Name: ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms
Uploaded: 2022-01-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms at JoVE.com

המחברים רוצים להביע את תודתם לאלין בורדה פאריאס על הסיוע הטכני עם תנור הוואקום, כמו גם לממשל במכון הביולוגי המולקולרי דו פרנה (IBMP, קוריטיבה, ברזיל) על שאיפשר גישה לציוד האמור. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענק CNPq 445954/2020-5.

1. הכנת תמיסות מלאי ותערובת ג'ליפיקציה
הערה: ארבעה תמיסות מלאי יוכנו (400 מ"ג/מ"ל של מלזיטוז, 400 מ"ג/מ"ל של טרהלוז, 0.75 מ"ג/מ"ל של ליזין ו-200 מ"ג/מ"ל של גליקוגן) ויתערבבו בהתאם לשיעור המוצג בטבלה 1 כדי לייצר את תערובת הג'ליפיקציה. למרות שהפרוטוקול מתאר 10 מ"ל של ייצור פתר?...

<ol>
	<li>Lewinsohn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carlos+Chagas+(1879-1934):+the+discovery+of+Trypanosoma+cruzi+and+of+American+trypanosomiasis+(foot-notes+to+the+history+of+Chagas's+disease).">Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease).</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).</li><li>Bern, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+Chagas+disease+in+the+United+States:+A+systematic+review.">Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review.</a> The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).</li><li>Pereira, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease+as+a+foodborne+illness.">Chagas' disease as a foodborne illness.</a> Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).</li><li>Tanowitz, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease.">Chagas' disease.</a> Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).</li><li>Rassi, A., Marin-Neto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+validation+of+quantitative+real-time+PCR+methods+for+quantification+of+trypanosoma+cruzi+DNA+in+blood+samples+from+chagas+disease+patients.">Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).</li><li>Rivero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Trypanosoma+cruzi+by+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+potential+novel+tool+for+the+detection+of+congenital+Chagas+infection.">Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).</li><li>Schijman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnosis+of+Trypanosoma+cruzi.">Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi.</a> Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).</li><li>Besuschio, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+cruzi+loop-mediated+isothermal+amplification+(Trypanosoma+cruzi+Loopamp)+kit+for+detection+of+congenital,+acute+and+Chagas+disease+reactivation.">Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).</li><li>Duffy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+real-time+PCR+strategy+for+monitoring+bloodstream+parasitic+loads+in+chagas+disease+patients.">Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).</li><li>Melo, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+real+time+PCR+to+quantify+parasite+load+in+serum+samples+from+chronic+Chagas+disease+patients.">Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients.</a> Parasites &amp; Vectors. 8 (1), 154 (2015).</li><li>Parrado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+serial+blood+sampling+and+PCR+replicates+for+treatment+monitoring+of+patients+with+chronic+Chagas+disease.">Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).</li><li>de Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ready-to-use+duplex+qPCR+to+detect+Leishmania+infantum+DNA+in+naturally+infected+dogs.">A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs.</a> Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).</li><li>Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+concept+for+a+portable+platform+for+molecular+diagnosis+of+tropical+diseases.">Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).</li><li>Costa, A. D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready-to-use+qPCR+for+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+or+Trypanosoma+cruzi+in+food+matrices.">Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices.</a> Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-storage+of+gelified+reagents+in+a+lab-on-a-foil+system+for+rapid+nucleic+acid+analysis.">Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis.</a> Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).</li><li>Kamau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample-ready+multiplex+qPCR+assay+for+detection+of+malaria.">Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria.</a> Malaria Journal. 13, 158 (2014).</li><li>Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+further+challenges+in+lyophilization.">Recent advances and further challenges in lyophilization.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).</li><li>Rosado, P. M. F. S., L&#243;pez, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+preparing+stabilised+reaction+mixtures,+which+are+totally+or+partially+dried,+comprising+at+least+one+enzyme,+reaction+mixtures+and+kits+containing+said+mixtures.">Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures.</a> PubChem. , (2002).</li><li>Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+fast+and+easy+sample-to-answer+protocol+for+tuberculosis+screening+in+point-of-care+settings:+A+proof+of+concept+study.">Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study.</a> PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).</li><li>Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+improved+U.S.+food+and+drug+administration+method+for+the+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+in+produce+using+real-time+PCR.">Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR.</a> Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).</li><li>Iglesias, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+new+gelled+nested+PCR+test+for+the+diagnosis+of+imported+malaria:+comparison+with+microscopy,+rapid+diagnostic+test,+and+real-time+PCR.">Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR.</a> Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).</li><li>Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnostics+for+Chagas+disease:+up+to+date+and+novel+methodologies.">Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).</li></ol>

