Name: ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms
Uploaded: 2022-01-20T12:30:00
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Les auteurs tiennent à exprimer leur gratitude à Aline Burda Farias pour l’assistance technique avec le four à vide, ainsi qu’à l’administration de l’Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brésil) pour avoir permis l’accès audit équipement. Ces travaux ont été partiellement financés par la subvention CNPq 445954/2020-5.

1. Préparation des solutions mères et du mélange de gélification
REMARQUE : Quatre solutions mères seront préparées (400 mg/mL de mélezitose, 400 mg/mL de tréhalose, 0,75 mg/mL de lysine et 200 mg/mL de glycogène) et mélangées selon la proportion indiquée au tableau 1 pour produire le mélange de gélification. Bien que le protocole décrive 10 ml de production de solutions mères, il peut être adapté à des volumes plus ou moins élevés.
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	<li>Lewinsohn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carlos+Chagas+(1879-1934):+the+discovery+of+Trypanosoma+cruzi+and+of+American+trypanosomiasis+(foot-notes+to+the+history+of+Chagas's+disease).">Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease).</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).</li><li>Bern, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+Chagas+disease+in+the+United+States:+A+systematic+review.">Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review.</a> The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).</li><li>Pereira, K. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+real+time+PCR+to+quantify+parasite+load+in+serum+samples+from+chronic+Chagas+disease+patients.">Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients.</a> Parasites &amp; Vectors. 8 (1), 154 (2015).</li><li>Parrado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+serial+blood+sampling+and+PCR+replicates+for+treatment+monitoring+of+patients+with+chronic+Chagas+disease.">Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).</li><li>de Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ready-to-use+duplex+qPCR+to+detect+Leishmania+infantum+DNA+in+naturally+infected+dogs.">A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs.</a> Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).</li><li>Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+concept+for+a+portable+platform+for+molecular+diagnosis+of+tropical+diseases.">Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).</li><li>Costa, A. D. 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C., Winter, G., Friess, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+further+challenges+in+lyophilization.">Recent advances and further challenges in lyophilization.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).</li><li>Rosado, P. M. F. S., L&#243;pez, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+preparing+stabilised+reaction+mixtures,+which+are+totally+or+partially+dried,+comprising+at+least+one+enzyme,+reaction+mixtures+and+kits+containing+said+mixtures.">Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures.</a> PubChem. , (2002).</li><li>Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+fast+and+easy+sample-to-answer+protocol+for+tuberculosis+screening+in+point-of-care+settings:+A+proof+of+concept+study.">Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study.</a> PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).</li><li>Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. 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G., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnostics+for+Chagas+disease:+up+to+date+and+novel+methodologies.">Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).</li></ol>

Ces dernières années ont mis en évidence la nécessité de trouver des technologies plus sensibles et spécifiques pour aider à diagnostiquer les maladies tropicales et négligées. Bien qu’importants pour le contrôle épidémiologique, les tests parasitologiques (microscopie optique) et sérologiques ont des limites, en particulier en ce qui concerne la sensibilité et l’applicabilité au point de service. Les techniques d’amplification de l’ADN telles que la PCR, l’amplification isotherme et les variatio...

