerle in numero elevato dai donatori e la limitazione di mantenerle funzionalmente vitali in condizioni di coltura in vitro non ottimali 1,2. Questi ostacoli hanno prodotto una grande richiesta di avere un protocollo per la generazione di MSC in vitro. Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) possono essere utilizzate come preziosa fonte di MSC, presentando caratteristiche MSC 3,4,5. Le MSC derivate da iPSCs possono essere utilizzate come opzione terapeutica in diverse malattie. Inoltre, la capacità delle MSC derivate da iPSC di generare adipociti, le rende un prezioso modello umano in vitro per studiare l'adipogenesi umana, l'obesità e i disturbi associati agli adipociti.
Gli attuali protocolli di differenziazione degli adipociti possono essere classificati in due gruppi, uno dei quali coinvolge la differenziazione degli adipociti utilizzando cocktail chimici o a base proteica che danno una resa risultante del 30% -60% 6,7,8,9, mentre l'altro che coinvolge la manipolazione genetica per una robusta induzione dei fattori chiave di trascrizione che governano lo sviluppo degli adipociti per ottenere una resa dell'80% -90% 10, 11. Tuttavia, la manipolazione genetica non ricapitola il naturale processo di differenziazione degli adipociti e spesso maschera i sottili paradigmi che arrivano durante l'adipogenesi, rendendola inefficace ai fini della modellizzazione della malattia12,13. Pertanto, presentiamo un modo per ordinare gli adipociti maturi di derivazione chimica da quelli immaturi etichettando in modo fluorescente gli adipociti portatori di lipidi usando il rosso del Nilo.
Qui presentiamo un protocollo che prevede l'incubazione transitoria di corpi embrioidi derivati da iPSCs (EB) con acido retinoico all-trans per produrre un elevato numero di MSC in rapida proliferazione, che potrebbero essere ulteriormente utilizzati per generare adipociti14. Presentiamo anche un modo per ordinare gli adipociti maturi di derivazione chimica dal pool di differenziazione eterogenea etichettando fluorescentmente le loro goccioline lipidiche usando un colorante lipofilo; Rosso Nilo. Ciò consentirebbe la generazione di una popolazione pura di adipociti maturi con funzionalità migliorata per modellare accuratamente i disturbi metabolici associati agli adipociti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adiponectin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22554</td>
			<td>Adipocyte maturation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD105</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>560839</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561712</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD19</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555415</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555824</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD44</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab93758</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td> 
			560975</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD73</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550256</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD90</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555596</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>233-FP</td>
			<td>MSC culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C/EBPA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40761</td>
			<td>Adipocyte maturation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Torics</td>
			<td>1126</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FABP4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab93945</td>
			<td>Adipocyte maturation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td>MSC culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>MSC culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Basal media for preparing matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11885084</td>
			<td>MSC culturing media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Coating matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-alpha</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12561056</td>
			<td>Adipocyte differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nilered</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>19123</td>
			<td>Sorting marker for adipocyte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MSC/Adipocyte media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; 20X TBS Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28358</td>
			<td>wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPARG</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2443</td>
			<td>Adipocyte maturation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>Dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>MSC differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254/10</td>
			<td>hPSC culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roziglitazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A334901</td>
			<td>hPSC culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28314</td>
			<td>Permebealization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7942</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust differentiation of human ipscs into a pure population of adipocytes to study adipocyte-associated disorders

I recenti progressi nella tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) hanno permesso la generazione di diversi tipi di cellule, compresi gli adipociti. Tuttavia, gli attuali metodi di differenziazione hanno una bassa efficienza e non producono una popolazione omogenea di adipociti. Qui, eludiamo questo problema utilizzando un metodo basato sul retinoico completamente trans per produrre cellule staminali mesenchimali (MSC) ad alto rendimento. Regolando i percorsi che regolano la proliferazione, la sopravvivenza e l'adesione cellulare, la nostra strategia di differenziazione consente la generazione efficiente di corpi embrionali (EB) che si differenziano in una popolazione pura di MSC multipotenti. L'elevato numero di MSC generate da questo metodo fornisce una fonte ideale per la generazione di adipociti. Tuttavia, l'eterogeneità del campione derivante dalla differenziazione degli adipociti rimane una sfida. Pertanto, abbiamo utilizzato un metodo a base di rosso del Nilo per purificare gli adipociti maturi portatori di lipidi utilizzando FACS. Questa strategia di selezione ci ha permesso di stabilire un modo affidabile per modellare i disordini metabolici associati agli adipociti utilizzando un pool di adipociti con ridotta eterogeneità del campione e funzionalità cellulare migliorata.