השנים האחרונות הדגישו את הצורך במציאת טכנולוגיות רגישות וספציפיות יותר שיסייעו באבחון מחלות טרופיות ומוזנחות. למרות חשיבותן לבקרה אפידמיולוגית, לבדיקות פרזיטולוגיות (מיקרוסקופיה אופטית) וסרולוגיות יש מגבלות, במיוחד לגבי רגישות וישימות נקודתית. טכניקות הגברה של דנ"א כגון PCR, הגברה איזות?...

מחלת צ'אגאס התגלתה בתחילת המאהה-20 באזורים הכפריים של ברזיל, שם העוני היה נפוץ 1,2. גם כיום, המחלה ממשיכה להיות קשורה לגורמים חברתיים וכלכליים של בריאות ביבשת אמריקה. מחלת צ'אגאס היא דו-פאזית, המורכבת משלב חריף וכרוני. זה נגרם על ידי זיהום על ידי טפיל Tripanosoma cruzi, להיות מועבר על ידי וקטורים חרקים, עירויי דם דרך נתיב מולד, או בליעה אוראלית של מזון מזוהם 3,4.
אבחון של מחלת Chagas יכול להיעשות באמצעות תצפית של סימפטומים קליניים (במיוחד סימן Romaña), מיקרוסקופיה כתם דם, סרולוגיה, ובדיקות מולקולריות כגון PCR בזמן אמת (qPCR) או הגברה איזותרמית 4,5,6,7,8,9. תסמינים קליניים ומיקרוסקופיה של מריחת דם משמשים במקרים חשודים של זיהומים חריפים, בעוד החיפוש אחר נוגדנים משמש ככלי סינון בחולים אסימפטומטיים. בשל רגישותו וספציפיותו, הוצע כי qPCR ישמש ככלי ניטור לחולים כרוניים, לחולים אקוטיים העוברים טיפול המודד את עומס הטפילים בדם, וכסמן פונדקאי לכישלון טיפולי 6,8,10,11,12 . למרות שהוא רגיש וספציפי יותר מהבדיקות הזמינות כיום, qPCR נמנע למעשה מלהיות מוכר ככלי אבחון באזורים מוחלשים ברחבי העולם בשל הדרישה להקפאת טמפרטורות להובלה ואחסון13,14,15.
כדי לעקוף מכשול זה, נחקרו טכניקות שימור כגון ליופיליזציה וג'ליפיקציה16,17. בעוד שליאופיליזציה מספקת שימור במשך שנים, היא דורשת ריאגנטים מיוצרים במיוחד ללא נוכחות של גליצרול, המשמש בדרך כלל לייצוב/שימור אנזימים18. אמנם הודגם כי ג'ליפיקציה מספקת שימור במשך חודשים, אך היא מאפשרת שימוש בריאגנטיםרגילים 19. תמיסת הג'ליפיקציה מורכבת מארבעה מרכיבים, שלכל אחד מהם תפקידים ספציפיים בתהליך: הסוכרים טרהלוז ומלזיטוז מגנים על הביומולקולות בתהליך הדסיקציה על ידי הפחתת מולקולות מים חופשיים בתמיסה, גליקוגן מייצר מטריצת הגנה רחבה יותר, וחומצת האמינו ליזין משמשת כמנטרלת רדיקלים חופשיים כדי לעכב את התגובות המחמצנות בין קרבוקסיל של הביומולקולה, קבוצות אמינו ופוספטים. רכיבים אלה מגדירים תערובת סול-ג'ל המונעת את אובדן המבנה השלישוני או הרבעוני במהלך תהליך הייבוש, ובכך מסייעים בשמירה על פעילות הביומולקולות עם התייבשות19. לאחר התייצבותן בתוך צינורות התגובה, ניתן לאחסן את התגובות במשך מספר חודשים בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס או מספר שבועות בטמפרטורה של 21-23 מעלות צלזיוס במקום 20 מעלות צלזיוס רגילות. גישה זו כבר שולבה בבדיקות שנועדו לסייע באבחון מחלות כגון מחלת צ'אגאס, מלריה, לישמניאזיס, שחפת וציקלוספוריזיס13,14,15,20.
העבודה הנוכחית מתארת את כל השלבים להכנת הפתרונות הנדרשים להליך הג'ליפיקציה, את המלכודות בתהליך ואת ההיבט הסופי הצפוי של qPCR ג'ל מוכן לשימוש בתוך רצועות של שמונה צינורות. ניתן להתאים את אותו פרוטוקול לצינורות בודדים או לצלחות 96 בארות. לבסוף, זיהוי הדנ"א של T. cruzi יוצג כריצת בקרה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bentonite clay bags (activated)</td>
			<td>Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain)</td>
			<td>026157/STD</td>
			<td>Not to be confused with silica gel packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td>Cat# US16445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>Cat# 365650250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melezitoze</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 63620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mastermix</td>
			<td>preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paran&#225; (IBMP, Curitiba, Brazil)</td>
			<td>Chagas NAT kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software for vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>Celsius v10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypanosoma cruzi DNA</td>
			<td>from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>VO-400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms

PCR בזמן אמת (qPCR) היא טכניקה רגישה ומדויקת להפליא המאפשרת להגביר כמויות זעירות של מטרות חומצות גרעין משלל דגימות. הוא היה בשימוש נרחב בתחומי מחקר רבים והשיג יישום תעשייתי בתחומים כגון אבחון אנושי ובחירת תכונות בגידולים של אורגניזמים מהונדסים גנטית (GMO). עם זאת, qPCR אינה טכניקה חסינת שגיאות. ערבוב כל הריאגנטים לתערובת ראשית אחת המופצת לאחר מכן על 96 בארות של צלחת qPCR רגילה עלול להוביל לטעויות מפעיל כגון ערבוב שגוי של ריאגנטים או חלוקה לא מדויקת לבארות. כאן מוצגת טכניקה הנקראת ג'ליפיקציה, לפיה רוב המים הנמצאים בתערובת האב מוחלפים על ידי ריאגנטים היוצרים תערובת סול-ג'ל כאשר הם מוגשים לוואקום. כתוצאה מכך, ריאגנטים qPCR נשמרים ביעילות במשך כמה שבועות בטמפרטורת החדר או כמה חודשים ב 2-8 oC. פרטים על הכנת כל פתרון מוצגים כאן יחד עם ההיבט הצפוי של תגובה ג'לסית שנועדה לזהות דנ"א לווייני T. cruzi (satDNA). הליך דומה יכול להיות מיושם כדי לזהות אורגניזמים אחרים. התחלת ריצת qPCR ג'ל היא פשוטה כמו הוצאת הצלחת מהמקרר, הוספת הדגימות לבארות המתאימות והתחלת הריצה, ובכך להקטין את זמן ההתקנה של תגובת צלחת מלאה לזמן שלוקח לטעון את הדגימות. בנוסף, ניתן לייצר ולשלוט בתגובות PCR ג'לריות לאיכות בקבוצות, ובכך לחסוך זמן ולהימנע מטעויות נפוצות של המפעיל תוך הפעלת תגובות PCR שגרתיות.

