Name: robust differentiation of human ipscs into a pure population of adipocytes to study adipocyte-associated disorders
Uploaded: 2022-02-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders at JoVE.com

Эта работа была профинансирована за счет гранта Катарского национального исследовательского фонда (QNRF) (грант No NPRP10-1221-160041). Марьям Агади получила стипендию GSRA от Катарского национального исследовательского фонда (QNRF).

Исследование было одобрено соответствующим институциональным комитетом по этике исследований и выполнено в соответствии с этическими стандартами, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 года и ее более поздних поправках или сопоставимых этических стандартах. Протокол был одобрен ...

<ol>
	<li>Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+populations+and+sources+of+human+mesenchymal+stem+cells+(MSC):+A+comparison+of+adult+and+neonatal+tissue-derived+MSC.">Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).</li><li>Wagner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+replicative+senescence+have+related+effects+on+human+stem+and+progenitor+cells.">Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells.</a> PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).</li><li>Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+evaluation+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+bone+marrow.">Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow.</a> Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).</li><li>Trivedi, P., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+immunological+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells.</a> Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).</li><li>Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+multipotent+mesenchymal+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells.</a> PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).</li><li>Xiong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+adipocytes+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).</li><li>Cuaranta-Monroy, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+adipocytes+by+ascorbic+acid.">Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).</li><li>van Harmelen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+lipolytic+regulation+in+human+embryonic+stem+cell-derived+adipocytes.">Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes.</a> Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).</li><li>Noguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+and+engraftment+of+adipocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells.">In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).</li><li>Ahfeldt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+human+pluripotent+stem+cells+into+white+and+brown+adipocytes.">Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes.</a> Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).</li><li>Lee, Y. K., Cowan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+white+and+brown+adipocytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).</li><li>Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+different+types+of+diabetes+using+human+pluripotent+stem+cells.">Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).</li><li>Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+as+a+potential+tool+for+disease+modelling+and+cell+therapy+in+diabetes.">Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).</li><li>Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Generation+of+mesenchymal+stem+cells+and+adipocytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li><li>Karam, M., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+highly+efficient+protocol+for+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mesenchymal+stem+cells.">Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , (2020).</li><li>Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+E-cadherin+and+other+cell+adhesion+molecules+in+survival+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 6 (1), 59-70 (2012).</li><li>Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+endothelial+cell+proliferation+during+vasculogenesis.">Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis.</a> Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).</li><li>Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans+retinoic+acid+inhibits+proliferation+of+intestinal+epithelial+cells+by+inhibiting+expression+of+the+gene+encoding+Kruppel-like+factor+5.">All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5.</a> FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).</li><li>di Masi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+receptors:+from+molecular+mechanisms+to+cancer+therapy.">Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy.</a> Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).</li><li>Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+retinoic+acid+receptor+signaling+coordinates+lineage+commitment+of+spontaneously+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells+in+embryoid+bodies.">Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies.</a> FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).</li><li>De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+retinoic+acid+treatment+sustains+pluripotency+and+suppresses+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (1), 6 (2018).</li><li>Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lats1/2-mediated+alteration+of+hippo+signaling+pathway+regulates+the+fate+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).</li><li>Moldes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome-proliferator-activated+receptor+gamma+suppresses+Wnt/beta-catenin+signalling+during+adipogenesis.">Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis.</a> The Biochemical Journal. 376, 607-613 (2003).</li><li>Ross, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+adipogenesis+by+Wnt+signaling.">Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling.</a> Science. 289 (5481), 950-953 (2000).</li><li>Wang, Y. K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+and+mechanical+stimulation+in+the+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation.">Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).</li><li>Mohsen-Kanson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+brown+and+white+adipocytes:+role+of+Pax3.">Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3.</a> Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).</li><li>Billon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest.">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li><li>Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neural+crest+cell+fate+by+the+retinoic+acid+and+Pparg+signalling+pathways.">Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways.</a> Development. 137 (3), 389-394 (2010).</li><li>Ussar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASC-1,+PAT2,+and+P2RX5+are+cell+surface+markers+for+white,+beige,+and+brown+adipocytes.">ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes.</a> Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).</li><li>Festy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+protein+expression+between+human+adipose+tissue-derived+stromal+cells+and+mature+adipocytes.">Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).</li><li>Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptor+CD36+expression+contributes+to+adipose+tissue+inflammation+and+cell+death+in+diet-induced+obesity.">Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity.</a> PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).</li><li>Mesuret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+role+of+the+Alanine-Serine-Cysteine-1+transporter+(SLC7A10,+Asc-1)+for+glycine+inhibitory+transmission+and+respiratory+pattern.">A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).</li><li>Silverstein, R. L., Febbraio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36,+a+scavenger+receptor+involved+in+immunity,+metabolism,+angiogenesis,+and+behavior.">CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior.</a> Science Signaling. 2 (72), (2009).</li><li>Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+roles+of+decay-accelerating+factor,+membrane+cofactor+protein,+and+CD59+in+the+protection+of+human+endothelial+cells+against+complement-mediated+lysis.">Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis.</a> European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).</li><li>Davies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD59,+an+LY-6-like+protein+expressed+in+human+lymphoid+cells,+regulates+the+action+of+the+complement+membrane+attack+complex+on+homologous+cells.">CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).</li><li>Lapid, K., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form(ul)ation+of+adipocytes+by+lipids.">Form(ul)ation of adipocytes by lipids.</a> Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).</li><li>Aldridge, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+validation+for+the+assessment+of+adipogenesis+of+multipotential+stromal+cells--a+direct+comparison+of+four+different+methods.">Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods.</a> Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).</li><li>Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+sort+ESC-derived+adipocytes.">A simple method to sort ESC-derived adipocytes.</a> Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).</li><li>Costa, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cells+from+natural+niches+to+culture+conditions:+implications+for+further+clinical+uses.">Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).</li></ol>

