Name: ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms
Uploaded: 2022-01-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms at JoVE.com

Forfatterne vil gerne udtrykke deres taknemmelighed over for Aline Burda Farias for den tekniske bistand med vakuumovnen samt administrationen ved Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brasilien) for at give adgang til det nævnte udstyr. Dette arbejde blev delvist finansieret af tilskud CNPq 445954/2020-5.

1. Fremstilling af stamopløsninger og gelificeringsblanding
BEMÆRK: Fire stamopløsninger fremstilles (400 mg/ml melezitose, 400 mg/ml trehalose, 0,75 mg/ml lysin og 200 mg/ml glykogen) og blandes i overensstemmelse med den andel, der er vist i tabel 1 , til fremstilling af gelifikationsblandingen. Selvom protokollen beskriver 10 ml produktion af lageropløsninger, kan den tilpasses til lavere eller højere mængder.
<ol><li>Melezitose opløsning<ol><li>Ve...

<ol>
	<li>Lewinsohn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carlos+Chagas+(1879-1934):+the+discovery+of+Trypanosoma+cruzi+and+of+American+trypanosomiasis+(foot-notes+to+the+history+of+Chagas's+disease).">Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease).</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).</li><li>Bern, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+Chagas+disease+in+the+United+States:+A+systematic+review.">Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review.</a> The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).</li><li>Pereira, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease+as+a+foodborne+illness.">Chagas' disease as a foodborne illness.</a> Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).</li><li>Tanowitz, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease.">Chagas' disease.</a> Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).</li><li>Rassi, A., Marin-Neto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+validation+of+quantitative+real-time+PCR+methods+for+quantification+of+trypanosoma+cruzi+DNA+in+blood+samples+from+chagas+disease+patients.">Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).</li><li>Rivero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Trypanosoma+cruzi+by+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+potential+novel+tool+for+the+detection+of+congenital+Chagas+infection.">Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).</li><li>Schijman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnosis+of+Trypanosoma+cruzi.">Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi.</a> Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).</li><li>Besuschio, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+cruzi+loop-mediated+isothermal+amplification+(Trypanosoma+cruzi+Loopamp)+kit+for+detection+of+congenital,+acute+and+Chagas+disease+reactivation.">Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).</li><li>Duffy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+real-time+PCR+strategy+for+monitoring+bloodstream+parasitic+loads+in+chagas+disease+patients.">Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).</li><li>Melo, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+real+time+PCR+to+quantify+parasite+load+in+serum+samples+from+chronic+Chagas+disease+patients.">Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients.</a> Parasites &amp; Vectors. 8 (1), 154 (2015).</li><li>Parrado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+serial+blood+sampling+and+PCR+replicates+for+treatment+monitoring+of+patients+with+chronic+Chagas+disease.">Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).</li><li>de Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ready-to-use+duplex+qPCR+to+detect+Leishmania+infantum+DNA+in+naturally+infected+dogs.">A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs.</a> Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).</li><li>Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+concept+for+a+portable+platform+for+molecular+diagnosis+of+tropical+diseases.">Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).</li><li>Costa, A. D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready-to-use+qPCR+for+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+or+Trypanosoma+cruzi+in+food+matrices.">Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices.</a> Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-storage+of+gelified+reagents+in+a+lab-on-a-foil+system+for+rapid+nucleic+acid+analysis.">Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis.</a> Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).</li><li>Kamau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample-ready+multiplex+qPCR+assay+for+detection+of+malaria.">Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria.</a> Malaria Journal. 13, 158 (2014).</li><li>Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+further+challenges+in+lyophilization.">Recent advances and further challenges in lyophilization.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).</li><li>Rosado, P. M. F. S., L&#243;pez, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+preparing+stabilised+reaction+mixtures,+which+are+totally+or+partially+dried,+comprising+at+least+one+enzyme,+reaction+mixtures+and+kits+containing+said+mixtures.">Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures.</a> PubChem. , (2002).</li><li>Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+fast+and+easy+sample-to-answer+protocol+for+tuberculosis+screening+in+point-of-care+settings:+A+proof+of+concept+study.">Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study.</a> PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).</li><li>Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+improved+U.S.+food+and+drug+administration+method+for+the+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+in+produce+using+real-time+PCR.">Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR.</a> Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).</li><li>Iglesias, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+new+gelled+nested+PCR+test+for+the+diagnosis+of+imported+malaria:+comparison+with+microscopy,+rapid+diagnostic+test,+and+real-time+PCR.">Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR.</a> Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).</li><li>Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnostics+for+Chagas+disease:+up+to+date+and+novel+methodologies.">Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).</li></ol>

De seneste år har understreget behovet for at finde mere følsomme og specifikke teknologier, der kan hjælpe med at diagnosticere tropiske og oversete sygdomme. Selvom det er vigtigt for epidemiologisk kontrol, har parasitologiske (optisk mikroskopi) og serologiske tests begrænsninger, især med hensyn til følsomhed og anvendelighed på plejestedet. DNA-amplifikationsteknikker såsom PCR, isotermisk amplifikation og respektive variationer har længe været brugt i laboratorieindstillinger, men teknologiske forhindrin...

