Name: ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms
Uploaded: 2022-01-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms at JoVE.com

लेखक वैक्यूम ओवन के साथ तकनीकी सहायता के लिए एलिन बर्दा फारियास के साथ-साथ उक्त उपकरण तक पहुंच की अनुमति देने के लिए इंस्टीट्यूटो डी बायोलोगिया मॉलिक्यूलर डो पराना (आईबीएमपी, क्यूरिटिबा, ब्राजील) के प्रशासन के प्रति आभार व्यक्त करना चाहते हैं। इस काम को आंशिक रूप से अनुदान सीएनपीक्यू 445954/2020-5 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

1. स्टॉक समाधान और गेलिफिकेशन मिश्रण की तैयारी
नोट: चार स्टॉक समाधान तैयार किए जाएंगे (400 मिलीग्राम / एमएल मेलेज़िटोज, 400 मिलीग्राम / एमएल ट्रेहलोस, 0.75 मिलीग्राम / एमएल लाइसिन, और 200 मिलीग्राम /...

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	<li>Lewinsohn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carlos+Chagas+(1879-1934):+the+discovery+of+Trypanosoma+cruzi+and+of+American+trypanosomiasis+(foot-notes+to+the+history+of+Chagas's+disease).">Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease).</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).</li><li>Bern, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+Chagas+disease+in+the+United+States:+A+systematic+review.">Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review.</a> The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).</li><li>Pereira, K. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+validation+of+quantitative+real-time+PCR+methods+for+quantification+of+trypanosoma+cruzi+DNA+in+blood+samples+from+chagas+disease+patients.">Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).</li><li>Rivero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Trypanosoma+cruzi+by+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+potential+novel+tool+for+the+detection+of+congenital+Chagas+infection.">Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).</li><li>Schijman, A. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+cruzi+loop-mediated+isothermal+amplification+(Trypanosoma+cruzi+Loopamp)+kit+for+detection+of+congenital,+acute+and+Chagas+disease+reactivation.">Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).</li><li>Duffy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+real-time+PCR+strategy+for+monitoring+bloodstream+parasitic+loads+in+chagas+disease+patients.">Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).</li><li>Melo, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+real+time+PCR+to+quantify+parasite+load+in+serum+samples+from+chronic+Chagas+disease+patients.">Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients.</a> Parasites &amp; Vectors. 8 (1), 154 (2015).</li><li>Parrado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+serial+blood+sampling+and+PCR+replicates+for+treatment+monitoring+of+patients+with+chronic+Chagas+disease.">Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).</li><li>de Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ready-to-use+duplex+qPCR+to+detect+Leishmania+infantum+DNA+in+naturally+infected+dogs.">A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs.</a> Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).</li><li>Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+concept+for+a+portable+platform+for+molecular+diagnosis+of+tropical+diseases.">Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).</li><li>Costa, A. D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready-to-use+qPCR+for+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+or+Trypanosoma+cruzi+in+food+matrices.">Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices.</a> Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-storage+of+gelified+reagents+in+a+lab-on-a-foil+system+for+rapid+nucleic+acid+analysis.">Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis.</a> Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).</li><li>Kamau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample-ready+multiplex+qPCR+assay+for+detection+of+malaria.">Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria.</a> Malaria Journal. 13, 158 (2014).</li><li>Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+further+challenges+in+lyophilization.">Recent advances and further challenges in lyophilization.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).</li><li>Rosado, P. M. F. S., L&#243;pez, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+preparing+stabilised+reaction+mixtures,+which+are+totally+or+partially+dried,+comprising+at+least+one+enzyme,+reaction+mixtures+and+kits+containing+said+mixtures.">Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures.</a> PubChem. , (2002).</li><li>Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+fast+and+easy+sample-to-answer+protocol+for+tuberculosis+screening+in+point-of-care+settings:+A+proof+of+concept+study.">Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study.</a> PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).</li><li>Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+improved+U.S.+food+and+drug+administration+method+for+the+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+in+produce+using+real-time+PCR.">Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR.</a> Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).</li><li>Iglesias, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+new+gelled+nested+PCR+test+for+the+diagnosis+of+imported+malaria:+comparison+with+microscopy,+rapid+diagnostic+test,+and+real-time+PCR.">Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR.</a> Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).</li><li>Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnostics+for+Chagas+disease:+up+to+date+and+novel+methodologies.">Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).</li></ol>

