Name: ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms
Uploaded: 2022-01-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms at JoVE.com

De auteurs willen hun dank uitspreken aan Aline Burda Farias voor de technische assistentie met de vacuümoven, evenals aan de administratie van het Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brazilië) voor het verlenen van toegang tot de genoemde apparatuur. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door subsidie CNPq 445954/2020-5.

1. Bereiding van stamoplossingen en gelificatiemengsel
OPMERKING: Er worden vier stamoplossingen bereid (400 mg/ml melezitose, 400 mg/ml trehalose, 0,75 mg/ml lysine en 200 mg/ml glycogeen) en gemengd volgens de verhouding in tabel 1 om het gelificatiemengsel te produceren. Hoewel het protocol 10 ml productie van voorraadoplossingen beschrijft, kan het worden aangepast voor lagere of hogere volumes.
<ol><li>Melezitose oplossing<ol><li>Weeg 4 g melezitose in ...

<ol>
	<li>Lewinsohn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carlos+Chagas+(1879-1934):+the+discovery+of+Trypanosoma+cruzi+and+of+American+trypanosomiasis+(foot-notes+to+the+history+of+Chagas's+disease).">Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease).</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).</li><li>Bern, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+Chagas+disease+in+the+United+States:+A+systematic+review.">Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review.</a> The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).</li><li>Pereira, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease+as+a+foodborne+illness.">Chagas' disease as a foodborne illness.</a> Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).</li><li>Tanowitz, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease.">Chagas' disease.</a> Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).</li><li>Rassi, A., Marin-Neto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+validation+of+quantitative+real-time+PCR+methods+for+quantification+of+trypanosoma+cruzi+DNA+in+blood+samples+from+chagas+disease+patients.">Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).</li><li>Rivero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Trypanosoma+cruzi+by+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+potential+novel+tool+for+the+detection+of+congenital+Chagas+infection.">Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).</li><li>Schijman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnosis+of+Trypanosoma+cruzi.">Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi.</a> Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).</li><li>Besuschio, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+cruzi+loop-mediated+isothermal+amplification+(Trypanosoma+cruzi+Loopamp)+kit+for+detection+of+congenital,+acute+and+Chagas+disease+reactivation.">Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).</li><li>Duffy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+real-time+PCR+strategy+for+monitoring+bloodstream+parasitic+loads+in+chagas+disease+patients.">Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).</li><li>Melo, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+real+time+PCR+to+quantify+parasite+load+in+serum+samples+from+chronic+Chagas+disease+patients.">Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients.</a> Parasites &amp; Vectors. 8 (1), 154 (2015).</li><li>Parrado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+serial+blood+sampling+and+PCR+replicates+for+treatment+monitoring+of+patients+with+chronic+Chagas+disease.">Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).</li><li>de Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ready-to-use+duplex+qPCR+to+detect+Leishmania+infantum+DNA+in+naturally+infected+dogs.">A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs.</a> Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).</li><li>Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+concept+for+a+portable+platform+for+molecular+diagnosis+of+tropical+diseases.">Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).</li><li>Costa, A. D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready-to-use+qPCR+for+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+or+Trypanosoma+cruzi+in+food+matrices.">Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices.</a> Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-storage+of+gelified+reagents+in+a+lab-on-a-foil+system+for+rapid+nucleic+acid+analysis.">Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis.</a> Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).</li><li>Kamau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample-ready+multiplex+qPCR+assay+for+detection+of+malaria.">Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria.</a> Malaria Journal. 13, 158 (2014).</li><li>Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+further+challenges+in+lyophilization.">Recent advances and further challenges in lyophilization.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).</li><li>Rosado, P. M. F. S., L&#243;pez, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+preparing+stabilised+reaction+mixtures,+which+are+totally+or+partially+dried,+comprising+at+least+one+enzyme,+reaction+mixtures+and+kits+containing+said+mixtures.">Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures.</a> PubChem. , (2002).</li><li>Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+fast+and+easy+sample-to-answer+protocol+for+tuberculosis+screening+in+point-of-care+settings:+A+proof+of+concept+study.">Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study.</a> PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).</li><li>Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+improved+U.S.+food+and+drug+administration+method+for+the+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+in+produce+using+real-time+PCR.">Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR.</a> Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).</li><li>Iglesias, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+new+gelled+nested+PCR+test+for+the+diagnosis+of+imported+malaria:+comparison+with+microscopy,+rapid+diagnostic+test,+and+real-time+PCR.">Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR.</a> Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).</li><li>Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnostics+for+Chagas+disease:+up+to+date+and+novel+methodologies.">Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).</li></ol>

De afgelopen jaren hebben de noodzaak benadrukt om meer gevoelige en specifieke technologieën te vinden om tropische en verwaarloosde ziekten te helpen diagnosticeren. Hoewel belangrijk voor epidemiologische controle, hebben parasitologische (optische microscopie) en serologische tests beperkingen, vooral met betrekking tot gevoeligheid en point-of-care toepasbaarheid. DNA-amplificatietechnieken zoals PCR, isothermische amplificatie en respectieve variaties worden al lang gebruikt in laboratoriumomgevingen, maar technol...

