Name: robust differentiation of human ipscs into a pure population of adipocytes to study adipocyte-associated disorders
Uploaded: 2022-02-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por uma bolsa do Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi foi apoiada pela bolsa GSRA do Qatar National Research Fund (QNRF).

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa institucional apropriado e realizado de acordo com os padrões éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores ou padrões éticos comparáveis. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do HMC (nº 16260/16) e QBRI (nº 2016-003). Este trabalho também é otimizado para hESCs como H1 e H9. Amostras de sangue foram obtidas de indivíduos sadios com pleno consentimento informado. As iPSCs são gerada...

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	<li>Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+populations+and+sources+of+human+mesenchymal+stem+cells+(MSC):+A+comparison+of+adult+and+neonatal+tissue-derived+MSC.">Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).</li><li>Wagner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+replicative+senescence+have+related+effects+on+human+stem+and+progenitor+cells.">Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells.</a> PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).</li><li>Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+evaluation+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+bone+marrow.">Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow.</a> Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).</li><li>Trivedi, P., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+immunological+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells.</a> Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).</li><li>Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+multipotent+mesenchymal+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells.</a> PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).</li><li>Xiong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+adipocytes+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).</li><li>Cuaranta-Monroy, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+adipocytes+by+ascorbic+acid.">Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).</li><li>van Harmelen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+lipolytic+regulation+in+human+embryonic+stem+cell-derived+adipocytes.">Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes.</a> Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).</li><li>Noguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+and+engraftment+of+adipocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells.">In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).</li><li>Ahfeldt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+human+pluripotent+stem+cells+into+white+and+brown+adipocytes.">Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes.</a> Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).</li><li>Lee, Y. K., Cowan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+white+and+brown+adipocytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).</li><li>Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+different+types+of+diabetes+using+human+pluripotent+stem+cells.">Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).</li><li>Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+as+a+potential+tool+for+disease+modelling+and+cell+therapy+in+diabetes.">Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).</li><li>Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Generation+of+mesenchymal+stem+cells+and+adipocytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li><li>Karam, M., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+highly+efficient+protocol+for+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mesenchymal+stem+cells.">Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , (2020).</li><li>Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+E-cadherin+and+other+cell+adhesion+molecules+in+survival+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 6 (1), 59-70 (2012).</li><li>Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+endothelial+cell+proliferation+during+vasculogenesis.">Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis.</a> Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).</li><li>Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans+retinoic+acid+inhibits+proliferation+of+intestinal+epithelial+cells+by+inhibiting+expression+of+the+gene+encoding+Kruppel-like+factor+5.">All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5.</a> FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).</li><li>di Masi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+receptors:+from+molecular+mechanisms+to+cancer+therapy.">Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy.</a> Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).</li><li>Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+retinoic+acid+receptor+signaling+coordinates+lineage+commitment+of+spontaneously+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells+in+embryoid+bodies.">Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies.</a> FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).</li><li>De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+retinoic+acid+treatment+sustains+pluripotency+and+suppresses+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (1), 6 (2018).</li><li>Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lats1/2-mediated+alteration+of+hippo+signaling+pathway+regulates+the+fate+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).</li><li>Moldes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome-proliferator-activated+receptor+gamma+suppresses+Wnt/beta-catenin+signalling+during+adipogenesis.">Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis.</a> The Biochemical Journal. 376, 607-613 (2003).</li><li>Ross, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+adipogenesis+by+Wnt+signaling.">Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling.</a> Science. 289 (5481), 950-953 (2000).</li><li>Wang, Y. K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+and+mechanical+stimulation+in+the+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation.">Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).</li><li>Mohsen-Kanson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+brown+and+white+adipocytes:+role+of+Pax3.">Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3.</a> Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).</li><li>Billon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest.">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li><li>Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neural+crest+cell+fate+by+the+retinoic+acid+and+Pparg+signalling+pathways.">Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways.</a> Development. 137 (3), 389-394 (2010).</li><li>Ussar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASC-1,+PAT2,+and+P2RX5+are+cell+surface+markers+for+white,+beige,+and+brown+adipocytes.">ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes.</a> Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).</li><li>Festy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+protein+expression+between+human+adipose+tissue-derived+stromal+cells+and+mature+adipocytes.">Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).</li><li>Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptor+CD36+expression+contributes+to+adipose+tissue+inflammation+and+cell+death+in+diet-induced+obesity.">Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity.</a> PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).</li><li>Mesuret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+role+of+the+Alanine-Serine-Cysteine-1+transporter+(SLC7A10,+Asc-1)+for+glycine+inhibitory+transmission+and+respiratory+pattern.">A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).</li><li>Silverstein, R. L., Febbraio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36,+a+scavenger+receptor+involved+in+immunity,+metabolism,+angiogenesis,+and+behavior.">CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior.</a> Science Signaling. 2 (72), (2009).</li><li>Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+roles+of+decay-accelerating+factor,+membrane+cofactor+protein,+and+CD59+in+the+protection+of+human+endothelial+cells+against+complement-mediated+lysis.">Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis.</a> European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).</li><li>Davies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD59,+an+LY-6-like+protein+expressed+in+human+lymphoid+cells,+regulates+the+action+of+the+complement+membrane+attack+complex+on+homologous+cells.">CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).</li><li>Lapid, K., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form(ul)ation+of+adipocytes+by+lipids.">Form(ul)ation of adipocytes by lipids.</a> Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).</li><li>Aldridge, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+validation+for+the+assessment+of+adipogenesis+of+multipotential+stromal+cells--a+direct+comparison+of+four+different+methods.">Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods.</a> Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).</li><li>Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+sort+ESC-derived+adipocytes.">A simple method to sort ESC-derived adipocytes.</a> Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).</li><li>Costa, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cells+from+natural+niches+to+culture+conditions:+implications+for+further+clinical+uses.">Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).</li></ol>