हाल के वर्षों ने उष्णकटिबंधीय और उपेक्षित रोगों के निदान में मदद करने के लिए अधिक संवेदनशील और विशिष्ट प्रौद्योगिकियों को खोजने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला है। हालांकि महामारी विज्ञान नियंत्रण के लि?...

चगास रोग की खोज 20वीं शताब्दी की शुरुआत में ब्राजील के ग्रामीण क्षेत्रों में की गई थी, जहां गरीबी व्यापक थी 1,2। आज भी, बीमारी अमेरिका में स्वास्थ्य के सामाजिक और आर्थिक निर्धारकों से जुड़ी हुई है। चगास रोग द्विध्रुवीय है, जिसमें एक तीव्र और एक पुराना चरण शामिल है। यह ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी परजीवी द्वारा संक्रमण के कारण होता है, जो कीट वैक्टर, जन्मजात मार्ग के माध्यम से रक्त आधान, यादूषित भोजन के मौखिक अंतर्ग्रहण द्वारा प्रेषित होता है।
चगास रोग का निदान नैदानिक लक्षणों (विशेष रूप से रोमाना संकेत), रक्त स्मीयर माइक्रोस्कोपी, सीरोलॉजी और आणविक परीक्षणों जैसे वास्तविक समय पीसीआर (क्यूपीसीआर) या आइसोथर्मल प्रवर्धन 4,5,6,7,8,9 के अवलोकन के माध्यम से किया जा सकता है। नैदानिक लक्षणों और रक्त स्मीयर माइक्रोस्कोपी का उपयोग तीव्र संक्रमण के संदिग्ध मामलों में किया जाता है, जबकि एंटीबॉडी की खोज का उपयोग स्पर्शोन्मुख रोगियों में स्क्रीनिंग टूल के रूप में किया जाता है। इसकी संवेदनशीलता और विशिष्टता के कारण, क्यूपीसीआर को पुराने रोगियों के लिए एक निगरानी उपकरण के रूप में उपयोग करने का सुझाव दिया गया है, रक्त में परजीवी भार को मापने वाले उपचार से गुजरने वाले तीव्र रोगियों के लिए, और चिकित्सीय विफलता के सरोगेट मार्कर के रूप में 6,8,10,11,12 . हालांकि वर्तमान में उपलब्ध परीक्षणों की तुलना में अधिक संवेदनशील और विशिष्ट, क्यूपीसीआर को परिवहन और भंडारण 13,14,15 के लिए ठंड के तापमान की आवश्यकता के कारण दुनिया भर में वंचित क्षेत्रों में नैदानिक उपकरण के रूप में जाना जाता है।
इस बाधा को दरकिनार करने के लिए, लियोफिलाइजेशन और गेलिफिकेशन जैसी संरक्षण तकनीकोंका पता लगाया गया है। जबकि लियोफिलाइजेशन वर्षों तक संरक्षण प्रदान करता है, इसके लिए ग्लिसरॉल की उपस्थिति के बिना विशेष रूप से बनाए गए अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, जिसका उपयोग आमतौर पर एंजाइम स्थिरीकरण / संरक्षणके लिए किया जाता है। जबकि गेलिफिकेशन को महीनों तक संरक्षण प्रदान करने के लिए दिखाया गया है, यह नियमित अभिकर्मकों के उपयोग की अनुमति देताहै। गेलिफिकेशन समाधान में चार घटक शामिल होते हैं, जिनमें से प्रत्येक प्रक्रिया में विशिष्ट भूमिका निभाता है: शर्करा ट्रेहलोस और मेलेज़िटोज समाधान में मुक्त पानी के अणुओं को कम करके निर्जलीकरण प्रक्रिया के दौरान बायोमोलेक्यूल्स की रक्षा करते हैं, ग्लाइकोजन एक व्यापक सुरक्षात्मक मैट्रिक्स का उत्पादन करता है, और अमीनो एसिड लाइसिन का उपयोग बायोमोलेक्यूल के कार्बोक्सिल के बीच ऑक्सीकरण प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए एक मुक्त कट्टरपंथी मेहतर के रूप में किया जाता है, अमीनो और फॉस्फेट समूह। ये घटक एक सोल-जेल मिश्रण को परिभाषित करते हैं जो निर्जलीकरण प्रक्रिया के दौरान तृतीयक या चतुर्धातुक संरचना के नुकसान को रोकता है, इस प्रकार पुनर्जलीकरण19 पर बायोमोलेक्यूल्स की गतिविधि को बनाए रखने में मदद करता है। एक बार प्रतिक्रिया ट्यूबों के अंदर स्थिर होने के बाद, प्रतिक्रियाओं को नियमित -20 डिग्री सेल्सियस के बजाय 2-8 डिग्री सेल्सियस या कुछ हफ्तों के लिए 21-23 डिग्री सेल्सियस पर कुछ महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण को पहले से ही चगास रोग, मलेरिया, लीशमैनियासिस, तपेदिक और साइक्लोस्पोरियासिस13,14,15,20 जैसी बीमारियों के निदान में मदद करने के लिए डिज़ाइन किए गए परीक्षणों में शामिल किया गया है।
वर्तमान कार्य में गेलिफिकेशन प्रक्रिया के लिए आवश्यक समाधान तैयार करने के लिए सभी चरणों, प्रक्रिया में नुकसान और आठ-ट्यूब स्ट्रिप्स के अंदर रेडी-टू-यूज़ गेलिफाइड क्यूपीसीआर के अपेक्षित अंतिम पहलू का वर्णन किया गया है। एक ही प्रोटोकॉल को एकल ट्यूबों या 96-वेल प्लेटों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। अंत में, टी क्रूज़ी डीएनए का पता लगाने को एक नियंत्रण रन के रूप में दिखाया जाएगा।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bentonite clay bags (activated)</td>
			<td>Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain)</td>
			<td>026157/STD</td>
			<td>Not to be confused with silica gel packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td>Cat# US16445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>Cat# 365650250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melezitoze</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 63620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mastermix</td>
			<td>preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paran&#225; (IBMP, Curitiba, Brazil)</td>
			<td>Chagas NAT kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software for vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>Celsius v10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypanosoma cruzi DNA</td>
			<td>from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>VO-400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms

रियल-टाइम पीसीआर (क्यूपीसीआर) एक उल्लेखनीय संवेदनशील और सटीक तकनीक है जो नमूनों की भीड़ से न्यूक्लिक एसिड लक्ष्यों की छोटी मात्रा को बढ़ाने की अनुमति देती है। यह कई अनुसंधान क्षेत्रों में बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है और आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों (जीएमओ) फसलों की फसलों में मानव निदान और विशेषता चयन जैसे क्षेत्रों में औद्योगिक अनुप्रयोग प्राप्त किया है। हालांकि, QPCR एक त्रुटि-प्रूफ तकनीक नहीं है। सभी अभिकर्मकों को एक ही मास्टर मिश्रण में मिलाने से बाद में एक नियमित क्यूपीसीआर प्लेट के 96 कुओं पर वितरित किया जाता है, जिससे ऑपरेटर की गलतियां हो सकती हैं जैसे कि अभिकर्मकों का गलत मिश्रण या कुओं में गलत वितरण। यहां, गेलिफिकेशन नामक एक तकनीक प्रस्तुत की जाती है, जिससे मास्टर मिश्रण में मौजूद अधिकांश पानी को अभिकर्मकों द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है जो वैक्यूम में प्रस्तुत होने पर सोल-जेल मिश्रण बनाते हैं। नतीजतन, क्यूपीसीआर अभिकर्मकों को कमरे के तापमान पर कुछ हफ्तों या 2-8 डिग्री सेल्सियसपर कुछ महीनों के लिए प्रभावी रूप से संरक्षित किया जाता है। प्रत्येक समाधान तैयार करने का विवरण टी क्रूज़ी उपग्रह डीएनए (एसएटीडीएनए) का पता लगाने के लिए डिज़ाइन की गई जेलिफाइड प्रतिक्रिया के अपेक्षित पहलू के साथ यहां दिखाया गया है। अन्य जीवों का पता लगाने के लिए एक समान प्रक्रिया लागू की जा सकती है। एक गेलिफाइड क्यूपीसीआर रन शुरू करना उतना ही सरल है जितना कि रेफ्रिजरेटर से प्लेट को हटाना, नमूनों को अपने संबंधित कुओं में जोड़ना, और रन शुरू करना, इस प्रकार नमूने लोड करने में लगने वाले समय तक पूर्ण-प्लेट प्रतिक्रिया के सेटअप समय को कम करना। इसके अतिरिक्त, गेलिफाइड पीसीआर प्रतिक्रियाओं को बैचों में गुणवत्ता के लिए उत्पादित और नियंत्रित किया जा सकता है, समय की बचत होती है और नियमित पीसीआर प्रतिक्रियाओं को चलाते समय सामान्य ऑपरेटर गलतियों से बचा जा सकता है।

