Name: ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms
Uploaded: 2022-01-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms at JoVE.com

Gli autori desiderano esprimere la loro gratitudine ad Aline Burda Farias per l'assistenza tecnica con il forno a vuoto, nonché all'amministrazione dell'Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brasile) per aver permesso l'accesso a tali apparecchiature. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dalla sovvenzione CNPq 445954/2020-5.

1. Preparazione di soluzioni madre e miscela di gelificazione
NOTA: Saranno preparate quattro soluzioni madre (400 mg/ml di melezitosio, 400 mg/ml di trealosio, 0,75 mg/ml di lisina e 200 mg/ml di glicogeno) e miscelate secondo la proporzione indicata nella tabella 1 per ottenere la miscela di gelificazione. Sebbene il protocollo descriva 10 ml di produzione di soluzioni stock, può essere adattato per volumi inferiori o superiori.
<ol><li>Soluzione di melez...

<ol>
	<li>Lewinsohn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carlos+Chagas+(1879-1934):+the+discovery+of+Trypanosoma+cruzi+and+of+American+trypanosomiasis+(foot-notes+to+the+history+of+Chagas's+disease).">Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease).</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).</li><li>Bern, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+Chagas+disease+in+the+United+States:+A+systematic+review.">Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review.</a> The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).</li><li>Pereira, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease+as+a+foodborne+illness.">Chagas' disease as a foodborne illness.</a> Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).</li><li>Tanowitz, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease.">Chagas' disease.</a> Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).</li><li>Rassi, A., Marin-Neto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+validation+of+quantitative+real-time+PCR+methods+for+quantification+of+trypanosoma+cruzi+DNA+in+blood+samples+from+chagas+disease+patients.">Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).</li><li>Rivero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Trypanosoma+cruzi+by+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+potential+novel+tool+for+the+detection+of+congenital+Chagas+infection.">Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).</li><li>Schijman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnosis+of+Trypanosoma+cruzi.">Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi.</a> Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).</li><li>Besuschio, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+cruzi+loop-mediated+isothermal+amplification+(Trypanosoma+cruzi+Loopamp)+kit+for+detection+of+congenital,+acute+and+Chagas+disease+reactivation.">Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).</li><li>Duffy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+real-time+PCR+strategy+for+monitoring+bloodstream+parasitic+loads+in+chagas+disease+patients.">Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).</li><li>Melo, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+real+time+PCR+to+quantify+parasite+load+in+serum+samples+from+chronic+Chagas+disease+patients.">Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients.</a> Parasites &amp; Vectors. 8 (1), 154 (2015).</li><li>Parrado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+serial+blood+sampling+and+PCR+replicates+for+treatment+monitoring+of+patients+with+chronic+Chagas+disease.">Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).</li><li>de Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ready-to-use+duplex+qPCR+to+detect+Leishmania+infantum+DNA+in+naturally+infected+dogs.">A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs.</a> Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).</li><li>Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+concept+for+a+portable+platform+for+molecular+diagnosis+of+tropical+diseases.">Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).</li><li>Costa, A. D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready-to-use+qPCR+for+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+or+Trypanosoma+cruzi+in+food+matrices.">Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices.</a> Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-storage+of+gelified+reagents+in+a+lab-on-a-foil+system+for+rapid+nucleic+acid+analysis.">Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis.</a> Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).</li><li>Kamau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample-ready+multiplex+qPCR+assay+for+detection+of+malaria.">Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria.</a> Malaria Journal. 13, 158 (2014).</li><li>Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+further+challenges+in+lyophilization.">Recent advances and further challenges in lyophilization.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).</li><li>Rosado, P. M. F. S., L&#243;pez, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+preparing+stabilised+reaction+mixtures,+which+are+totally+or+partially+dried,+comprising+at+least+one+enzyme,+reaction+mixtures+and+kits+containing+said+mixtures.">Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures.</a> PubChem. , (2002).</li><li>Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+fast+and+easy+sample-to-answer+protocol+for+tuberculosis+screening+in+point-of-care+settings:+A+proof+of+concept+study.">Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study.</a> PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).</li><li>Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+improved+U.S.+food+and+drug+administration+method+for+the+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+in+produce+using+real-time+PCR.">Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR.</a> Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).</li><li>Iglesias, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+new+gelled+nested+PCR+test+for+the+diagnosis+of+imported+malaria:+comparison+with+microscopy,+rapid+diagnostic+test,+and+real-time+PCR.">Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR.</a> Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).</li><li>Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnostics+for+Chagas+disease:+up+to+date+and+novel+methodologies.">Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).</li></ol>

Gli ultimi anni hanno evidenziato la necessità di trovare tecnologie più sensibili e specifiche per aiutare a diagnosticare le malattie tropicali e trascurate. Sebbene importanti per il controllo epidemiologico, i test parassitologici (microscopia ottica) e sierologici hanno dei limiti, soprattutto per quanto riguarda la sensibilità e l'applicabilità al punto di cura. Le tecniche di amplificazione del DNA come la PCR, l'amplificazione isotermica e le rispettive variazioni sono state a lungo utilizzate in ambienti di ...