Este protocolo tem importância primordial devido à sua capacidade de fornecer CTMs em alto rendimento e eficiência. Essa produção em massa de CTMs em escala foi possível pela incubação transitória de EBs derivadas de iPSCs com 10 μM de AR14,15. O tratamento transitório com 10 μM de AR aumentou o rendimento das CTM em 11,2 a 1542 vezes14,15, sendo esse protocolo aplicável tanto em iPSCs quanto...

As células-tronco mesenquimais (CTMs) atuam como um recurso transitório efetivo para a produção de células de origem mesodérmica, como adipócitos, osteócitos e condrócitos, que poderiam ser posteriormente utilizadas para modelar suas respectivas doenças genéticas. No entanto, abordagens anteriores baseavam-se na obtenção dessas CTMs a partir de tecidos adultos 1, o que impunha o desafio de obtê-las em grande número dos doadores e a limitação de mantê-las funcionalmente viáveis em condições subótimas de cultivo in vitro 1,2. Esses obstáculos têm gerado uma grande demanda de se ter um protocolo para geração de CTMs in vitro. Células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) podem ser usadas como uma fonte valiosa de CTMs, exibindo características deCTMs 3,4,5. As CTMs derivadas de iPSCs podem ser utilizadas como opção terapêutica em diversas doenças. Além disso, a capacidade das CTMs derivadas de iPSCs de gerar adipócitos as torna um valioso modelo humano in vitro para estudar adipogênese humana, obesidade e distúrbios associados a adipócitos.
Os protocolos atuais de diferenciação de adipócitos podem ser classificados em dois grupos, com um envolvendo diferenciação de adipócitos usando coquetéis químicos ou à base de proteínas, resultando em um rendimento de 30%-60%6,7,8,9, enquanto o outro envolvendo manipulação genética para indução robusta de fatores-chave de transcrição que governam o desenvolvimento de adipócitos para dar um rendimento de 80%-90%10, 11º. No entanto, a manipulação genética não recapitula o processo natural de diferenciação dos adipócitos e, muitas vezes, mascara os paradigmas sutis que chegam durante a adipogênese, tornando-a ineficaz para fins de modelagem da doença12,13. Portanto, apresentamos uma maneira de classificar adipócitos maduros quimicamente derivados de imaturos marcando fluorescentemente adipócitos portadores de lipídios usando vermelho do Nilo.
Apresentamos aqui um protocolo envolvendo a incubação transitória de corpos embrionários (EBs) derivados de iPSCs com ácido all-trans retinóico para produzir um grande número de CTMs de rápida proliferação, que poderiam ser posteriormente utilizadas para gerar adipócitos14. Também apresentamos uma maneira de classificar adipócitos maduros derivados quimicamente do pool de diferenciação heterogênea marcando fluorescentemente suas gotículas lipídicas usando um corante lipofílico; Vermelho do Nilo. Isso permitiria a geração de uma população pura de adipócitos maduros com funcionalidade aprimorada para modelar com precisão os distúrbios metabólicos associados aos adipócitos.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Adiponectin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22554</td>
			<td>Adipocyte maturation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD105</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>560839</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561712</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD19</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555415</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555824</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD44</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab93758</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td> 
			560975</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD73</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550256</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD90</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555596</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>233-FP</td>
			<td>MSC culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C/EBPA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40761</td>