गेलिफिकेशन मिश्रण बनाने वाले अभिकर्मकों में से तीन जोरदार भंवर पर आसानी से घुलनशील हो जाते हैं। हालांकि, ग्लाइकोजन को यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानीपूर्वक भंवर की आवश्यकता होती है कि पाउडर पूरी तर?...

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Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

वर्तमान कार्य टी क्रूज़ी डीएनए का पता लगाने के लिए रेडी-टू-यूज़ क्यूपीसीआर के उत्पादन के चरणों का वर्णन करता है जिसे प्रतिक्रिया पोत पर प्री-लोड किया जा सकता है और कई महीनों तक रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत किया जा सकता है।

ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी या अन्य रोगजनक जीवों से डीएनए का पता लगाने के लिए क्यूपीसीआर का उपयोग करने के लिए तैयार

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

गेलिफिकेशन प्रोटोकॉल क्यूपीसीआर प्रतिक्रियाओं का उपयोग करने के लिए तैयार उत्पादन करता है जो रन शुरू करने के लिए आवश्यक समय और चरणों को कम करता है। यह प्रोटोकॉल क्यूपीसीआर प्रतिक्रियाओं को एक बार में गुणवत्ता और बड़ी मात्रा के लिए उत्पादित और नियंत्रित करने की अनुमति देता है, जिससे नुस्खा गणना के दौरान ऑपरेटर त्रुटि की संभावना कम हो जाती है या कुओं में एलिकोटिंग होती है। इस विधि को किसी भी QPCR पर लागू किया जा सकता है जो पहले से ही पारंपरिक जमे हुए प्रारूप में पूरी तरह से अनुकूलित है।इस विधि का दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है क्योंकि दो मुख्य गुणवत्ता नियंत्रण चरण दृश्य हैं। मेलेज़िटोज समाधान तैयार करने के लिए, 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में चार ग्राम मेलेज़िटोज का वजन करें, छह मिलीलीटर न्यूक्लियस मुक्त पानी जोड़ें, और पाउडर के घुलनशील होने तक अधिकतम गति से भंवर जोड़ें। न्यूक्लियस मुक्त पानी के साथ अंतिम मात्रा को 10 मिलीलीटर तक बनाएं, फिर घोल को छह महीने तक दो से आठ डिग्री सेल्सियस पर लेबल और स्टोर करें।ट्रेहलोस समाधान तैयार करने के लिए, 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में चार ग्राम ट्रेहलोस का वजन करें, छह मिलीलीटर न्यूक्लियस मुक्त पानी और भंवर को अधिकतम गति से जोड़ें जब तक कि पाउडर घुलनशील न हो जाए। फिर न्यूक्लियस मुक्त पानी के साथ मात्रा को 10 मिलीलीटर तक बनाएं और 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें। घोल को दो से आठ डिग्री सेल्सियस पर छह महीने तक लेबल और स्टोर करें।ग्लाइकोजन समाधान तैयार करने के लिए, 15 मिलीलीटर ट्यूब में दो ग्राम ग्लाइकोजन का वजन करें, छह मिलीलीटर न्यूक्लियस मुक्त पानी जोड़ें, और भंवर तब तक जब तक पाउडर घुलनशील न हो जाए। घोल को आठ से 12 घंटे के लिए दो से आठ डिग्री सेल्सियस पर रखें क्योंकि ग्लाइकोजन का घुलनशीलीकरण बहुत सारे बुलबुले पैदा करता है। अगले दिन, इनक्यूबेशन से समाधान को हटाते हुए, न्यूक्लियस मुक्त पानी के साथ मात्रा को 10 मिलीलीटर तक बनाएं और लेबल किए गए घोल को छह महीने तक दो से आठ डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।लाइसिन समाधान तैयार करने के लिए, 15 मिलीलीटर ट्यूब में लाइसिन के 7.5 मिलीग्राम वजन करें, छह मिलीलीटर न्यूक्लियस मुक्त पानी जोड़ें, और भंवर तब तक जब तक पाउडर घुलनशील न हो जाए। न्यूक्लियस मुक्त पानी के साथ मात्रा को 10 मिलीलीटर तक बनाएं। 