Name: ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms
Uploaded: 2022-01-20T12:30:00
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著者らは、真空オーブンの技術支援を提供してくれたAline Burda Farias氏と、同機器へのアクセスを許可してくれたパラナ分子生物学研究所(IBMP、クリチバ、ブラジル)の管理に感謝の意を表したいと思います。この作業は、助成金CNPq 445954 / 2020-5によって部分的に資金提供されました。

1.原液およびゲル化混合物の調製
注:4つのストック溶液(400 mg / mLのメレジトース、400 mg / mLのトレハロース、0.75 mg / mLのリジン、および200 mg / mLのグリコーゲン)を調製し、 表1 に示す割合に従って混合してゲル化混合物を生成します。プロトコルには10 mLのストック溶液の生産が記載されていますが、少量または多量に適合させることができます。<...

<ol>
	<li>Lewinsohn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carlos+Chagas+(1879-1934):+the+discovery+of+Trypanosoma+cruzi+and+of+American+trypanosomiasis+(foot-notes+to+the+history+of+Chagas's+disease).">Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease).</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).</li><li>Bern, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+Chagas+disease+in+the+United+States:+A+systematic+review.">Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review.</a> The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).</li><li>Pereira, K. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+real+time+PCR+to+quantify+parasite+load+in+serum+samples+from+chronic+Chagas+disease+patients.">Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients.</a> Parasites &amp; Vectors. 8 (1), 154 (2015).</li><li>Parrado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+serial+blood+sampling+and+PCR+replicates+for+treatment+monitoring+of+patients+with+chronic+Chagas+disease.">Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).</li><li>de Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ready-to-use+duplex+qPCR+to+detect+Leishmania+infantum+DNA+in+naturally+infected+dogs.">A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs.</a> Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).</li><li>Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+concept+for+a+portable+platform+for+molecular+diagnosis+of+tropical+diseases.">Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).</li><li>Costa, A. D. 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C., Winter, G., Friess, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+further+challenges+in+lyophilization.">Recent advances and further challenges in lyophilization.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).</li><li>Rosado, P. M. F. S., L&#243;pez, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+preparing+stabilised+reaction+mixtures,+which+are+totally+or+partially+dried,+comprising+at+least+one+enzyme,+reaction+mixtures+and+kits+containing+said+mixtures.">Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures.</a> PubChem. , (2002).</li><li>Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+fast+and+easy+sample-to-answer+protocol+for+tuberculosis+screening+in+point-of-care+settings:+A+proof+of+concept+study.">Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study.</a> PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).</li><li>Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+improved+U.S.+food+and+drug+administration+method+for+the+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+in+produce+using+real-time+PCR.">Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR.</a> Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).</li><li>Iglesias, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+new+gelled+nested+PCR+test+for+the+diagnosis+of+imported+malaria:+comparison+with+microscopy,+rapid+diagnostic+test,+and+real-time+PCR.">Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR.</a> Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).</li><li>Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnostics+for+Chagas+disease:+up+to+date+and+novel+methodologies.">Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).</li></ol>

近年、熱帯病や顧みられない病気の診断に役立つ、より感度が高く具体的な技術を見つける必要性が浮き彫りになっています。疫学的管理には重要ですが、寄生虫学的(光学顕微鏡検査)および血清学的検査には、特に感度とポイントオブケアの適用性に関して制限があります。PCR、等温増幅、およびそれぞれのバリエーションなどのDNA増幅技術は、実験室の設定で長い間使用されてきました?...