			<td>Adipocyte maturation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Torics</td>
			<td>1126</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FABP4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab93945</td>
			<td>Adipocyte maturation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td>MSC culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>MSC culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Basal media for preparing matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11885084</td>
			<td>MSC culturing media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Coating matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-alpha</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12561056</td>
			<td>Adipocyte differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nilered</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>19123</td>
			<td>Sorting marker for adipocyte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MSC/Adipocyte media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; 20X TBS Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28358</td>
			<td>wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPARG</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2443</td>
			<td>Adipocyte maturation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>Dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>MSC differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254/10</td>
			<td>hPSC culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roziglitazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A334901</td>
			<td>hPSC culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28314</td>
			<td>Permebealization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7942</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust differentiation of human ipscs into a pure population of adipocytes to study adipocyte-associated disorders

Avanços recentes na tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) têm permitido a geração de diferentes tipos celulares, incluindo adipócitos. Entretanto, os métodos de diferenciação atuais têm baixa eficiência e não produzem uma população homogênea de adipócitos. Aqui, contornamos esse problema usando um método baseado em trans-retinóicos para produzir células-tronco mesenquimais (CTMs) em alto rendimento. Ao regular as vias que governam a proliferação, sobrevivência e adesão celular, nossa estratégia de diferenciação permite a geração eficiente de corpos embrionários (EBs) que se diferenciam em uma população pura de CTMs multipotentes. O elevado número de CTMs geradas por este método fornece uma fonte ideal para a geração de adipócitos. No entanto, a heterogeneidade da amostra resultante da diferenciação dos adipócitos permanece um desafio. Portanto, usamos um método à base de vermelho do Nilo para purificar adipócitos maduros portadores de lipídios usando FACS. Essa estratégia de classificação nos permitiu estabelecer uma maneira confiável de modelar distúrbios metabólicos associados aos adipócitos usando um pool de adipócitos com heterogeneidade amostral reduzida e funcionalidade celular aprimorada.

Esquema e morfologia das células durante a diferenciação mesenquimal: A diferenciação de iPSCs em CTMs envolve vários estágios de desenvolvimento abrangendo a formação de EB, diferenciação de CTM e expansão de CTM (Figura 1). Durante esses estágios de desenvolvimento, as células adquirem várias morfologias devido aos diferentes produtos químicos estimulatórios a que são submetidas. Ao iniciar a diferenciação, as células são plaqueadas em suspensão e espera-se que sejam...

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Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders

O protocolo permite a geração de uma população de adipócitos puros a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). O ácido retinóico é usado para diferenciar iPSCs em células-tronco mesenquimais (CTMs) que são usadas para produzir adipócitos. Em seguida, uma abordagem de classificação baseada na coloração vermelha do Nilo é usada para obter adipócitos puros.