Schema e morfologia delle cellule durante il differenziamento mesenchimale: La differenziazione delle iPSC in MSC coinvolge varie fasi di sviluppo che vanno dalla formazione di EB, alla differenziazione delle MSC e all'espansione delle MSC (Figura 1). Durante queste fasi di sviluppo, le cellule acquisiscono morfologia diversa a causa delle diverse sostanze chimiche stimolatorie a cui sono sottoposte. All'inizio della differenziazione, le celle sono placcate in sospensione e ci si aspetta che...

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Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders

Il protocollo consente la generazione di una popolazione di adipociti puri da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). L'acido retinoico viene utilizzato per differenziare le iPSC in cellule staminali mesenchimali (MSC) utilizzate per la produzione di adipociti. Quindi, viene utilizzato un approccio di selezione basato sulla colorazione rossa del Nilo per ottenere adipociti puri.

Robusta differenziazione delle iPSC umane in una popolazione pura di adipociti per studiare i disturbi associati agli adipociti

Recent advances in induced pluripotent stem cell (iPSC) technology have allowed the generation of different cell types, including adipocytes. However, the ...

Gli approcci precedenti si basavano su metodi altamente invasivi per ottenere cellule staminali mesenchimali in vitro, ma quelle cellule staminali mesenchimali avevano una limitazione di produrre pool eterogenei del 30% con un'efficienza che andava dal 30 al 60% Qui, presentiamo un protocollo per la produzione di un numero elevato di cellule staminali mesenchimali in rapida proliferazione in grado di produrre una popolazione pura di adipociti maturi mediante selezione utilizzando il rosso del Nilo. Quando le iPSC hanno raggiunto l'80% di confluenza, lavare le cellule con DPBS e aggiungere il mezzo di dissociazione contenente EDTA. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per un minuto.Dopo un minuto, aspirare il reagente di dissociazione e posizionare le cellule a 37 gradi Celsius per un ulteriore minuto. Quindi, rimuovere la piastra dall'incubatore. Aggiungere un millilitro di supporto StemFlex per pozzetto e raccogliere con cura le celle in un tubo conico da 15 millilitri.Centrifugare le cellule. Rimuovere il surnatante e risospenderli delicatamente in tre millilitri di mezzi di differenziazione MSC contenenti 10 micromoli di un inibitore della roccia. Mescolare la sospensione cellulare e distribuire 500 microlitri per pozzetto in una piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti.Quindi posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Dopo 24 ore, per indurre i corpi embrionali raggiunti, raccoglierli in un tubo da 15 millilitri e lasciarli sedimentare. Dopo 15 minuti, rimuovere il surnatante e aggiungere il mezzo di differenziazione MSC integrato con acido retinoico micromolare.Risospendere delicatamente i corpi embrionali e distribuire 500 microlitri per pozzetto nella stessa piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti. Quindi posizionare la piastra nell'incubatore. Dopo 48 ore, raccogliere i corpi embrionali in un tubo da 15 millilitri e lasciarli riposare per 15 minuti.Quindi rimuovere il surnatante e aggiungere il mezzo di differenziazione MSC integrato con acido retinoico micromolare 0,1. Dopo aver risospeso i corpi embrionali, distribuire 500 microlitri per pozzetto nella stessa piastra a 24 pozzetti e posizionare la piastra nell'incubatore. Quarantotto ore dopo l'ultimo trattamento con acido retinoico, raccogliere i corpi embrionali, rimuovere il surnatante e aggiungere DMEM a basso contenuto di glucosio senza citochine.Risospendere delicatamente e distribuire 500 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto nella stessa piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius. Dopo 48 ore, per placcare i corpi embrionali derivati da iPSC, raccogliere i corpi embrionali in un tubo da 15 millilitri, lasciarli sedimentare, quindi rimuovere il surnatante e risospendere in due millilitri di terreno di differenziazione MSC fresco. Quindi, trasferire la sospensione in due pozzetti di una piastra a sei pozzetti rivestita di matrice di membrana basale e incubare le cellule a 37 gradi Celsius.Dopo cinque giorni, sostituire il terreno esaurito con un nuovo mezzo di differenziazione MSC contenente 2,5 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita dei fibroblasti di base e continuare la differenziazione MCS per un massimo di 11 e 15 giorni. Quando i corpi embrionali placcati hanno raggiunto l'80-90% di confluenza, passarli lavandoli con DPBS, aggiungendo tripsina-EDTA e incubando a 37 gradi Celsius per un minuto. Rimuovere la tripsina-EDTA dalla piastra e incubare nuovamente a 37 gradi Celsius per un minuto.Quindi, aggiungere un millilitro di supporto per pozzetto. Dopo tre minuti, raccogliere le cellule utilizzando il mezzo di differenziazione MSC in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare le cellule. Quindi risospendere le cellule in un mezzo di differenziazione MSC contenente il fattore di crescita dei fibroblasti di base e