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें और छह महीने तक दो से आठ डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।गेलिफिकेशन मिश्रण तैयार करने के लिए, 50 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में स्टॉक समाधान की उचित मात्रा मिलाएं। ट्यूब को 10 बार उल्टा करके अभिकर्मकों को मिलाएं और लेबल किए गए घोल को तीन महीने तक दो से आठ डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। गेलिफिकेशन के लिए क्यूपीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए, अभिकर्मकों को एक प्रशीतित कंटेनर में पिघलाएं।फिर आठ ट्यूब स्ट्रिप या 96 वेल प्लेट के लिए पर्याप्त मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में अभिकर्मकों की उचित मात्रा मिलाएं। अगले पिपेट 18.5 माइक्रोलीटर जेलिफिकेशन मास्टर प्रत्येक प्रतिक्रिया पर अच्छी तरह से मिश्रण करते हैं और वैक्यूम ओवन के अंदर गर्मी प्रवाहकीय समर्थन में ट्यूब या प्लेट रखते हैं। यदि 96 अच्छी प्लेटों का उपयोग कर रहे हैं, तो पानी के अवशोषण के लिए प्रत्येक दो 96 अच्छी प्लेटों के लिए ओवन में एक बेंटोनाइट मिट्टी की थैली रखें।जब चक्र पूरा हो जाता है, तो अभिकर्मकों के उचित गेलिफिकेशन के लिए ट्यूबों या प्लेटों की जांच करें, यह सुनिश्चित करके कि मात्रा स्पष्ट रूप से लगभग पांच माइक्रोलीटर तक कम हो गई है और तरल पदार्थ उंगलियों से ट्यूब या प्लेटों को टैप करने पर आगे नहीं बढ़ते हैं। उपयोग से पहले ट्यूबों या प्लेटों को दो से आठ डिग्री सेल्सियस पर आठ से 12 घंटे तक सील और स्टोर करें। जेलिफाइड क्यूपीसीआर का उपयोग करने के लिए, रेफ्रिजरेटर से ट्यूब स्ट्रिप या प्लेट को हटा दें और नमूना हेरफेर के लिए इसे वर्कस्टेशन में खोलें।प्रत्येक प्रतिक्रिया पोत में न्यूक्लियस मुक्त पानी के 15 माइक्रोलीटर और डीएनए नमूने के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें। ट्यूबों या प्लेटों को सील करें, वांछित प्रयोग चलाएं, और नियमित डेटा विश्लेषण करें। वर्तमान प्रोटोकॉल में, कक्ष के अंदर का तापमान 30 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रखा जाता है, जबकि दबाव 910 से 930 मिलीबार और वैक्यूम के पास भिन्न होता है।वैक्यूम चक्र के बाद, ट्यूब के अंदर मास्टर मिश्रण मात्रा में कम हो जाता है, नीचे की ओर जेलीकृत हो जाता है और ट्यूबों को टैप करने पर दीवारों पर छींटे नहीं पड़ता है। यदि जेलिफिकेशन अधूरा है, तो ट्यूबों को टैप करने पर तरल ट्यूब की दीवारों पर बिखर जाता है। प्रकाशित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों का उपयोग करके ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी-डीएनए का पता लगाना यहां दिखाया गया है।एक ही नमूने का पता लगाना जब गेलिफिकेशन सही ढंग से निष्पादित नहीं किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप संवेदनशीलता का नुकसान हुआ। सबसे महत्वपूर्ण कदम गेलिफिकेशन से पहले अभिकर्मकों की मात्रा की गणना है। ऑपरेटर को पानी नहीं जोड़ना याद रखना चाहिए, क्योंकि इसे प्रक्रिया के दौरान हटा दिया जाएगा।यदि प्रोटोकॉल चरणों का बारीकी से पालन किया जाता है, तो बुनियादी प्रयोगशाला और आणविक जीव विज्ञान कौशल वाले ऑपरेटरों को गेलिफिकेशन प्रक्रिया करने में कोई कठिनाई नहीं होगी।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