La maladie de Chagas a été découverte au début du 20èmesiècle dans les régions rurales du Brésil, où la pauvreté était répandue 1,2. Même aujourd’hui, la maladie continue d’être liée aux déterminants sociaux et économiques de la santé dans les Amériques. La maladie de Chagas est biphasique, comprenant une phase aiguë et une phase chronique. Elle est causée par une infection par le parasite Trypanosoma cruzi, transmise par des insectes vecteurs, des transfusions sanguines par voie congénitale ou l’ingestion orale d’aliments contaminés 3,4.
Le diagnostic de la maladie de Chagas peut être effectué par l’observation des symptômes cliniques (en particulier le signe Romaña), la microscopie par frottis sanguin, la sérologie et les tests moléculaires tels que la PCR en temps réel (qPCR) ou l’amplification isotherme 4,5,6,7,8,9. Les symptômes cliniques et la microscopie par frottis sanguin sont utilisés dans les cas suspects d’infections aiguës, tandis que la recherche d’anticorps est utilisée comme outil de dépistage chez les patients asymptomatiques. En raison de sa sensibilité et de sa spécificité, il a été suggéré que la qPCR soit utilisée comme outil de surveillance pour les patients chroniques, pour les patients en phase aiguë subissant un traitement mesurant la charge parasitaire dans le sang et comme marqueur de substitution de l’échec thérapeutique 6,8,10,11,12 . Bien que plus sensibles et spécifiques que les tests actuellement disponibles, la qPCR est effectivement empêchée d’être connue comme outil de diagnostic dans les régions défavorisées du monde entier en raison de l’exigence de températures de congélation pour le transport et le stockage13,14,15.
Pour contourner cet obstacle, des techniques de conservation telles que la lyophilisation et la gélification ont été explorées16,17. Bien que la lyophilisation assure la conservation pendant des années, elle nécessite des réactifs spécialement fabriqués sans la présence de glycérol, qui est couramment utilisé pour la stabilisation / conservation des enzymes18. Bien qu’il ait été démontré que la gélification assure la conservation pendant des mois, elle permet l’utilisation de réactifs réguliers19. La solution de gélification comprend quatre composants, chacun ayant des rôles spécifiques dans le processus: les sucres tréhalose et mélézitose protègent les biomolécules pendant le processus de dessiccation en réduisant les molécules d’eau libre dans la solution, le glycogène produit une matrice protectrice plus large et l’acide aminé lysine est utilisé comme piégeur de radicaux libres pour inhiber les réactions oxydantes entre le carboxyle de la biomolécule, groupes amino et phosphate. Ces composants définissent un mélange sol-gel qui empêche la perte de la structure tertiaire ou quaternaire pendant le processus de dessiccation, aidant ainsi à maintenir l’activité des biomolécules lors de la réhydratation19. Une fois stabilisées à l’intérieur des tubes de réaction, les réactions peuvent être conservées pendant quelques mois à 2-8 °C ou quelques semaines à 21-23 °C au lieu des -20 °C normales. Cette approche a déjà été intégrée dans des tests conçus pour aider à diagnostiquer des maladies telles que la maladie de Chagas, le paludisme, la leishmaniose, la tuberculose et la cyclosporose13,14,15,20.
Le présent travail décrit toutes les étapes pour préparer les solutions requises pour la procédure de gélification, les pièges du processus et l’aspect final attendu d’une qPCR gélifiée prête à l’emploi à l’intérieur de bandes à huit tubes. Le même protocole peut être adapté pour les tubes simples ou les plaques à 96 puits. Enfin, la détection de l’ADN de T. cruzi sera présentée sous forme de contrôle.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bentonite clay bags (activated)</td>
			<td>Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain)</td>
			<td>026157/STD</td>
			<td>Not to be confused with silica gel packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td>Cat# US16445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>Cat# 365650250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melezitoze</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 63620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mastermix</td>
			<td>preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paran&#225; (IBMP, Curitiba, Brazil)</td>
			<td>Chagas NAT kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software for vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>Celsius v10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypanosoma cruzi DNA</td>
			<td>from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>VO-400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms

La PCR en temps réel (qPCR) est une technique remarquablement sensible et précise qui permet d’amplifier des quantités infimes de cibles d’acides nucléiques à partir d’une multitude d’échantillons. Il a été largement utilisé dans de nombreux domaines de recherche et a atteint une application industrielle dans des domaines tels que le diagnostic humain et la sélection de caractères dans les cultures d’organismes génétiquement modifiés (OGM). Cependant, la qPCR n’est pas une technique à l’épreuve des erreurs. Le mélange de tous les réactifs en un seul mélange maître distribué par la suite sur 96 puits d’une plaque qPCR ordinaire peut entraîner des erreurs de l’opérateur telles qu’un mélange incorrect des réactifs ou une distribution inexacte dans les puits. Ici, une technique appelée gélification est présentée, par laquelle la majeure partie de l’eau présente dans le mélange maître est remplacée par des réactifs qui forment un mélange sol-gel lorsqu’ils sont soumis à un vide. En conséquence, les réactifs qPCR sont efficacement conservés pendant quelques semaines à température ambiante ou quelques mois à 2-8 °C. Les détails de la préparation de chaque solution sont présentés ici avec l’aspect attendu d’une réaction gélifiée conçue pour détecter l’ADN satellite de T. cruzi (ADNsatellite). Une procédure similaire peut être appliquée pour détecter d’autres organismes. Le démarrage d’une qPCR gélifiée est aussi simple que de retirer la plaque du réfrigérateur, d’ajouter les échantillons à leurs puits respectifs et de commencer l’exécution, réduisant ainsi le temps de configuration d’une réaction sur plaque complète au temps nécessaire pour charger les échantillons. De plus, les réactions PCR gélifiées peuvent être produites et contrôlées pour la qualité par lots, ce qui permet de gagner du temps et d’éviter les erreurs courantes de l’opérateur lors de l’exécution de réactions PCR de routine.

Trois des réactifs qui forment le mélange de gélification sont facilement solubilisés lors d’un tourbillon vigoureux. Cependant, le glycogène nécessite un tourbillon minutieux pour s’assurer que la poudre a été complètement solubilisée. Malheureusement, un tourbillon vigoureux produit beaucoup de bulles, ce qui rend difficile la détermination du volume réel de la solution (Figure 1A-B). Par conséquent, il est essentiel de laisser la solution...