シャーガス病は、貧困が蔓延していたブラジルの農村地域で20世紀初頭に発見されました1,2。今日でも、この病気は南北アメリカの健康の社会的および経済的決定要因に関連し続けています。シャーガス病は二相性で、急性期と慢性期で構成されています。これは、トリパノソーマクルジ寄生虫による感染、昆虫ベクターによる感染、先天性経路を介した輸血、または汚染された食品の経口摂取によって引き起こされます3,4。
シャーガス病の診断は、臨床症状(特にロマーニャ徴候)の観察、血液塗抹顕微鏡検査、血清学、およびリアルタイムPCR(qPCR)または等温増幅4,5,6,7,8,9などの分子検査によって行うことができます。臨床症状と血液塗抹顕微鏡検査は急性感染症の疑いのある症例に使用されますが、抗体の検索は無症候性患者のスクリーニングツールとして使用されます。qPCRは、その感度と特異性から、慢性患者のモニタリングツール、血液中の寄生虫負荷を測定する治療を受けている急性患者、および治療失敗の代理マーカーとして使用することが示唆されています6,8,10,11,12 .qPCRは、現在利用可能な検査よりも感度が高く特異的ですが、輸送および保管のための凍結温度の要件により、世界中の恵まれない地域では診断ツールとして知られることを効果的に妨げられています13,14,15。
この障害を回避するために、凍結乾燥やゲル化などの保存技術が検討されている16,17。凍結乾燥は何年にもわたって保存を提供しますが、酵素の安定化/保存に一般的に使用されるグリセロールの存在なしに特別に作られた試薬を必要とします18。ゲル化は数ヶ月間の保存を提供することが示されているが、それは通常の試薬の使用を可能にする19。ゲル化溶液は4つの成分を含み、それぞれがプロセスにおいて特定の役割を有する:糖トレハロースおよびメレジトースは、溶液中の遊離水分子を減少させることによって乾燥プロセス中に生体分子を保護し、グリコーゲンはより広い保護マトリックスを生成し、アミノ酸リジンは、生体分子のカルボキシル間の酸化反応を阻害するフリーラジカルスカベンジャーとして使用される。 アミノ基およびリン酸基。これらの成分は、乾燥プロセス中の三次または四次構造の喪失を防ぐゾル-ゲル混合物を定義し、したがって、再水和時に生体分子の活性を維持するのに役立ちます19。反応管内で安定化したら、反応物を通常の-20°Cではなく21-23°Cで2-8°Cで数ヶ月間、または数週間保存することができます。 このアプローチは、シャーガス病、マラリア、リーシュマニア症、結核、シクロスポリア症などの疾患の診断に役立つように設計されたテストにすでに組み込まれています13、14、15、20。
本研究では、ゲル化手順に必要な溶液を調製するためのすべてのステップ、プロセスの落とし穴、および8チューブストリップ内のすぐに使用できるゲル化qPCRの予想される最終側面について説明します。同じプロトコルをシングルチューブまたは96ウェルプレートに適合させることができます。最後に、 T. cruzi DNAの検出がコントロールランとして示されます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bentonite clay bags (activated)</td>
			<td>Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain)</td>
			<td>026157/STD</td>
			<td>Not to be confused with silica gel packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td>Cat# US16445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>Cat# 365650250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melezitoze</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 63620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mastermix</td>
			<td>preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paran&#225; (IBMP, Curitiba, Brazil)</td>
			<td>Chagas NAT kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software for vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>Celsius v10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypanosoma cruzi DNA</td>
			<td>from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>VO-400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms

リアルタイムPCR(qPCR)は、多数のサンプルから微量の核酸ターゲットを増幅できる、非常に高感度で正確な技術です。多くの研究分野で広く使用されており、遺伝子組み換え生物(GMO)作物の作物におけるヒト診断や形質選択などの分野での産業応用を達成しています。ただし、qPCRはエラー防止技術ではありません。すべての試薬を1つのマスターミックスに混合し、その後通常のqPCRプレートの96ウェルに分配すると、試薬の誤った混合やウェルへの不正確な分注などのオペレーターミスにつながる可能性があります。ここでは、ゲル化と呼ばれる技術が提示されており、マスターミックスに存在する水の大部分は、真空に提出されたときにゾル-ゲル混合物を形成する試薬によって置換されます。その結果、qPCR試薬は室温で数週間、または2〜8 °Cで数ヶ月間効果的に保存されます。 各溶液の調製の詳細は、T. cruzi 衛星DNA(satDNA)を検出するために設計されたゲル化反応の予想される側面とともにここに示されています。同様の手順を他の生物の検出にも適用できます。ゲル化qPCRランの開始は、プレートを冷蔵庫から取り出し、サンプルをそれぞれのウェルに追加し、ランを開始するのと同じくらい簡単で、フルプレート反応のセットアップ時間をサンプルのロードにかかる時間に短縮します。さらに、ゲル化PCR反応はバッチで製造および品質を制御できるため、時間を節約し、ルーチンPCR反応を実行する際の一般的なオペレーターのミスを回避できます。

ゲル化混合物を形成する3つの試薬は、激しいボルテックスで容易に可溶化されます。ただし、グリコーゲンは、粉末が完全に可溶化されていることを確認するために慎重なボルテックスを必要とします。残念ながら、激しい渦流は大量の気泡を生成するため、溶液の実際の体積を決定することは困難です(図1A-B)。したがって、気泡内に閉じ込?...

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Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

本研究では、反応容器にプリロードして冷蔵庫に数ヶ月間保存できる 、T. cruzi DNA検出用のすぐに使用できるqPCRを製造するための手順について説明します。