placcare le cellule su piastre rivestite di matrice di membrana basale in un rapporto da uno a tre.Dopo che le MSC hanno raggiunto il 90% di confluenza, continuare a coltivarle per altre 48 ore per consentire loro di subire un periodo di arresto della crescita. Quindi rimuovere il mezzo e lavare le celle con DBPS. Dopo il lavaggio, aggiungere un mezzo completo di differenziazione degli adipociti alla piastra e incubare le cellule a 37 gradi Celsius.Cambia il mezzo a giorni alterni per 14 giorni. Differenziare le MSC derivate da iPSC in adipociti. Per ordinare gli adipociti usando il rosso del Nilo, preparare la soluzione di lavoro rosso del Nilo in DMSO come descritto nel manoscritto di testo.Prima dell'uso, scongelare la soluzione madre e ricostituirla in DPBS per ottenere una concentrazione di soluzione di lavoro di 300 nanomolari. Al giorno 14 o dopo la differenziazione degli adipociti, eliminare il terreno dalle cellule e lavare utilizzando DPBS. Quindi aggiungere la soluzione di lavoro rosso Nilo.Coprire la piastra e incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Dopo 15 minuti, sostituire la soluzione di rosso del Nilo con tripsina-EDTA e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per quattro minuti. Quindi raccogliere le cellule utilizzando DMEM contenente il 5% di FBS in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare le cellule.Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in DPBS ad una densità di 1 milione di cellule per millilitro. Quindi, utilizzando il selezionatore FACS, isolare le cellule rosse positive del Nilo utilizzando il canale FL-1. Raccogliere le cellule selezionate e ricoltivarle in mezzi di differenziazione degli adipociti o procedere all'estrazione dell'RNA seguita dall'analisi quantitativa dei marcatori di differenziazione degli adipociti.All'inizio della differenziazione, le cellule placcate in sospensione sono rotonde con bordi cellulari definiti e hanno un diametro medio-piccolo. La vitalità dei corpi embrionali è osservata dal comportamento di rapida proliferazione che dà origine a più MSC. Questo rapido comportamento di proliferazione, insieme alla loro morfologia peculiare e allungata, viene mantenuto anche dopo aver passato le MSC su piastre rivestite di matrice fresca.Una buona differenziazione produce MSC affidabili con un'efficienza di espressione superiore al 90% dei marcatori di superficie mesenchimali CD73, CD44 e CD90. Inoltre, la valutazione delle cellule per l'assenza di marcatori di superficie raffiguranti il fenotipo ematopoietico CD14, CD34 e CD19 ha mostrato un'efficienza di espressione inferiore all'1%, L'alta espressione nella distribuzione citoplasmatica di FABP4, un marker per adipociti terminalmente differenziati, indica la loro maturità evolutiva. Inoltre, l'alta espressione di adiponectina, un altro marker della maturità degli adipociti, indica che gli adipociti sono abbastanza funzionali da subire accumulo lipidico e adipogenesi in risposta alla segnalazione del glucosio.Al momento della colorazione, il rosso del Nilo si lega esclusivamente agli adipociti maturi portatori di lipidi, rendendolo uno strumento efficace per la selezione degli adipociti maturi utilizzando la citometria a flusso attivata dalla fluorescenza. I globuli rossi positivi del Nilo mostrano una significativa sovraregolazione dei marcatori di maturazione di almeno due volte rispetto alle cellule non ordinate. Devi essere molto delicato durante la raccolta delle cellule durante la formazione del corpo embrionale e la dissociazione delle cellule mesenchimali in quanto ciò avrebbe un forte impatto sull'efficienza di sopravvivenza post-dissociazione delle cellule staminali mesenchimali.La popolazione pura di adipociti ottenuta da pazienti portatori di mutazione può essere sottoposta al sequenziamento funzionale e all'intero trascrittoma per determinare le vie regolatorie e di segnalazione influenzate da una particolare mutazione senza che i dati siano influenzati dall'eterogeneità del campione. Questa tecnica consentirà la generazione scalabile di cellule staminali mesenchimali in vitro, eliminando la necessità di raccoglierle da donatori umani per differenziarle prontamente in adipociti, condrociti e osteociti per comprendere la patogenesi delle malattie correlate ai tessuti.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Generazione di cellule staminali adiposo umano attraverso dedifferenziazione di adipociti maturi in Culture soffitto

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

La differenziazione del SH-SY5Y neuroblastoma umano linea cellulare

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generazione di IPSC-derivati ​​cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differenziazione delle cellule staminali mesenchimali umane in funzionale del Cardiomyocyte-come le cellule

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Soppressione della segnalazione Pro-fibrotici rafforza fattore-mediata riprogrammazione di fibroblasti embrionali di topo in cardiomiociti indotti

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Differenziazione diretta di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...