La malattia di Chagas è stata scoperta all'inizio del 20° secolo nelle regioni rurali del Brasile, dove la povertà era diffusa 1,2. Ancora oggi, la malattia continua ad essere collegata ai determinanti sociali ed economici della salute nelle Americhe. La malattia di Chagas è bifasica, comprendente una fase acuta e una cronica. È causata dall'infezione da parte del parassita Trypanosoma cruzi, trasmessa da insetti vettori, trasfusioni di sangue per via congenita o ingestione orale di alimenti contaminati 3,4.
La diagnosi della malattia di Chagas può essere effettuata attraverso l'osservazione dei sintomi clinici (in particolare il segno di Romaña), la microscopia dello striscio di sangue, la sierologia e i test molecolari come la PCR in tempo reale (qPCR) o l'amplificazione isotermica 4,5,6,7,8,9. I sintomi clinici e la microscopia a striscio di sangue sono utilizzati nei casi sospetti di infezioni acute, mentre la ricerca di anticorpi viene utilizzata come strumento di screening nei pazienti asintomatici. A causa della sua sensibilità e specificità, la qPCR è stata suggerita per essere utilizzata come strumento di monitoraggio per i pazienti cronici, per i pazienti acuti sottoposti a trattamento che misura il carico parassitario nel sangue e come marker surrogato di fallimento terapeutico 6,8,10,11,12 . Sebbene più sensibile e specifico dei test attualmente disponibili, la qPCR è effettivamente impedita di essere conosciuta come strumento diagnostico nelle regioni svantaggiate di tutto il mondo a causa della necessità di temperature di congelamento per il trasporto e lo stoccaggio13,14,15.
Per aggirare questo ostacolo, sono state esplorate tecniche di conservazione come la liofilizzazione e la gelificazione16,17. Mentre la liofilizzazione fornisce la conservazione per anni, richiede reagenti appositamente realizzati senza la presenza di glicerolo, che è comunemente usato per la stabilizzazione / conservazione degli enzimi18. Mentre la gelificazione ha dimostrato di fornire conservazione per mesi, consente l'uso di reagenti regolari19. La soluzione di gelificazione comprende quattro componenti, ciascuno con ruoli specifici nel processo: gli zuccheri trealosio e melezitosio proteggono le biomolecole durante il processo di essiccazione riducendo le molecole di acqua libera nella soluzione, il glicogeno produce una matrice protettiva più ampia e l'amminoacido lisina viene utilizzato come scavenger dei radicali liberi per inibire le reazioni ossidanti tra il carbossile della biomolecola, gruppi amminico e fosfato. Questi componenti definiscono una miscela sol-gel che impedisce la perdita della struttura terziaria o quaternaria durante il processo di essiccazione, contribuendo così a mantenere l'attività delle biomolecole dopo la reidratazione19. Una volta stabilizzate all'interno delle provette di reazione, le reazioni possono essere conservate per alcuni mesi a 2-8 °C o alcune settimane a 21-23 °C invece dei normali -20 °C. Questo approccio è già stato incorporato in test progettati per aiutare a diagnosticare malattie come la malattia di Chagas, la malaria, la leishmaniosi, la tubercolosi e la ciclosporiasi13,14,15,20.
Il presente lavoro descrive tutte le fasi per preparare le soluzioni richieste per la procedura di gelificazione, le insidie del processo e l'aspetto finale previsto di una qPCR gelificata pronta all'uso all'interno di strisce a otto tubi. Lo stesso protocollo può essere adattato per tubi singoli o piastre a 96 pozzetti. Infine, la rilevazione del DNA di T. cruzi sarà mostrata come una corsa di controllo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bentonite clay bags (activated)</td>
			<td>Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain)</td>
			<td>026157/STD</td>
			<td>Not to be confused with silica gel packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td>Cat# US16445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>Cat# 365650250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melezitoze</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 63620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mastermix</td>
			<td>preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paran&#225; (IBMP, Curitiba, Brazil)</td>
			<td>Chagas NAT kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software for vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>Celsius v10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypanosoma cruzi DNA</td>
			<td>from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>VO-400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms

La PCR in tempo reale (qPCR) è una tecnica straordinariamente sensibile e precisa che consente di amplificare piccole quantità di bersagli di acidi nucleici da una moltitudine di campioni. È stato ampiamente utilizzato in molte aree di ricerca e ha raggiunto l'applicazione industriale in campi come la diagnostica umana e la selezione dei tratti nelle colture di colture di organismi geneticamente modificati (OGM). Tuttavia, la qPCR non è una tecnica a prova di errore. La miscelazione di tutti i reagenti in un'unica miscela master successivamente distribuita su 96 pozzetti di una normale piastra qPCR potrebbe portare a errori dell'operatore come una miscelazione errata dei reagenti o un'erogazione imprecisa nei pozzetti. Qui viene presentata una tecnica chiamata gelificazione, in base alla quale la maggior parte dell'acqua presente nella miscela master viene sostituita da reagenti che formano una miscela sol-gel quando viene sottoposta al vuoto. Di conseguenza, i reagenti qPCR vengono efficacemente conservati per alcune settimane a temperatura ambiente o alcuni mesi a 2-8 °C. I dettagli della preparazione di ciascuna soluzione sono mostrati qui insieme all'aspetto atteso di una reazione gelificata progettata per rilevare il DNA satellite di T. cruzi (satDNA). Una procedura simile può essere applicata per rilevare altri organismi. Avviare una qPCR gelificata è semplice come rimuovere la piastra dal frigorifero, aggiungere i campioni ai rispettivi pozzetti e iniziare la corsa, riducendo così il tempo di configurazione di una reazione a piastra intera al tempo necessario per caricare i campioni. Inoltre, le reazioni PCR gelificate possono essere prodotte e controllate per la qualità in lotti, risparmiando tempo ed evitando errori comuni dell'operatore durante l'esecuzione di reazioni PCR di routine.

Tre dei reagenti che formano la miscela di gelificazione sono facilmente solubilizzati dopo un vigoroso vortice. Tuttavia, il glicogeno richiede un attento vortice per garantire che la polvere sia stata completamente solubilizzata. Sfortunatamente, il vortice vigoroso produce molte bolle, il che rende difficile determinare il volume effettivo della soluzione (Figura 1A-B). Pertanto, è essenziale lasciare riposare la soluzione di glicogeno nel frigorifero fi...

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Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Il presente lavoro descrive le fasi per la produzione di qPCR pronta all'uso per il rilevamento del DNA di T. cruzi che può essere precaricata sul recipiente di reazione e conservata in frigorifero per diversi mesi.

qPCR pronta all'uso per la rilevazione del DNA da Trypanosoma cruzi o altri organismi patogeni