トリパノソーマ・クルジまたは他の病原性生物由来のDNAを検出するためのすぐに使用できるqPCR

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

ゲル化プロトコルは、すぐに使用できるqPCR反応を生成し、実行を開始するために必要な時間とステップを削減します。このプロトコルにより、qPCR反応を一度に生成および制御して品質と量を測定できるため、レシピ計算中またはウェルへの分注中にオペレーターエラーが発生する可能性が低くなります。この方法は、従来の凍結フォーマットですでに完全に最適化されているすべてのqPCRに適用できます。2つの主要な品質管理ステップが視覚的であるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。メレジトース溶液を調製するには、15ミリリットルのプラスチックチューブに4グラムのメレジトースを秤量し、6ミリリットルのヌクレアーゼ遊離水を加え、粉末が可溶になるまで最高速度でボルテックスします。ヌクレアーゼを含まない水で最終容量を10ミリリットルにし、溶液にラベルを付けて摂氏2〜8度で最大6か月間保管します。トレハロース溶液を調製するには、15ミリリットルのプラスチックチューブに4グラムのトレハロースを秤量し、粉末が可溶化するまで6ミリリットルのヌクレアーゼ遊離水とボルテックスを最高速度で加えます。次に、ヌクレアーゼを含まない水で容量を10ミリリットルに構成し、0.2ミクロンのフィルターで溶液をろ過します。溶液にラベルを付け、摂氏2〜8度で最大6か月間保管します。グリコーゲン溶液を調製するには、15ミリリットルのチューブに2グラムのグリコーゲンを秤量し、6ミリリットルのヌクレアーゼ遊離水を加え、粉末が可溶になるまでボルテックスします。グリコーゲンの可溶化により大量の気泡が発生するため、溶液を摂氏2〜8度に8〜12時間保ちます。翌日、インキュベーションから溶液を取り出し、ヌクレアーゼを含まない水で容量を10ミリリットルに構成し、標識した溶液を摂氏2〜8度で最大6か月間保存します。リジン溶液を調製するには、15ミリリットルのチューブに7.5ミリグラムのリジンを量り、6ミリリットルのヌクレアーゼ遊離水を加え、粉末が可溶になるまでボルテックスします。ヌクレアーゼを含まない水で容量を10ミリリットルに構成します。溶液を0.2ミクロンのフィルターでろ過し、摂氏2〜8度で最大6か月間保管します。ゲル化混合物を調製するには、50ミリリットルのプラスチックチューブに適切な量のストック溶液を混合します。チューブを10回反転させて試薬を混合し、標識した溶液を摂氏2〜8度で最大3か月間保管します。ゲル化用のqPCRマスターミックスを調製するには、冷蔵容器で試薬を解凍します。次に、1.5ミリリットルのチューブで適切な量の試薬を混合して、8本のチューブストリップまたは96ウェルプレートに十分なマスターミックスを調製します。次にピペット18.5マイクロリットルのゲル化マスターを各反応ウェルに混合し、チューブまたはプレートを真空オーブン内の熱伝導性支持体に入れます。96ウェルプレートを使用する場合は、吸水のために2つの96ウェルプレートごとに1つのベントナイトクレイバッグをオーブンに入れます。サイクルが完了したら、容量が目に見えて約5マイクロリットルに減少し、チューブまたはプレートを指で叩いても液体が動かないことを確認して、試薬の適切なゲル化についてチューブまたはプレートをチェックします。使用前に、チューブまたはプレートを摂氏2〜8度で8〜12時間密封して保管してください。ゲル化したqPCRを使用するには、チューブストリップまたはプレートを冷蔵庫から取り出し、ワークステーションで開いてサンプル操作を行います。15マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離水と5マイクロリットルのDNAサンプルを各反応容器に加えます。チューブまたはプレートを密封し、目的の実験を実行し、定期的なデータ分析を実行します。現在のプロトコルでは、チャンバー内の温度は摂氏30度で一定に保たれますが、圧力は910〜930ミリバールと真空近くで変化します。真空サイクルの後、チューブ内のマスターミックスは体積が減少し、底部でゲル化し、チューブを叩いても壁に飛び散ることはありません。ゲル化が不完全な場合、チューブを叩いたときに液体がチューブ壁に飛び散ります。公開されたオリゴヌクレオチド配列を用いたトリパノソーマcruzi-DNA検出をここに示す。ゲル化が正しく実行されなかったときに同じサンプルを検出すると、感度が低下しました。最も重要なステップは、ゲル化前の試薬量の計算です。水はプロセス中に除去されるため、オペレーターは水を追加しないように注意する必要があります。プロトコルの手順に厳密に従えば、基本的な実験室および分子生物学のスキルを持つオペレーターは、ゲル化プロセスを実行するのに問題はありません。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

ミツバチから脳ホモジネート ホスホリパーゼ C 活性の検出

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

F1の分離-寄生原生トリパノソーマから atp アーゼ

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

免疫ブロットやプロテオミクスによるタンパク質局在の解析シロイヌナズナから葉緑体小班の準備

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

茶由来の新たに確立された細胞懸濁液培養における6種の全身殺虫剤の代謝に関する研究(カメリアシネンシスL.葉

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

エチジウム ブロマイドや代替染料ではなくチアゾール オレンジを用いた DNA 電気泳動

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

ハイスループットプリマゼプロファイリングを用いたDNAプリマゼによるDNA配列認識

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

DNA上に集合したEWS-FLI1凝縮体の1分子イメージング

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

インビトロ β-ガラクトシダーゼを発現する寄生虫を用いた トリパノソーマクルジ のすべてのライフサイクル段階に対する薬物スクリーニング

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...