Этот протокол имеет первостепенное значение из-за его способности обеспечивать высокую производительность и эффективность МСК. Это массовое производство МСК стало возможным благодаря переходной инкубации ЭБ, полученных из ИПСК, с 10 мкМ RA14,15. Транзиторн...

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) действуют как эффективный транзиторный ресурс для производства клеток мезодермального происхождения, таких как адипоциты, остеоциты и хондроциты, которые в дальнейшем могут быть использованы для моделирования соответствующих генетических нарушений. Однако предыдущие подходы основывались на получении этих МСК из тканей взрослого человека 1, что создавало проблему получения их в больших количествах от доноров и ограничение их функциональной жизнеспособности в неоптимальных условиях культивирования in vitro 1,2. Эти препятствия породили большой спрос на протокол для генерации МСК in vitro. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) могут быть использованы в качестве ценного источника МСК, проявляя характеристикиМСК 3,4,5. МСК, полученные из ИПСК, могут использоваться в качестве терапевтического варианта при нескольких заболеваниях. Кроме того, способность МСК, полученных из ИПСК, генерировать адипоциты, делает их ценной моделью человека in vitro для изучения адипогенеза человека, ожирения и заболеваний, связанных с адипоцитами.
Современные протоколы дифференцировки адипоцитов можно разделить на две группы, одна из которых включает дифференцировку адипоцитов с использованием химических или белковых коктейлей, дающих результирующий выход 30%-60%6,7,8,9, а другая включает генетические манипуляции для надежной индукции ключевых факторов транскрипции, регулирующих развитие адипоцитов, чтобы дать выход 80%-90%10, 11. Однако генетические манипуляции не повторяют естественный процесс дифференцировки адипоцитов и часто маскируют тонкие парадигмы, возникающие во время адипогенеза, что делает его неэффективным для целей моделирования заболеваний12,13. Таким образом, мы представляем способ сортировки химически полученных зрелых адипоцитов от незрелых путем флуоресцентной маркировки липидсодержащих адипоцитов с использованием нильского красного.
Здесь мы представляем протокол, включающий транзиторную инкубацию эмбриоидных тел (БЭ), полученных из ИПСК, с полностью транс-ретиноевой кислотой для получения большого количества быстро пролиферирующих МСК, которые в дальнейшем могут быть использованы для получения адипоцитов14. Мы также представляем способ сортировки химически полученных зрелых адипоцитов из пула гетерогенной дифференцировки путем флуоресцентной маркировки их липидных капель с использованием липофильного красителя; Нил красный. Это позволило бы создать чистую популяцию зрелых адипоцитов с расширенной функциональностью для точного моделирования метаболических нарушений, связанных с адипоцитами.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adiponectin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22554</td>
			<td>Adipocyte maturation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD105</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>560839</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561712</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD19</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555415</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555824</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD44</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab93758</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td> 
			560975</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD73</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550256</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD90</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555596</td>
			<td>MSC differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>233-FP</td>
			<td>MSC culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C/EBPA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40761</td>
			<td>Adipocyte maturation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Torics</td>
			<td>1126</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FABP4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab93945</td>
			<td>Adipocyte maturation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td>MSC culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>MSC culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Basal media for preparing matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11885084</td>
			<td>MSC culturing media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Coating matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-alpha</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12561056</td>
			<td>Adipocyte differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nilered</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>19123</td>
			<td>Sorting marker for adipocyte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MSC/Adipocyte media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; 20X TBS Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28358</td>
			<td>wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPARG</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2443</td>
			<td>Adipocyte maturation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>Dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>MSC differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254/10</td>
			<td>hPSC culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roziglitazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>Adipocyte differentiation media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A334901</td>
			<td>hPSC culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28314</td>
			<td>Permebealization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7942</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust differentiation of human ipscs into a pure population of adipocytes to study adipocyte-associated disorders