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

Il protocollo di gelificazione produce reazioni qPCR pronte all'uso che riducono il tempo e i passaggi necessari per avviare una corsa. Questo protocollo consente di produrre e controllare contemporaneamente reazioni qPCR per qualità e grandi quantità, riducendo le possibilità di errore dell'operatore durante i calcoli delle ricette o l'aliquotazione nei pozzi. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi qPCR che è già completamente ottimizzato nel formato congelato convenzionale.La dimostrazione visiva di questo metodo è importante perché due delle principali fasi di controllo della qualità sono visive. Per preparare la soluzione di melezitosio, pesare quattro grammi di melezitosio in un tubo di plastica da 15 millilitri, aggiungere sei millilitri di acqua priva di nucleasi e vortice alla massima velocità fino a quando la polvere non viene solubilizzata. Portare il volume finale a 10 millilitri con acqua priva di nucleasi, quindi etichettare e conservare la soluzione da due a otto gradi Celsius per un massimo di sei mesi.Per preparare la soluzione di trealosio, pesare quattro grammi di trealosio in un tubo di plastica da 15 millilitri, aggiungere sei millilitri di acqua priva di nucleasi e vortice alla massima velocità fino a quando la polvere non è solubilizzata. Quindi portare il volume a 10 millilitri con acqua priva di nucleasi e filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 micron. Etichettare e conservare la soluzione da due a otto gradi Celsius per un massimo di sei mesi.Per preparare la soluzione di glicogeno, pesare due grammi di glicogeno in un tubo da 15 millilitri, aggiungere sei millilitri di acqua priva di nucleasi e vortice fino a quando la polvere non viene solubilizzata. Mantenere la soluzione da due a otto gradi Celsius per otto-12 ore perché la solubilizzazione del glicogeno produce molte bolle. Il giorno seguente, rimuovendo la soluzione dall'incubazione, portare il volume a 10 millilitri con acqua priva di nucleasi e conservare la soluzione etichettata da due a otto gradi Celsius per un massimo di sei mesi.Per preparare la soluzione di lisina, pesare 7,5 milligrammi di lisina in un tubo da 15 millilitri, aggiungere sei millilitri di acqua priva di nucleasi e vortice fino a quando la polvere è solubilizzata. Portare il volume a 10 millilitri con acqua priva di nucleasi. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 micron e conservare a due a otto gradi Celsius per un massimo di sei mesi.Per preparare la miscela di gelificazione, mescolare i volumi appropriati di soluzioni stock in un tubo di plastica da 50 millilitri. Mescolare i reagenti invertendo il tubo 10 volte e conservare la soluzione marcata da due a otto gradi Celsius per un massimo di tre mesi. Per preparare la miscela master qPCR per la gelificazione, scongelare i reagenti in un contenitore refrigerato.Quindi mescolare i volumi appropriati dei reagenti in un tubo da 1,5 millilitri per preparare abbastanza master mix per una striscia di otto tubi o una piastra da 96 pozzetti. Successivamente pipettare 18,5 microlitri del master di gelificazione mescolare su ciascun pozzetto di reazione e posizionare i tubi o la piastra nel supporto termoconduttivo all'interno del forno sottovuoto. Se si utilizzano 96 piastre di pozzetto, posizionare un sacchetto di argilla bentonitica nel forno per ogni due piastre da 96 pozzetti per l'assorbimento d'acqua.Quando il ciclo è completato, controllare i tubi o le piastre per una corretta gelificazione dei reagenti assicurandosi che il volume sia visibilmente ridotto a circa cinque microlitri e che i liquidi non si muovano picchiettando i tubi o le piastre con le dita. Sigillare e conservare i tubi o le piastre da due a otto gradi Celsius da otto a 12 ore prima dell'uso. Per utilizzare la qPCR gelificata, rimuovere la striscia tubiera o la piastra dal frigorifero e aprirla in una workstation per la manipolazione del campione.Aggiungere 15 microlitri di acqua priva di nucleasi e cinque microlitri di campione di DNA a ciascun recipiente di reazione. Sigillare i tubi o le piastre, eseguire l'esperimento desiderato ed eseguire analisi regolari dei dati. Nel presente protocollo, la temperatura all'interno della camera è mantenuta costante a 30 gradi Celsius, mentre la pressione varia tra 910 e 930 millibar e vicino al vuoto.Dopo il ciclo di vuoto, la miscela master all'interno del tubo diminuisce di volume, diventa gelificata sul fondo e non schizza sulle pareti quando i tubi vengono picchiettati. Se la gelificazione è incompleta, il liquido schizza sulle pareti del tubo quando i tubi vengono toccati. Il rilevamento del Trypanosoma cruzi-DNA utilizzando sequenze oligonucleotidiche pubblicate è mostrato qui.Il rilevamento dello stesso campione quando la gelificazione non è stata eseguita correttamente, ha comportato una perdita di sensibilità. Il passaggio più critico è il calcolo del volume dei reagenti prima della gelificazione. L'operatore deve ricordarsi di non aggiungere acqua, poiché verrà rimossa durante il processo.Se le fasi del protocollo vengono seguite attentamente, gli operatori con competenze di laboratorio e di biologia molecolare di base non avranno difficoltà a eseguire il processo di gelificazione.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Ricerca

Biochimica

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Rilevamento di attività della fosfolipasi C in omogeneato del cervello dall'ape

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolamento di F1-ATPasi dal Protista parassita Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Preparazione del cloroplasto Sub-compartimenti da Arabidopsis per l'analisi di localizzazione della proteina di Immunoblotting o proteomica

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studio sul metabolismo di sei insetticidi sistemici in una nuova coltura di sospensione cellulare derivata dal tè (Camellia Sinensis L.) plurale di "leaf"

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

Elettroforesi di DNA usando Thiazole Orange invece di bromuro di etidio o coloranti alternativi

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Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi a fluorescenza continua per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Imaging a singola molecola dell'assemblaggio di condensati EWS-FLI1 sul DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

In vitro Screening farmacologico contro tutte le fasi del ciclo di vita di Trypanosoma cruzi utilizzando parassiti che esprimono β-galattosidasi

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...