שלושה מהריאגנטים היוצרים את תערובת הג'ליפיקציה מתמוססים בקלות במערבולת נמרצת. עם זאת, גליקוגן דורש מערבולות זהירות כדי להבטיח שהאבקה עברה סיכה מלאה. לרוע המזל, מערבולות נמרצות מייצרות הרבה בועות, מה שמקשה על קביעת הנפח האמיתי של התמיסה (איור 1A-B). לכן, חיונ...

Watch this Scientific Journal Video about Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms at JoVE.com

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

העבודה הנוכחית מתארת את השלבים לייצור qPCR מוכן לשימוש עבור זיהוי DNA T. cruzi שניתן לטעון מראש על כלי התגובה ולאחסן במקרר במשך מספר חודשים.

qPCR מוכן לשימוש לזיהוי דנ"א מטריפנוזומה קרוזי או אורגניזמים פתוגניים אחרים

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

פרוטוקול הג'לציה מייצר תגובות qPCR מוכנות לשימוש המפחיתות את הזמן והשלבים הדרושים להתחלת ריצה. פרוטוקול זה מאפשר לייצר ולשלוט בתגובות qPCR עבור איכות וכמויות גדולות בבת אחת, ובכך להקטין את הסיכוי לטעות מפעיל במהלך חישובי מתכונים או aliquoting לתוך בארות. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל qPCR כי הוא כבר אופטימיזציה מלאה בפורמט קפוא קונבנציונאלי.הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה מכיוון ששניים משלבי בקרת האיכות העיקריים הם חזותיים. כדי להכין את תמיסת המליזיטוז, שקלו ארבעה גרם של מלזיטוז בצינור פלסטיק של 15 מיליליטר, הוסיפו שישה מיליליטרים של מים נטולי נוקלאז, ומערבבים במהירות המרבית עד שהאבקה מסיסה. הכינו את הנפח הסופי ל-10 מיליליטר עם מים נטולי נוקלאזים, ולאחר מכן תייגו ואחסנו את התמיסה בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים.כדי להכין את תמיסת הטרהלוז, שוקלים ארבעה גרם של טרהלוז בצינור פלסטיק של 15 מיליליטר, מוסיפים שישה מיליליטר של מים נטולי נוקלאז ומערבבים במהירות המרבית עד שהאבקה מסיסה. לאחר מכן להמציא את הנפח ל 10 מיליליטר עם מים ללא נוקלאז ולסנן את הפתרון דרך מסנן 0.2 מיקרון. תייג ואחסן את התמיסה בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים.כדי להכין את תמיסת הגליקוגן, שקלו שני גרם גליקוגן בצינור של 15 מיליליטר, הוסיפו שישה מיליליטרים של מים נטולי נוקלאזים, ומערבלו עד שהאבקה מתפרקת. שמור את התמיסה על שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס במשך שמונה עד 12 שעות מכיוון שסולוביזציה של גליקוגן מייצרת הרבה בועות. למחרת, הסרת התמיסה מן הדגירה, לפצות את הנפח ל 10 מיליליטר עם מים ללא נוקלאז ולאחסן את הפתרון המסומן בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס במשך עד שישה חודשים.כדי להכין את תמיסת הליזין, שקלו 7.5 מיליגרם ליזין בצינור של 15 מיליליטר, הוסיפו שישה מיליליטר מים נטולי נוקלאזים, ומערבבים עד שהאבקה מסיסה. להמציא את נפח ל 10 מיליליטר עם מים ללא נוקלאז. סנן את התמיסה דרך מסנן של 0.2 מיקרון ואחסן בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים.כדי להכין את תערובת ג'ליפיקציה, לערבב את הכמויות המתאימות של פתרונות מלאי בצינור פלסטיק 50 מיליליטר. ערבבו את הריאגנטים על ידי היפוך הצינור 10 פעמים ואחסנו את התמיסה המסומנת בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים. כדי להכין את תערובת המאסטר qPCR לג'לציה, הפשירו את הריאגנטים במיכל מקורר.