Последние достижения в технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) позволили генерировать различные типы клеток, включая адипоциты. Однако современные методы дифференцировки имеют низкую эффективность и не дают однородной популяции адипоцитов. Здесь мы обходим эту проблему, используя полностью транс-ретиноевый метод для получения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) с высоким выходом. Регулируя пути, регулирующие пролиферацию, выживание и адгезию клеток, наша стратегия дифференцировки позволяет эффективно генерировать эмбриональные тела (БЭ), которые дифференцируются в чистую популяцию мультипотентных МСК. Большое количество МСК, генерируемых этим методом, является идеальным источником для генерации адипоцитов. Однако гетерогенность образца в результате дифференцировки адипоцитов остается проблемой. Поэтому мы использовали метод очистки липидсодержащих зрелых адипоцитов на основе нильского краса с помощью FACS. Эта стратегия сортировки позволила нам установить надежный способ моделирования метаболических нарушений, связанных с адипоцитами, с использованием пула адипоцитов с уменьшенной гетерогенностью образца и улучшенной функциональностью клеток.

Схема и морфология клеток во время мезенхимальной дифференцировки: Дифференцировка ИПСК в МСК включает в себя различные стадии развития, охватывающие образование БЭ, дифференцировку МСК и экспансию МСК (рис. 1). На этих стадиях развития клетки приобретают различную мор?...

Watch this Scientific Journal Video about Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders at JoVE.com

Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders

Протокол позволяет генерировать чистую популяцию адипоцитов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Ретиноевая кислота используется для дифференцировки ИПСК в мезенхимальные стволовые клетки (МСК), которые используются для производства адипоцитов. Затем для получения чистых адипоцитов используется подход сортировки, основанный на окрашивании Нила в красный цвет.

Робастная дифференциация ИПСК человека в чистую популяцию адипоцитов для изучения адипоцит-ассоциированных заболеваний

Recent advances in induced pluripotent stem cell (iPSC) technology have allowed the generation of different cell types, including adipocytes. However, the ...