Diferenciação Robusta de iPSCs Humanas em uma População Pura de Adipócitos para Estudo de Distúrbios Associados a Adpócitos

Recent advances in induced pluripotent stem cell (iPSC) technology have allowed the generation of different cell types, including adipocytes. However, the ...

Abordagens anteriores se baseavam em métodos altamente invasivos para a obtenção de células-tronco mesenquimais in vitro, mas essas células-tronco mesenquimais tinham uma limitação de produzir pool heterogêneo de 30% com eficiência variando de 30 a 60%Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um alto número de células-tronco mesenquimais de proliferação rápida que podem produzir uma população pura de adipócitos maduros por triagem usando vermelho do Nilo. Quando as iPSCs atingirem 80% de confluência, lavar as células com DPBS e adicionar meio de dissociação contendo EDTA. Incubar as células a 37 graus Celsius por um minuto.Após um minuto, aspirar o reagente de dissociação e colocar as células a 37 graus Celsius por mais um minuto. Em seguida, retire a placa da incubadora. Adicione um mililitro de meio StemFlex por poço e colete cuidadosamente as células em um tubo cônico de 15 mililitros.Centrifugar as células. Retire o sobrenadante e ressuspenda-o suavemente em três mililitros de meio de diferenciação MSC contendo 10 micromoles de um inibidor de rocha. Misture a suspensão celular e distribua 500 microlitros por poço em uma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços.Em seguida, coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius. Após 24 horas, para induzir os corpos embrionários atingidos, colete-os em um tubo de 15 mililitros e permita que eles se acomodem. Após 15 minutos, retirar o sobrenadante e adicionar meio de diferenciação MSC suplementado com ácido retinóico 10 micromolares.Ressuspenda os corpos embrionários suavemente e distribua 500 microlitros por poço na mesma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços. Em seguida, coloque a placa na incubadora. Após 48 horas, colete os corpos embrionários em um tubo de 15 mililitros e deixe-os se acomodar por 15 minutos.Em seguida, remova o sobrenadante e adicione o meio de diferenciação MSC suplementado com ácido retinóico 0,1 micromolar. Após ressuspender os corpos embrionários, distribua 500 microlitros por poço na mesma placa de 24 poços e coloque a placa na incubadora. Quarenta e oito horas após o último tratamento com ácido retinóico, coletar os corpos embrionários, remover o sobrenadante e adicionar meio DMEM de baixa glicose sem citocinas.Ressuspenda suavemente e distribua 500 microlitros da suspensão celular por poço na mesma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços e, em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius. Após 48 horas, para plaquear os corpos embrionários derivados da iPSC, coletar os corpos embrionários em um tubo de 15 mililitros, deixá-los se acomodar, remover o sobrenadante e ressuspender em dois mililitros de meio fresco de diferenciação de CTM. Em seguida, transfira a suspensão para dois poços de uma placa de seis poços revestida com matriz de membrana basal e incube as células a 37 graus Celsius.Após cinco dias, substituir o meio gasto por um meio fresco de diferenciação de CTM contendo 2,5 nanogramas por mililitro de fator de crescimento básico de fibroblastos e continuar a diferenciação de CMS por até 11 e 15 dias. Quando os corpos embrionários plaqueados atingirem 80 a 90% de confluência, passe-os lavando com DPBS, adicionando tripsina-EDTA e incubando a 37 graus Celsius por um minuto. Retire a tripsina-EDTA da placa e incube novamente a 37 graus Celsius por um minuto.Em seguida, adicione um mililitro de mídia por poço. Após três minutos, coletar as células usando meios de diferenciação de CTM em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugar as células. Em seguida, ressuspender as células em um meio de diferenciação de CTM contendo fator de crescimento básico de fibroblastos e plaquear as células em placas revestidas com matriz de membrana basal na proporção de um para três.Depois que as CTMs atingirem 90% de confluência, continue cultivando-as por mais 48 horas para permitir que elas passem por um período de parada de crescimento. Em seguida, remova o meio e lave as células com DBPS. Após a lavagem, adicionar meio de diferenciação completa de adipócitos à