निलंबन सेल संस्कृतियों में डीएनए नुकसान-प्रेरित प्रोटीन परिसरों का पता लगाने और विज़ुअलाइज़ेशन निकटता के बंधन परख का उपयोग करना

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

से मस्तिष्क Homogenate में Phospholipase सी गतिविधि का पता लगाने से मधुप

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

च1का अलगाव-परजीवी Protist Trypanosoma brucei से ATPase

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Immunoblotting या प्रोटियोमिक् द्वारा प्रोटीन स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए Arabidopsis से Chloroplast उप-डिब्बों की तैयारी

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

चाय से व्युत्पन्न एक नव स्थापित सेल निलंबन संस्कृति में छह प्रणालीगत कीटनाशक के चयापचय पर अध्ययन(कैमेलिया Sinensis एल.) पत्ते

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

डीएनए वैद्युतिडियम या वैकल्पिक रंजक के बजाय Thiazole ऑरेंज का उपयोग कर Electrophoresis

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

डीएनए द्वारा डीएनए अनुक्रम मान्यता उच्च-Throughput प्राइमाज़ प्रोफ़ेशनल का उपयोग कर

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ इनहिबिटर के लिए स्क्रीन करने के लिए निरंतर फ्लोरेसेंस-आधारित एंडोन्यूक्लिज़-युग्मित डीएनए मिथाइलेशन परख

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

डीएनए पर एकत्र होने वाले ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 कंडेनसेट की एकल-अणु इमेजिंग

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

इन विट्रो में ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी के सभी जीवन चक्र चरणों के खिलाफ ड्रग स्क्रीनिंग β-गैलेक्टोसिडेस व्यक्त करने वाले परजीवी का उपयोग करके

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...