Предыдущие подходы основывались на высокоинвазивных методах получения мезенхимальных стволовых клеток in vitro, но эти мезенхимальные стволовые клетки имели ограничение на получение гетерогенного пула 30% с эффективностью от 30 до 60%Здесь мы представляем протокол для получения большого количества быстро размножающихся мезенхимальных стволовых клеток, которые могут продуцировать чистую популяцию зрелых адипоцитов путем сортировки с использованием нильского красного. Когда ИПСК достигнут 80%-ного слияния, промойте клетки DPBS и добавьте диссоциативную среду, содержащую ЭДТА. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной минуты.Через одну минуту аспирируйте диссоциативный реагент и поместите клетки при температуре 37 градусов Цельсия еще на одну минуту. Далее вынимаем тарелку из инкубатора. Добавьте один миллилитр среды StemFlex в каждую лунку и тщательно соберите клетки в 15-миллилитровую коническую пробирку.Центрифугируйте клетки. Удалите надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте их в трех миллилитрах дифференцировочной среды MSC, содержащей 10 микромолей ингибитора горных пород. Смешайте суспензию ячеек и распределите 500 микролитров на лунку в 24-луночной пластине со сверхнизким креплением.Затем поместите тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов по Цельсию. Через 24 часа, чтобы индуцировать полученные эмбриональные тела, соберите их в 15-миллилитровую пробирку и дайте им успокоиться. Через 15 минут удалить надосадочную жидкость и добавить среду для дифференцировки МСК с добавлением 10 микромолярной ретиноевой кислоты.Осторожно ресуспендируйте эмбриональные тела и распределите 500 микролитров на лунку в той же 24-луночной пластине со сверхнизким креплением. Затем поместите тарелку в инкубатор. Через 48 часов соберите эмбриональные тела в 15-миллилитровую пробирку и дайте им осесть в течение 15 минут.Затем удалите надосадочную жидкость и добавьте среду для дифференцировки МСК с добавлением 0,1 микромолярной ретиноевой кислоты. После ресуспендирования эмбриональных тел распределите 500 микролитров на лунку в той же 24-луночной пластине и поместите пластину в инкубатор. Через сорок восемь часов после последней обработки ретиноевой кислотой соберите эмбриональные тела, удалите надосадочную жидкость и добавьте среду DMEM с низким содержанием глюкозы без цитокинов.Осторожно ресуспендируйте и распределите 500 микролитров клеточной суспензии на лунку в той же 24-луночной пластине со сверхнизким креплением, затем инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия. Через 48 часов, чтобы пластинировать эмбриональные тела, полученные из ИПСК, соберите эмбриональные тела в 15-миллилитровую пробирку, дайте им осесть, затем удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте в двух миллилитрах свежей среды для дифференцировки МСК. Затем перенесите суспензию в две лунки шестилуночной пластины с матричным покрытием из базальной мембраны и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия.Через пять дней замените отработанную среду свежей средой для дифференцировки МСК, содержащей 2,5 нанограмма на миллилитр основного фактора роста фибробластов, и продолжайте дифференцировку MCS до 11 и 15 дней. Когда пластинчатые эмбриональные тела достигнут слияния от 80 до 90%, пропустите их, промыв DPBS, добавив трипсин-ЭДТА и инкубируя при 37 градусах Цельсия в течение одной минуты. Снимите трипсин-ЭДТА с тарелки и снова инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной минуты.Далее добавьте по одному миллилитру носителя на лунку. Через три минуты соберите клетки с помощью среды для дифференцировки MSC в 15-миллилитровую коническую пробирку и центрифугируйте клетки. Затем ресуспендируют клетки в среде дифференцировки МСК, содержащей основной фактор роста фибробластов, и помещают клетки на пластины, покрытые матричным покрытием базальной мембраны, в соотношении один к трем.После того, как МСК достигнут 90% слияния, продолжайте культивировать их еще 48 часов, чтобы позволить им пройти период остановки роста. Затем удалите среду и промойте ячейки ДАБС. После промывки добавьте в пластину полную среду для дифференцировки адипоцитов и инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия.Меняйте среду через день в течение 14 дней. Дифференцировать МСК, полученные из iPSC, в адипоциты. Чтобы отсортировать адипоциты с использованием нильского красного, приготовьте нильский красный рабочий раствор в ДМСО, как описано в текстовой рукописи.Перед использованием разморозьте исходный раствор и восстановите его в DPBS для достижения концентрации рабочего раствора 300 нмоль. На 14-й день дифференцировки адипоцитов или после него удалите среду из клеток и промойте с помощью DPBS. Затем добавьте рабочий раствор нильского красного.