Chagas sygdom blev opdaget i begyndelsen af det 20. århundrede i landdistrikterne i Brasilien, hvor fattigdom var udbredt 1,2. Selv i dag er sygdommen fortsat forbundet med sociale og økonomiske sundhedsdeterminanter i Amerika. Chagas sygdom er bifasisk, der omfatter en akut og en kronisk fase. Det er forårsaget af infektion med Trypanosoma cruzi-parasitten, der overføres af insektvektorer, blodtransfusioner via medfødt vej eller oral indtagelse af forurenet mad 3,4.
Diagnosticering af Chagas sygdom kan foretages ved observation af kliniske symptomer (især Romaña-tegnet), blodudtværingsmikroskopi, serologi og molekylære tests såsom realtids-PCR (qPCR) eller isotermisk forstærkning 4,5,6,7,8,9. Kliniske symptomer og blodudtværingsmikroskopi anvendes i mistænkte tilfælde af akutte infektioner, mens søgningen efter antistoffer bruges som screeningsværktøj hos asymptomatiske patienter. På grund af dets følsomhed og specificitet er qPCR blevet foreslået at blive brugt som et overvågningsværktøj til kroniske patienter, til akutte patienter, der gennemgår behandling, der måler parasitbelastningen i blodet, og som en surrogatmarkør for terapeutisk svigt 6,8,10,11,12 . Selvom det er mere følsomt og specifikt end de aktuelt tilgængelige tests, forhindres qPCR effektivt i at blive kendt som diagnostiske værktøjer i underprivilegerede regioner over hele verden på grund af kravet om frysende temperaturer til transport og opbevaring13,14,15.
For at omgå denne hindring er bevaringsteknikker som lyofilisering og gelificering blevet udforsket16,17. Mens lyofilisering giver bevarelse i årevis, kræver det specielt fremstillede reagenser uden tilstedeværelse af glycerol, som almindeligvis anvendes til enzymstabilisering / konservering18. Mens gelificering har vist sig at give bevarelse i flere måneder, tillader det brugen af almindelige reagenser19. Gelificeringsopløsningen består af fire komponenter, hver med specifikke roller i processen: sukkerarterne trehalose og melezitose beskytter biomolekylerne under udtørringsprocessen ved at reducere frie vandmolekyler i opløsningen, glykogen producerer en bredere beskyttende matrix, og aminosyren lysin anvendes som en friradikal scavenger til at hæmme de oxiderende reaktioner mellem biomolekylets carboxyl, amino- og fosfatgrupper. Disse komponenter definerer en sol-gel-blanding, der forhindrer tab af den tertiære eller kvaternære struktur under udtørringsprocessen og dermed hjælper med at opretholde biomolekylernes aktivitet ved rehydrering19. Når reaktionerne er stabiliseret inde i reaktionsrørene, kan de opbevares i et par måneder ved 2-8 °C eller et par uger ved 21-23 °C i stedet for de almindelige -20 °C. Denne tilgang er allerede blevet indarbejdet i tests designet til at hjælpe med at diagnosticere sygdomme som Chagas sygdom, malaria, leishmaniasis, tuberkulose og cyclosporiasis13,14,15,20.
Det nuværende arbejde beskriver alle trin til at forberede de nødvendige løsninger til gelificeringsproceduren, faldgruberne i processen og det forventede endelige aspekt af en klar til brug gelificeret qPCR inde i otte-rørstrimler. Den samme protokol kan tilpasses til enkeltrør eller 96-brøndplader. Endelig vil påvisning af T. cruzi DNA blive vist som en kontrolkørsel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bentonite clay bags (activated)</td>
			<td>Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain)</td>
			<td>026157/STD</td>
			<td>Not to be confused with silica gel packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td>Cat# US16445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>Cat# 365650250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melezitoze</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 63620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mastermix</td>
			<td>preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paran&#225; (IBMP, Curitiba, Brazil)</td>
			<td>Chagas NAT kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software for vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>Celsius v10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypanosoma cruzi DNA</td>
			<td>from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>VO-400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms

Real-time PCR (qPCR) er en bemærkelsesværdig følsom og præcis teknik, der giver mulighed for at forstærke små mængder nukleinsyremål fra en lang række prøver. Det er blevet anvendt i vid udstrækning inden for mange forskningsområder og opnået industriel anvendelse inden for områder som human diagnostik og egenskabsudvælgelse i afgrøder af genetisk modificerede organismer (GMO) afgrøder. qPCR er dog ikke en fejlsikker teknik. Blanding af alle reagenser i en enkelt masterblanding, der efterfølgende fordeles på 96 brønde i en almindelig qPCR-plade, kan føre til operatørfejl såsom forkert blanding af reagenser eller unøjagtig dispensering i brøndene. Her præsenteres en teknik kaldet gelificering, hvorved det meste af det vand, der er til stede i masterblandingen, erstattes af reagenser, der danner en sol-gel-blanding, når det underkastes et vakuum. Som et resultat bevares qPCR-reagenser effektivt i et par uger ved stuetemperatur eller et par måneder ved 2-8 oC. Detaljer om fremstilling af hver opløsning vises her sammen med det forventede aspekt af en gelificeret reaktion designet til at detektere T. cruzi-satellit-DNA (satDNA). En lignende procedure kan anvendes til påvisning af andre organismer. Start af en gelificeret qPCR-kørsel er så simpelt som at fjerne pladen fra køleskabet, tilføje prøverne til deres respektive brønde og starte kørslen og dermed reducere opsætningstiden for en fuldpladereaktion på den tid, det tager at indlæse prøverne. Derudover kan gelificerede PCR-reaktioner produceres og kontrolleres for kvalitet i batches, hvilket sparer tid og undgår almindelige operatørfejl, mens du kører rutinemæssige PCR-reaktioner.

Tre af reagenserne, der danner gelifikationsblandingen, opløses let ved kraftig hvirveldannelse. Glykogen kræver dog omhyggelig hvirveldannelse for at sikre, at pulveret er fuldstændigt opløseligt. Desværre producerer kraftig hvirveldannelse masser af bobler, hvilket gør det vanskeligt at bestemme det faktiske volumen af opløsningen (figur 1A-B). Derfor er det vigtigt at lade glykogenopløsningen hvile i køleskabet, indtil det meste af opløsningen f...

Watch this Scientific Journal Video about Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms at JoVE.com

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Det nuværende arbejde beskriver trinene til fremstilling af klar til brug qPCR til T. cruzi DNA-detektion, der kan forudindlæses på reaktionsbeholderen og opbevares i køleskabet i flere måneder.

Klar til brug qPCR til påvisning af DNA fra Trypanosoma cruzi eller andre patogene organismer

