Name: ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms
Uploaded: 2022-01-20T12:30:00
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저자는 진공 오븐에 대한 기술 지원에 대해 Aline Burda Farias와 해당 장비에 대한 액세스를 허용한 Instituto de Biologia Molecular do Parana(브라질 쿠리티바, IBMP)의 행정부에 감사를 표하고 싶습니다. 이 작업은 CNPq 445954/2020-5 보조금으로 부분적으로 자금을 지원받았습니다.

1. 원액 및 겔화 혼합물의 제조
참고: 4개의 스톡 용액(400mg/mL의 멜레지토스, 400mg/mL의 트레할로스, 0.75mg/mL의 라이신 및 200mg/mL의 글리코겐)을 준비하고 표 1 에 표시된 비율에 따라 혼합하여 겔화 혼합물을 생성합니다. 이 프로토콜은 10mL의 스톡 용액 생산을 설명하지만 더 적거나 더 많은 양에 맞게 조정할 수 있습니다.
<ol><li>멜레지토스 용액<ol><li>15mL...

<ol>
	<li>Lewinsohn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carlos+Chagas+(1879-1934):+the+discovery+of+Trypanosoma+cruzi+and+of+American+trypanosomiasis+(foot-notes+to+the+history+of+Chagas's+disease).">Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease).</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).</li><li>Bern, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+Chagas+disease+in+the+United+States:+A+systematic+review.">Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review.</a> The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).</li><li>Pereira, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease+as+a+foodborne+illness.">Chagas' disease as a foodborne illness.</a> Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).</li><li>Tanowitz, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease.">Chagas' disease.</a> Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).</li><li>Rassi, A., Marin-Neto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+validation+of+quantitative+real-time+PCR+methods+for+quantification+of+trypanosoma+cruzi+DNA+in+blood+samples+from+chagas+disease+patients.">Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).</li><li>Rivero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Trypanosoma+cruzi+by+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+potential+novel+tool+for+the+detection+of+congenital+Chagas+infection.">Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).</li><li>Schijman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnosis+of+Trypanosoma+cruzi.">Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi.</a> Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).</li><li>Besuschio, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+cruzi+loop-mediated+isothermal+amplification+(Trypanosoma+cruzi+Loopamp)+kit+for+detection+of+congenital,+acute+and+Chagas+disease+reactivation.">Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).</li><li>Duffy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+real-time+PCR+strategy+for+monitoring+bloodstream+parasitic+loads+in+chagas+disease+patients.">Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).</li><li>Melo, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+real+time+PCR+to+quantify+parasite+load+in+serum+samples+from+chronic+Chagas+disease+patients.">Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients.</a> Parasites &amp; Vectors. 8 (1), 154 (2015).</li><li>Parrado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+serial+blood+sampling+and+PCR+replicates+for+treatment+monitoring+of+patients+with+chronic+Chagas+disease.">Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).</li><li>de Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ready-to-use+duplex+qPCR+to+detect+Leishmania+infantum+DNA+in+naturally+infected+dogs.">A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs.</a> Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).</li><li>Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+concept+for+a+portable+platform+for+molecular+diagnosis+of+tropical+diseases.">Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).</li><li>Costa, A. D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready-to-use+qPCR+for+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+or+Trypanosoma+cruzi+in+food+matrices.">Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices.</a> Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-storage+of+gelified+reagents+in+a+lab-on-a-foil+system+for+rapid+nucleic+acid+analysis.">Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis.</a> Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).</li><li>Kamau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample-ready+multiplex+qPCR+assay+for+detection+of+malaria.">Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria.</a> Malaria Journal. 13, 158 (2014).</li><li>Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+further+challenges+in+lyophilization.">Recent advances and further challenges in lyophilization.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).</li><li>Rosado, P. M. F. S., L&#243;pez, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+preparing+stabilised+reaction+mixtures,+which+are+totally+or+partially+dried,+comprising+at+least+one+enzyme,+reaction+mixtures+and+kits+containing+said+mixtures.">Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures.</a> PubChem. , (2002).</li><li>Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+fast+and+easy+sample-to-answer+protocol+for+tuberculosis+screening+in+point-of-care+settings:+A+proof+of+concept+study.">Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study.</a> PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).</li><li>Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+improved+U.S.+food+and+drug+administration+method+for+the+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+in+produce+using+real-time+PCR.">Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR.</a> Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).</li><li>Iglesias, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+new+gelled+nested+PCR+test+for+the+diagnosis+of+imported+malaria:+comparison+with+microscopy,+rapid+diagnostic+test,+and+real-time+PCR.">Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR.</a> Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).</li><li>Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnostics+for+Chagas+disease:+up+to+date+and+novel+methodologies.">Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).</li></ol>