Накройте тарелку и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов по Цельсию. Через 15 минут замените раствор нильского красного трипсином-ЭДТА и инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в течение четырех минут. Затем соберите клетки с помощью DMEM, содержащего 5% FBS, в 15-миллилитровую коническую пробирку и центрифугируйте клетки.Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в DPBS с плотностью 1 миллион клеток на миллилитр. Затем, используя сортировщик FACS, изолируйте нильские красные положительные клетки с помощью канала FL-1. Собирают отсортированные клетки и пересаживают их в среды для дифференцировки адипоцитов или приступают к выделению РНК с последующим количественным анализом маркеров дифференцировки адипоцитов.При начале дифференцировки клетки, покрытые суспензией, имеют круглую форму с определенными границами клеток и имеют малый или средний размер в диаметре. Жизнеспособность эмбриональных тел наблюдается по быстрому пролиферативному поведению, приводящему к появлению большего количества МСК. Это быстрое поведение пролиферации, наряду с их своеобразной и удлиненной морфологией, сохраняется даже после прохождения МСК на свежие пластины с матричным покрытием.Хорошая дифференцировка дает надежные МСК с эффективностью экспрессии мезенхимальных поверхностных маркеров CD73, CD44 и CD90 более 90%. Кроме того, оценка клеток на отсутствие поверхностных маркеров, изображающих гемопоэтический фенотип CD14, CD34 и CD19, показала эффективность экспрессии менее 1%, высокая экспрессия в цитоплазматическом распределении FABP4, маркера терминально-дифференцированных адипоцитов, указывает на их зрелость развития. Кроме того, высокая экспрессия адипонектина, еще одного маркера зрелости адипоцитов, указывает на то, что адипоциты достаточно функциональны, чтобы подвергаться накоплению липидов и адипогенезу в ответ на передачу сигналов глюкозы.После окрашивания нильский красный связывается исключительно с липидоносными зрелыми адипоцитами, что делает его эффективным инструментом для сортировки зрелых адипоцитов с помощью флуоресцентно-активированной проточной цитометрии. Нильские красные положительные клетки демонстрируют значительное повышение маркеров созревания, по крайней мере, в два раза по сравнению с несортированными клетками. Вы должны быть очень осторожны при сборе клеток во время формирования эмбрионального тела и диссоциации мезенхимальных клеток, так как это сильно повлияет на эффективность выживания после диссоциации мезенхимальных стволовых клеток.Чистая популяция адипоцитов, полученная от пациентов с мутациями, может быть подвергнута функциональному секвенированию и секвенированию всего транскриптома для определения регуляторных и сигнальных путей, затронутых конкретной мутацией, без влияния гетерогенности образца на данные. Этот метод позволит масштабировать генерацию мезенхимальных стволовых клеток in vitro, устраняя необходимость сбора их у доноров человека, чтобы легко дифференцировать их в адипоциты, хондроциты и остеоциты для понимания патогенеза заболеваний, связанных с тканью.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Генерация жировой стволовых клеток через дедифференцировка зрелые адипоциты в потолочных культур

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Дифференциация клеточной линии SH-SY5Y нейробластомы человека

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Дифференциация человека плюрипотентных стволовых клеток в клетки трофобласта

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Генерация IPSC, полученные из органоидов человеческого мозга Модели раннего развития нервной системы Расстройства

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

В пробирке Дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток человека в функциональных клетки Cardiomyocyte как

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Подавление Pro фиброзный сигнализации потенцирует фактор опосредованной перепрограммирования мыши эмбриональных фибробластов в индуцированной кардиомиоцитов

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Эффективная дифференциация стволовых клеток человека в клетки печени

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Эффективная нейронная дифференциация с использованием одноклеточной культуры эмбриональных стволовых клеток человека

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Направленная дифференцировка гемогенных эндотелиальных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...