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

Gelificeringsprotokollen producerer klar til brug qPCR-reaktioner, der reducerer den tid og de trin, der kræves for at starte en kørsel. Denne protokol gør det muligt at producere og kontrollere qPCR-reaktioner for kvalitet og store mængder på én gang, hvilket reducerer chancerne for operatørfejl under opskriftsberegninger eller aliquoting i brønde. Denne metode kan anvendes på enhver qPCR, der allerede er fuldt optimeret i det konventionelle frosne format.Visuel demonstration af denne metode er vigtig, fordi to af de vigtigste kvalitetskontroltrin er visuelle. For at forberede melezitoseopløsningen vejes fire gram melezitose i et 15 ml plastrør, tilsættes seks milliliter nukleasefrit vand og hvirvel med maksimal hastighed, indtil pulveret er opløst. Lav det endelige volumen til 10 ml med nukleasefrit vand, og mærk og opbevar derefter opløsningen ved to til otte grader Celsius i op til seks måneder.For at forberede trehaloseopløsningen vejes fire gram trehalose i et 15 ml plastrør, tilsættes seks milliliter nukleasefrit vand og hvirvel med maksimal hastighed, indtil pulveret er opløseligt. Derefter fyldes volumen op til 10 ml med nukleasefrit vand og filtreres opløsningen gennem et 0,2 mikron filter. Mærk og opbevar opløsningen ved to til otte grader Celsius i op til seks måneder.For at forberede glykogenopløsningen vejes to gram glykogen i et 15 milliliter rør, tilsættes seks milliliter nukleasefrit vand og hvirvel, indtil pulveret er opløst. Hold opløsningen ved to til otte grader Celsius i otte til 12 timer, fordi opløselsen af glykogen producerer masser af bobler. Den følgende dag, fjernelse af opløsningen fra inkubation, udgør volumenet til 10 ml med nukleasefrit vand og opbevarer den mærkede opløsning ved to til otte grader Celsius i op til seks måneder.For at forberede lysinopløsningen vejes 7,5 milligram lysin i et 15 milliliter rør, tilsættes seks milliliter nukleasefrit vand og hvirvel, indtil pulveret er opløseligt. Der fyldes op til 10 ml med nukleasefrit vand. Opløsningen filtreres gennem et filter på 0,2 mikron, og den opbevares ved to til otte grader Celsius i op til seks måneder.For at forberede gelificeringsblandingen blandes de passende mængder stamopløsninger i et 50 ml plastrør. Bland reagenserne ved at vende røret 10 gange og opbevar den mærkede opløsning ved to til otte grader Celsius i op til tre måneder. For at forberede qPCR-masterblandingen til gelificering optøes reagenserne i en kølebeholder.Bland derefter passende mængder reagenser i et 1,5 milliliter rør for at forberede nok masterblanding til en otte rørstrimmel eller en 96 brøndplade. Næste pipette 18,5 mikroliter af gelifikationsmasteren blandes på hver reaktionsbrønd og placerer rørene eller pladen i den varmeledende understøtning inde i vakuumovnen. Hvis du bruger 96 brøndplader, skal du placere en bentonit lerpose i ovnen for hver to 96 brøndplader til vandabsorption.Når cyklussen er afsluttet, skal du kontrollere rørene eller pladerne for korrekt gelificering af reagenserne ved at sikre, at volumenet er synligt reduceret til ca. fem mikroliter, og væskerne bevæger sig ikke ved at banke rørene eller pladerne med fingrene. Forsegl og opbevar rørene eller pladerne ved to til otte grader Celsius i otte til 12 timer før brug. For at bruge den gelificerede qPCR skal du fjerne rørstrimlen eller pladen fra køleskabet og åbne den i en arbejdsstation til prøvemanipulation.Tilsæt 15 mikroliter nukleasefrit vand og fem mikroliter DNA-prøve til hvert reaktionskar. Forsegl rørene eller pladerne, kør det ønskede eksperiment, og udfør regelmæssig dataanalyse. I den nuværende protokol holdes temperaturen inde i kammeret konstant ved 30 grader Celsius, mens trykket varierer mellem 910 og 930 millibar og nær vakuum.Efter vakuumcyklussen falder masterblandingen inde i røret i volumen, bliver gelificeret i bunden og sprøjter ikke på væggene, når rørene tappes. Hvis gelificeringen er ufuldstændig, sprøjter væsken på rørvæggene, når rørene tappes. Trypanosoma cruzi-DNA-detektion ved hjælp af offentliggjorte oligonukleotidsekvenser er vist her.Detektion af den samme prøve, når gelificering ikke blev udført korrekt, resulterede i tab af følsomhed. Det mest kritiske trin er beregningen af reagensvolumen inden gelificering. Operatøren skal huske ikke at tilsætte vand, da det vil blive fjernet under processen.Hvis protokoltrinnene følges nøje, vil operatører med grundlæggende laboratorie- og molekylærbiologiske færdigheder ikke have problemer med at udføre gelificeringsprocessen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Påvisning og visualisering af DNA-skader-inducerede proteinkomplekser i suspensionscellekulturer ved anvendelse af Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Påvisning af fosfolipase C aktivitet i hjernen homogenatet fra honningbien

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolering af F1-ATPase fra parasitære Protist Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Forberedelse af grønkorn sub rum fra Arabidopsis til analyse af Protein lokalisering af Immunoblotting eller Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Undersøgelse af metabolismen af seks systemiske insekticider i en nyetableret celle affjedrings kultur afledt af te (Camellia sinensis L.) Blade

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA elektroforese ved hjælp af Thiazole Orange i stedet for ethidiumbromid eller Alternative farvestoffer

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sekvens genkendelse af DNA Primase ved hjælp af Primase profilering med høj gennemløb

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbaseret endonukleasekoblet DNA-methyleringsassay til screening for DNA-methyltransferasehæmmere

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Enkeltmolekylebilleddannelse af EWS-FLI1-kondensater, der samles på DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

In vitro Lægemiddelscreening mod alle livscyklusfaser af Trypanosoma cruzi ved hjælp af parasitter, der udtrykker β-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...