De ziekte van Chagas werd ontdekt in het begin van de20e eeuw in landelijke regio's van Brazilië, waar armoede wijdverspreid was 1,2. Zelfs vandaag de dag is de ziekte nog steeds verbonden met sociale en economische determinanten van gezondheid in Amerika. De ziekte van Chagas is bifasisch en bestaat uit een acute en een chronische fase. Het wordt veroorzaakt door infectie door de Trypanosoma cruzi-parasiet, overgedragen door insectenvectoren, bloedtransfusies via een aangeboren route of orale inname van besmet voedsel 3,4.
De diagnose van de ziekte van Chagas kan worden gemaakt door de observatie van klinische symptomen (met name het Romaña-teken), bloeduitstrijkjesmicroscopie, serologie en moleculaire tests zoals real-time PCR (qPCR) of isothermische amplificatie 4,5,6,7,8,9. Klinische symptomen en bloeduitstrijkjesmicroscopie worden gebruikt in vermoedelijke gevallen van acute infecties, terwijl de zoektocht naar antilichamen wordt gebruikt als screeningsinstrument bij asymptomatische patiënten. Vanwege de gevoeligheid en specificiteit is voorgesteld dat qPCR wordt gebruikt als een monitoringinstrument voor chronische patiënten, voor acute patiënten die een behandeling ondergaan waarbij de parasietbelasting in het bloed wordt gemeten, en als een surrogaatmarker van therapeutisch falen 6,8,10,11,12 . Hoewel gevoeliger en specifieker dan momenteel beschikbare tests, wordt qPCR effectief voorkomen dat het bekend staat als diagnostische hulpmiddelen in kansarme regio's over de hele wereld vanwege de vereiste van vriestemperaturen voor transport en opslag 13,14,15.
Om dit obstakel te omzeilen, zijn conserveringstechnieken zoals lyofilisatie en gelificatie onderzocht16,17. Hoewel lyofilisatie jarenlang conservatie biedt, vereist het speciaal gemaakte reagentia zonder de aanwezigheid van glycerol, dat vaak wordt gebruikt voor enzymstabilisatie / -behoud18. Hoewel al maanden is aangetoond dat gelificatie conservatie biedt, maakt het het gebruik van reguliere reagentia mogelijk19. De gelificatieoplossing bestaat uit vier componenten, elk met specifieke rollen in het proces: de suikers trehalose en melezitose beschermen de biomoleculen tijdens het uitdrogingsproces door vrije watermoleculen in de oplossing te verminderen, glycogeen produceert een bredere beschermende matrix en het aminozuur lysine wordt gebruikt als een vrije radicalenvanger om de oxiderende reacties tussen de carboxyl van het biomolecuul te remmen, amino- en fosfaatgroepen. Deze componenten definiëren een sol-gelmengsel dat het verlies van de tertiaire of quaternaire structuur tijdens het uitdrogingsproces voorkomt, waardoor de activiteit van de biomoleculen bij rehydratatie wordt gehandhaafd19. Eenmaal gestabiliseerd in de reactiebuizen, kunnen de reacties enkele maanden worden bewaard bij 2-8 °C of enkele weken bij 21-23 °C in plaats van de normale -20 °C. Deze aanpak is al opgenomen in tests die zijn ontworpen om ziekten zoals de ziekte van Chagas, malaria, leishmaniasis, tuberculose en cyclosporiasis 13,14,15,20 te helpen diagnosticeren.
Het huidige werk beschrijft alle stappen om de vereiste oplossingen voor de gelificatieprocedure voor te bereiden, de valkuilen in het proces en het verwachte laatste aspect van een kant-en-klare gelified qPCR in stroken met acht buizen. Hetzelfde protocol kan worden aangepast voor enkele buizen of 96-well platen. Ten slotte zal de detectie van T. cruzi DNA worden getoond als een controlerun.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bentonite clay bags (activated)</td>
			<td>Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain)</td>
			<td>026157/STD</td>
			<td>Not to be confused with silica gel packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td>Cat# US16445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>Cat# 365650250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melezitoze</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 63620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mastermix</td>
			<td>preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paran&#225; (IBMP, Curitiba, Brazil)</td>
			<td>Chagas NAT kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software for vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>Celsius v10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypanosoma cruzi DNA</td>
			<td>from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>VO-400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms

Real-time PCR (qPCR) is een opmerkelijk gevoelige en nauwkeurige techniek die het mogelijk maakt om minieme hoeveelheden nucleïnezuurdoelen uit een groot aantal monsters te versterken. Het is op grote schaal gebruikt in vele onderzoeksgebieden en bereikte industriële toepassing op gebieden zoals menselijke diagnostiek en selectie van eigenschappen in gewassen van genetisch gemodificeerde organismen (GMO) gewassen. QPCR is echter geen foutbestendige techniek. Het mengen van alle reagentia in een enkele mastermix die vervolgens op 96 putten van een gewone qPCR-plaat wordt verdeeld, kan leiden tot fouten van de operator, zoals onjuiste menging van reagentia of onnauwkeurige afgifte in de putten. Hier wordt een techniek gepresenteerd die gelificatie wordt genoemd, waarbij het grootste deel van het water in de hoofdmix wordt vervangen door reagentia die een sol-gelmengsel vormen wanneer het aan een vacuüm wordt onderworpen. Als gevolg hiervan worden qPCR-reagentia effectief bewaard gedurende een paar weken bij kamertemperatuur of een paar maanden bij 2-8 oC. Details over het bereiden van elke oplossing worden hier weergegeven, samen met het verwachte aspect van een gelified reactie die is ontworpen om T. cruzi-satelliet-DNA (satDNA) te detecteren. Een soortgelijke procedure kan worden toegepast om andere organismen te detecteren. Het starten van een gelified qPCR-run is net zo eenvoudig als het verwijderen van de plaat uit de koelkast, het toevoegen van de monsters aan hun respectieve putten en het starten van de run, waardoor de insteltijd van een volledige plaatreactie wordt verkort tot de tijd die nodig is om de monsters te laden. Bovendien kunnen gelified PCR-reacties worden geproduceerd en gecontroleerd op kwaliteit in batches, waardoor tijd wordt bespaard en veelvoorkomende fouten van de operator worden vermeden tijdens het uitvoeren van routinematige PCR-reacties.

Drie van de reagentia die het gelificatiemengsel vormen, worden gemakkelijk opgelost bij krachtige vortexing. Glycogeen vereist echter zorgvuldige vortexing om ervoor te zorgen dat het poeder volledig is opgelost. Helaas produceert krachtig vortexen veel bellen, waardoor het moeilijk is om het werkelijke volume van de oplossing te bepalen (figuur 1A-B). Daarom is het essentieel om de glycogeenoplossing in de koelkast te laten rusten totdat het grootste deel ...

Watch this Scientific Journal Video about Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms at JoVE.com

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Het huidige werk beschrijft de stappen voor het produceren van kant-en-klare qPCR voor T. cruzi DNA-detectie die vooraf op het reactievat kan worden geladen en gedurende enkele maanden in de koelkast kan worden bewaard.

Kant-en-klare qPCR voor detectie van DNA van Trypanosoma cruzi of andere pathogene organismen