placa e incubar as células a 37 graus Celsius.Troque o meio a cada dois dias por 14 dias. Diferenciar CTMs derivadas de iPSC em adipócitos. Para classificar os adipócitos usando vermelho do Nilo, prepare a solução de trabalho vermelho do Nilo em DMSO, conforme descrito no manuscrito do texto.Antes do uso, descongelar a solução estoque e reconstituí-la em DPBS para atingir uma concentração de solução de trabalho de 300 nanomolares. No ou após o 14º dia de diferenciação dos adipócitos, descartar o meio das células e lavar com DPBS. Em seguida, adicione a solução de trabalho vermelho do Nilo.Tampe a placa e incube as células a 37 graus Celsius. Após 15 minutos, substituir a solução vermelha do Nilo por tripsina-EDTA e incubar as células a 37 graus Celsius por quatro minutos. Em seguida, colete as células usando DMEM contendo 5% FBS em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue as células.Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em DPBS a uma densidade de 1 milhão de células por mililitro. Em seguida, usando o classificador FACS, isole as células vermelhas positivas do Nilo usando o canal FL-1. Coletar as células selecionadas e recultivá-las em meios de diferenciação de adipócitos ou proceder à extração de RNA seguida de análise quantitativa dos marcadores de diferenciação de adipócitos.Ao iniciar a diferenciação, as células plaqueadas em suspensão são redondas com bordas celulares definidas e de pequeno a médio diâmetro de diâmetro. A viabilidade dos corpos embrionários é observada pelo rápido comportamento de proliferação, dando origem a mais CTMs. Esse comportamento de proliferação rápida, juntamente com sua morfologia peculiar e alongada, é mantido mesmo após a passagem das CTMs para placas revestidas com matriz fresca.Uma boa diferenciação produz CTMs confiáveis com eficiência de expressão superior a 90% dos marcadores de superfície mesenquimal CD73, CD44 e CD90. Além disso, a avaliação das células quanto à ausência de marcadores de superfície que retratam o fenótipo hematopoético CD14, CD34 e CD19 mostrou eficiência de expressão inferior a 1%, Alta expressão na distribuição citoplasmática de FABP4, um marcador para adipócitos terminalmente diferenciados, indica sua maturidade de desenvolvimento. Além disso, a alta expressão de adiponectina, outro marcador de maturidade dos adipócitos, indica que os adipócitos são funcionais o suficiente para sofrer armazenamento lipídico e adipogênese em resposta à sinalização da glicose.Após a coloração, o vermelho do Nilo liga-se exclusivamente aos adipócitos maduros portadores de lipídios, tornando-se uma ferramenta eficaz para classificar adipócitos maduros usando citometria de fluxo ativada por fluorescência. As células vermelho-positivas do Nilo mostram um aumento significativo da regulação dos marcadores de maturação em pelo menos duas vezes em comparação com as células não selecionadas. Você tem que ser muito gentil ao coletar células durante a formação do corpo embrionário e dissociação de células mesenquimais, pois isso teria um grande impacto na eficiência de sobrevivência pós-dissociação de células-tronco mesenquimais.A população pura de adipócitos obtida de pacientes portadores de mutação pode ser submetida ao sequenciamento funcional e ao transcriptoma completo para determinar vias regulatórias e de sinalização afetadas por determinada mutação sem que os dados sejam afetados pela heterogeneidade da amostra. Esta técnica permitirá a geração escalável de células-tronco mesenquimais in vitro, eliminando a necessidade de colhê-las de doadores humanos para diferenciá-las prontamente em adipócitos, condrócitos e osteócitos para o entendimento da patogênese de doenças relacionadas ao tecido.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Geração de adiposo humano Stem Cells através Dedifferentiation de adipócitos maduros em Culturas de teto

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

A diferenciação da linha celular SH-SY5Y humanas de neuroblastoma

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Supressão de sinalização pró-fibróticos potencializa mediada por fator de reprogramação de fibroblastos embrionários de rato em Cardiomyocytes induzida

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Diferenciação Dirigida de Células Endoteliais Hemogênicas de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...