לאחר מכן ערבבו נפחים מתאימים של הריאגנטים בצינור של 1.5 מיליליטר כדי להכין מספיק תערובת מאסטר לרצועת שמונה צינורות או צלחת באר 96. הבא פיפטה 18.5 מיקרוליטר של מאסטר ג'ליפיקציה לערבב על כל תגובה היטב ומניחים את הצינורות או הצלחת בתמיכת מוליך חום בתוך תנור ואקום. אם אתם משתמשים ב-96 צלחות באר, הניחו שקית חימר בנטוניט אחת בתנור על כל שתי צלחות באר 96 לספיגת מים.כאשר המחזור הושלם, בדוק את הצינורות או הצלחות לג'לציה נכונה של הריאגנטים על ידי כך שתוודא שהנפח מופחת באופן ניכר לכחמישה מיקרוליטרים והנוזלים אינם זזים בעת הקשה על הצינורות או הצלחות באצבעות. אטמו ואחסנו את הצינורות או הצלחות בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס למשך שמונה עד 12 שעות לפני השימוש. כדי להשתמש ב- qPCR הג'ל, הסר את רצועת הצינור או הצלחת מהמקרר ופתח אותה בתחנת עבודה למניפולציה לדוגמה.הוסף 15 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז וחמישה מיקרוליטרים של דגימת DNA לכל כלי תגובה. אוטמים את הצינורות או הצלחות, מפעילים את הניסוי הרצוי ומבצעים ניתוח נתונים קבוע. בפרוטוקול הנוכחי, הטמפרטורה בתוך התא נשמרת קבועה ב -30 מעלות צלזיוס, בעוד הלחץ משתנה בין 910 ל 930 מיליבר ליד ואקום.לאחר מחזור הוואקום, תערובת האב בתוך הצינור פוחתת בנפחה, הופכת לג'לציה בתחתית ואינה מתיזה על הקירות כאשר מקישים על הצינורות. אם הג'ליפיקציה אינה שלמה, הנוזל ניתז על דפנות הצינור בעת הקשה על הצינורות. זיהוי טריפנוסומה קרוזי-דנ"א באמצעות רצפי אוליגונוקלאוטידים שפורסמו מוצג כאן.זיהוי של אותה דגימה כאשר הג'ליפיקציה לא בוצעה כראוי, הביא לאובדן רגישות. השלב הקריטי ביותר הוא חישוב נפח הריאגנטים לפני ג'ליפיקציה. על המפעיל לזכור לא להוסיף מים, שכן הוא יוסר במהלך התהליך.אם עוקבים מקרוב אחר שלבי הפרוטוקול, מפעילים בעלי כישורי מעבדה וביולוגיה מולקולרית בסיסיים לא יתקשו לבצע את תהליך הג'ליפיקציה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

זיהוי של Phospholipase C פעילות Homogenate המוח של דבורת הדבש

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

בידוד F1-ATPase מ פרוטיסטים טפילי Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

הכנת כלורופלסט תאי המשנה של תודרנית לניתוח של חלבון לוקליזציה Immunoblotting או פרוטאומיקס

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

מחקר על חילוף החומרים של שישה קוטלי חרקים מערכתית החדש הוקמה התא תרבות ההשעיה נגזר תה (Camellia Sinensis L.) עלים

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

אלקטרופורזה הדנ א באמצעות Thiazole תפוז במקום אתידיום ברומיד או צבע חלופי

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

זיהוי רצף דנ א על ידי Primase DNA שימוש בתפוקה גבוהה Primase פרופיל

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

הדמיה של מולקולה בודדת של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

במבחנה בדיקת סמים נגד כל שלבי מחזור החיים של טריפנוזומה קרוזי באמצעות טפילים המבטאים β-גלקטוזידאז

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...