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

Het gelificatieprotocol produceert gebruiksklare qPCR-reacties die de tijd en stappen verminderen die nodig zijn om een run te starten. Dit protocol maakt het mogelijk om qPCR-reacties te produceren en te controleren op kwaliteit en grote hoeveelheden tegelijk, waardoor de kans op operatorfouten tijdens receptberekeningen of aliquoting in putten wordt verkleind. Deze methode kan worden toegepast op elke qPCR die al volledig is geoptimaliseerd in het conventionele bevroren formaat.Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk omdat twee van de belangrijkste stappen voor kwaliteitscontrole visueel zijn. Om de melezitose-oplossing te bereiden, weegt u vier gram melezitose in een plastic buis van 15 milliliter, voegt u zes milliliter nucleasevrij water toe en vortex op maximale snelheid totdat het poeder is opgelost. Maak het uiteindelijke volume tot 10 milliliter met nucleasevrij water, label en bewaar de oplossing vervolgens bij twee tot acht graden Celsius gedurende maximaal zes maanden.Om de trehalose-oplossing te bereiden, weegt u vier gram trehalose in een plastic buis van 15 milliliter, voegt u zes milliliter nucleasevrij water en vortex toe met de maximale snelheid totdat het poeder is opgelost. Vul vervolgens het volume aan tot 10 milliliter met nucleasevrij water en filter de oplossing door een filter van 0,2 micron. Label en bewaar de oplossing bij twee tot acht graden Celsius gedurende maximaal zes maanden.Om de glycogeenoplossing te bereiden, weegt u twee gram glycogeen in een buis van 15 milliliter, voegt u zes milliliter nucleasevrij water toe en vortex totdat het poeder is opgelost. Houd de oplossing acht tot 12 uur op twee tot acht graden Celsius, omdat de oplosbaarheid van glycogeen veel bubbels produceert. De volgende dag, het verwijderen van de oplossing uit incubatie, maak het volume tot 10 milliliter met nucleasevrij water en bewaar de gelabelde oplossing bij twee tot acht graden Celsius gedurende maximaal zes maanden.Om de lysine-oplossing te bereiden, weegt u 7,5 milligram lysine in een buis van 15 milliliter, voegt u zes milliliter nucleasevrij water toe en vortex totdat het poeder is opgelost. Vul het volume aan tot 10 milliliter met nucleasevrij water. Filtreer de oplossing door een filter van 0,2 micron en bewaar deze maximaal zes maanden bij twee tot acht graden Celsius.Om het gelificatiemengsel te bereiden, mengt u de juiste volumes voorraadoplossingen in een plastic buis van 50 milliliter. Meng de reagentia door de buis 10 keer om te keren en bewaar de gelabelde oplossing bij twee tot acht graden Celsius gedurende maximaal drie maanden. Om de qPCR-mastermix voor gelificatie te bereiden, ontdooit u de reagentia in een gekoelde container.Meng vervolgens de juiste volumes van de reagentia in een buis van 1,5 milliliter om voldoende hoofdmengsel te bereiden voor een strip met acht buizen of een plaat met 96 putten. Vervolgens pipet 18,5 microliter van de gelificatiemaster op elke reactieput en plaatst de buizen of plaat in de warmtegeleidende ondersteuning in de vacuümoven. Als u 96 putplaten gebruikt, plaatst u één bentoniet kleizak in de oven voor elke twee 96 putplaten voor waterabsorptie.Wanneer de cyclus is voltooid, controleert u de buizen of platen op de juiste gelificatie van de reagentia door ervoor te zorgen dat het volume zichtbaar wordt teruggebracht tot ongeveer vijf microliter en dat de vloeistoffen niet bewegen bij het tikken op de buizen of platen met vingers. Sluit de buizen of platen af en bewaar ze acht tot acht graden Celsius gedurende acht tot 12 uur voor gebruik. Om de gelified qPCR te gebruiken, verwijdert u de buisstrip of -plaat uit de koelkast en opent u deze in een werkstation voor monstermanipulatie.Voeg 15 microliter nucleasevrij water en vijf microliter DNA-monster toe aan elk reactievat. Sluit de buizen of platen af, voer het gewenste experiment uit en voer regelmatig gegevensanalyse uit. In het huidige protocol wordt de temperatuur in de kamer constant gehouden op 30 graden Celsius, terwijl de druk varieert tussen 910 en 930 millibar en bijna vacuüm.Na de vacuümcyclus neemt de mastermix in de buis in volume af, wordt gelificeerd aan de onderkant en spat niet op de wanden wanneer de buizen worden getapt. Als de gelificatie onvolledig is, spat de vloeistof op de buiswanden wanneer de buizen worden afgetapt. Trypanosoma cruzi-DNA detectie met behulp van gepubliceerde oligonucleotide sequenties wordt hier getoond.Detectie van hetzelfde monster wanneer gelificatie niet correct werd uitgevoerd, resulteerde in een verlies van gevoeligheid. De meest kritieke stap is de berekening van het reagensvolume voorafgaand aan gelificatie. De operator moet onthouden om geen water toe te voegen, omdat het tijdens het proces wordt verwijderd.Als de protocolstappen nauwgezet worden gevolgd, zullen operators met elementaire laboratorium- en moleculaire biologievaardigheden geen moeite hebben om het gelificatieproces uit te voeren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Detectie van Phospholipase C activiteit in de hersenen homogenaat van de honingbij

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolatie van F1-ATPase van de parasitaire Protist Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Voorbereiding van Chloroplast sub compartimenten van Arabidopsis voor de analyse van eiwit lokalisatie door Immunoblotting of Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie over het metabolisme van zes systemische insecticiden in een nieuw opgerichte cel schorsing cultuur afgeleid van thee (Camellia sinensis L.) Bladeren

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

De Elektroforese van het DNA met behulp van Thiazole oranje in plaats van ethidiumbromide of alternatieve kleurstoffen

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sequentie herkenning door DNA primase met behulp van high-throughput Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Single-molecule Imaging van EWS-FLI1 condensaten assembleren op DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

In vitro Drugsscreening tegen alle levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi met behulp van parasieten die β-galactosidase tot expressie brengen

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...