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Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Le présent travail décrit les étapes de production d’une qPCR prête à l’emploi pour la détection de l’ADN de T. cruzi qui peut être préchargée sur la cuve de réaction et conservée au réfrigérateur pendant plusieurs mois.

qPCR prête à l’emploi pour la détection de l’ADN de Trypanosoma cruzi ou d’autres organismes pathogènes

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

Le protocole de gélification produit des réactions qPCR prêtes à l’emploi qui diminuent le temps et les étapes nécessaires pour commencer une course. Ce protocole permet de produire et de contrôler la qualité et les grandes quantités des réactions qPCR à la fois, ce qui réduit les risques d’erreur de l’opérateur lors des calculs de recette ou de l’aliquote dans les puits. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle qPCR déjà entièrement optimisée dans le format congelé conventionnel.La démonstration visuelle de cette méthode est importante parce que deux des principales étapes du contrôle de la qualité sont visuelles. Pour préparer la solution de mélezitose, pesez quatre grammes de mélezitose dans un tube en plastique de 15 millilitres, ajoutez six millilitres d’eau sans nucléase et tourbillonnez à la vitesse maximale jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée. Faire le volume final à 10 millilitres avec de l’eau sans nucléase, puis étiqueter et stocker la solution à deux à huit degrés Celsius jusqu’à six mois.Pour préparer la solution de tréhalose, pesez quatre grammes de tréhalose dans un tube en plastique de 15 millilitres, ajoutez six millilitres d’eau sans nucléase et vortex à la vitesse maximale jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée. Ensuite, porter le volume à 10 millilitres avec de l’eau sans nucléase et filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 micron. Étiquetez et conservez la solution à une température de deux à huit degrés Celsius pendant une période allant jusqu’à six mois.Pour préparer la solution de glycogène, pesez deux grammes de glycogène dans un tube de 15 millilitres, ajoutez six millilitres d’eau sans nucléase et vortex jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée. Gardez la solution à deux à huit degrés Celsius pendant huit à 12 heures parce que la solubilisation du glycogène produit beaucoup de bulles. Le lendemain, en retirant la solution de l’incubation, porter le volume à 10 millilitres avec de l’eau sans nucléase et stocker la solution étiquetée à une température de deux à huit degrés Celsius pendant six mois.Pour préparer la solution de lysine, pesez 7,5 milligrammes de lysine dans un tube de 15 millilitres, ajoutez six millilitres d’eau sans nucléase et vortex jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée. Compléter le volume à 10 millilitres avec de l’eau sans nucléase. Filtrez la solution à travers un filtre de 0,2 micron et conservez-la entre deux et huit degrés Celsius pendant six mois.Pour préparer le mélange de gélification, mélangez les volumes appropriés de solutions mères dans un tube en plastique de 50 millilitres. Mélanger les réactifs en retournant le tube 10 fois et conserver la solution étiquetée à deux à huit degrés Celsius pendant trois mois. Pour préparer le mélange maître qPCR pour la gélification, décongelez les réactifs dans un récipient réfrigéré.Ensuite, mélanger les volumes appropriés de réactifs dans un tube de 1,5 millilitre pour préparer suffisamment de mélange maître pour une bande de huit tubes ou une plaque de 96 puits. Ensuite, pipeter 18,5 microlitres du mélange maître de gélification sur chaque puits de réaction et placer les tubes ou la plaque dans le support conducteur de chaleur à l’intérieur du four à vide. Si vous utilisez des plaques de 96 puits, placez un sac d’argile bentonite dans le four pour deux plaques de 96 puits pour l’absorption d’eau.Lorsque le cycle est terminé, vérifiez les tubes ou les plaques pour une bonne gélification des réactifs en vous assurant que le volume est visiblement réduit à environ cinq microlitres et que les liquides ne bougent pas en tapotant les tubes ou les plaques avec les doigts. Scellez et entreposez les tubes ou les plaques à une température de deux à huit degrés Celsius pendant huit à 12 heures avant utilisation. Pour utiliser la qPCR gélifiée, retirez la bande ou la plaque du tube du réfrigérateur et ouvrez-la dans un poste de travail pour la manipulation des échantillons.Ajouter 15 microlitres d’eau exempte de nucléases et cinq microlitres d’échantillon d’ADN à chaque récipient de réaction. Scellez les tubes ou les plaques, exécutez l’expérience souhaitée et effectuez une analyse régulière des données. Dans le protocole actuel, la température à l’intérieur de la chambre est maintenue constante à 30 degrés Celsius, tandis que la pression varie entre 910 et 930 millibars et proche du vide.Après le cycle de vide, le mélange principal à l’intérieur du tube diminue en volume, devient gélifié au fond et n’éclabousse pas les parois lorsque les tubes sont taraudés. Si la gélification est incomplète, le liquide éclabousse sur les parois du tube lorsque les tubes sont tapotés. La détection de l’ADN de Trypanosoma cruzi à l’aide de séquences d’oligonucléotides publiées est présentée ici.La détection du même échantillon lorsque la gélification n’a pas été correctement exécutée a entraîné une perte de sensibilité. L’étape la plus critique est le calcul du volume des réactifs avant la gélification. L’opérateur doit se rappeler de ne pas ajouter d’eau, car elle sera éliminée pendant le processus.Si les étapes du protocole sont suivies de près, les opérateurs ayant des compétences de base en laboratoire et en biologie moléculaire n’auront aucune difficulté à effectuer le processus de gélification.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

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Recherche

Biochimie

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Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

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Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Imagerie à molécule unique de condensats EWS-FLI1 assemblés sur de l’ADN

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

In vitro Dépistage médicamenteux contre tous les stades du cycle de vie du trypanosoma cruzi à l’aide de parasites exprimant la β-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...