최근 몇 년 동안 열대성 및 방치 된 질병을 진단하는 데 도움이되는보다 민감하고 구체적인 기술을 찾아야 할 필요성이 강조되었습니다. 역학 통제에 중요하지만 기생충 검사(광학 현미경) 및 혈청 검사는 특히 민감도 및 현장 진료 적용 가능성과 관련하여 한계가 있습니다. PCR, 등온 증폭 및 각각의 변형과 같은 DNA 증폭 기술은 실험실 환경에서 오랫동안 사용되어 왔지만 기술적 장애물로 인해 현...

샤가스병은 20세기 초 빈곤이 만연한 브라질의 시골 지역에서 발견되었습니다.1,2. 오늘날에도이 질병은 아메리카 대륙의 건강의 사회적, 경제적 결정 요인과 계속 연결되어 있습니다. 샤가스병은 급성기 및 만성기를 포함하는 이상성이다. Trypanosoma cruzi 기생충에 의한 감염, 곤충 매개체에 의해 전염, 선천적 경로를 통한 수혈 또는 오염 된 음식 3,4의 경구 섭취로 인해 발생합니다.
샤가스병의 진단은 임상 증상(특히 로마냐 징후), 혈액 도말 현미경, 혈청학 및 실시간 PCR(qPCR) 또는 등온 증폭 4,5,6,7,8,9와 같은 분자 검사의 관찰을 통해 이루어질 수 있습니다. 임상 증상 및 혈액 도말 현미경 검사는 급성 감염이 의심되는 경우에 사용되는 반면 항체 검색은 무증상 환자의 선별 도구로 사용됩니다. qPCR은 민감도와 특이성으로 인해 만성 환자, 혈액 내 기생충 부하를 측정하는 치료를 받는 급성 환자의 모니터링 도구 및 치료 실패의 대리 마커로 사용되는 것으로 제안되었습니다.6,8,10,11,12 . 현재 이용 가능한 검사보다 더 민감하고 구체적이지만, qPCR은 운송 및 보관을 위한 동결 온도 요구 사항으로 인해 전 세계적으로 소외된 지역에서 진단 도구로 알려지는 것을 효과적으로 방지합니다13,14,15.
이 장애물을 피하기 위해 동결 건조 및 겔화와 같은 보존 기술이 탐구되었습니다16,17. 동결 건조는 수년간 보존을 제공하지만 효소 안정화 / 보존에 일반적으로 사용되는 글리세롤이없는 특수 제작 된 시약이 필요합니다18. 겔화는 수개월 동안 보존을 제공하는 것으로 나타났지만, 이는 규칙적인 시약(19)의 사용을 허용한다. 겔화 용액은 공정에서 각각 특정 역할을 하는 4가지 구성 요소로 구성됩니다: 당 트레할로스 및 멜레지토스는 용액의 자유 물 분자를 감소시켜 건조 과정에서 생체 분자를 보호하고, 글리코겐은 더 넓은 보호 매트릭스를 생성하며, 아미노산 라이신은 생체 분자의 카르복실 사이의 산화 반응을 억제하는 자유 라디칼 제거제로 사용되며, 아미노 및 인산염 그룹. 이들 성분은 건조 과정 동안 3차 또는 4차 구조의 손실을 방지하는 졸-겔 혼합물을 정의하여, 재수화 시 생체분자의 활성을 유지하는 것을 돕는다(19). 일단 반응 튜브 내부에서 안정화되면, 반응은 일반 -20 °C 대신 2-8 °C에서 몇 달 동안 또는 21-23 °C에서 몇 주 동안 저장 될 수 있습니다. 이 접근법은 이미 샤 가스 병, 말라리아, 리 슈만 편모충 증, 결핵 및 시클로 스포리아증 13,14,15,20과 같은 질병을 진단하는 데 도움이되도록 설계된 테스트에 통합되었습니다.
본 작업은 겔화 절차에 필요한 솔루션을 준비하는 모든 단계, 공정의 함정 및 8-튜브 스트립 내에서 즉시 사용 가능한 겔화된 qPCR의 예상되는 최종 측면을 설명합니다. 동일한 프로토콜을 단일 튜브 또는 96웰 플레이트에 적용할 수 있습니다. 마지막으로, T. cruzi DNA의 검출은 대조군 실행으로 표시됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bentonite clay bags (activated)</td>
			<td>Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain)</td>
			<td>026157/STD</td>
			<td>Not to be confused with silica gel packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td>Cat# US16445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>Cat# 365650250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melezitoze</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 63620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mastermix</td>
			<td>preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paran&#225; (IBMP, Curitiba, Brazil)</td>
			<td>Chagas NAT kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software for vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>Celsius v10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypanosoma cruzi DNA</td>
			<td>from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>VO-400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms

Real-time PCR(qPCR)은 다수의 샘플에서 미량의 핵산 표적을 증폭할 수 있는 매우 민감하고 정밀한 기술입니다. 그것은 많은 연구 분야에서 광범위하게 사용되어 왔으며 유전자 변형 유기체 (GMO) 작물의 작물에서 인간 진단 및 형질 선택과 같은 분야에서 산업적 응용을 달성했습니다. 그러나 qPCR은 오류 방지 기술이 아닙니다. 모든 시약을 단일 마스터 혼합물로 혼합한 후 일반 qPCR 플레이트의 96개 웰에 분배하면 시약의 잘못된 혼합 또는 웰로의 부정확한 분주와 같은 작업자 실수가 발생할 수 있습니다. 여기에서는 겔화라고 불리는 기술이 제시되며, 마스터 믹스에 존재하는 대부분의 물은 진공 상태로 제출 될 때 졸-겔 혼합물을 형성하는 시약으로 대체됩니다. 결과적으로, qPCR 시약은 실온에서 몇 주 동안 또는 2-8 oC에서 몇 달 동안 효과적으로 보존됩니다. 각 용액 준비에 대한 세부 사항은 T. cruzi 위성 DNA (satDNA)를 검출하도록 설계된 겔화 반응의 예상 측면과 함께 여기에 나와 있습니다. 유사한 절차를 적용하여 다른 유기체를 검출 할 수 있습니다. 겔화된 qPCR 실행을 시작하는 것은 냉장고에서 플레이트를 제거하고, 샘플을 각각의 웰에 추가하고, 실행을 시작하는 것만큼 간단하므로 전체 플레이트 반응의 설정 시간을 샘플을 로드하는 데 걸리는 시간으로 줄일 수 있습니다. 또한 겔화 PCR 반응을 생산하고 품질을 위해 배치로 제어할 수 있어 시간을 절약하고 일상적인 PCR 반응을 실행하는 동안 일반적인 작업자 실수를 방지할 수 있습니다.

겔화 혼합물을 형성하는 시약 중 3개는 격렬한 와류 시 쉽게 용해됩니다. 그러나 글리코겐은 분말이 완전히 용해되었는지 확인하기 위해 신중한 와동이 필요합니다. 불행히도, 격렬한 와류는 많은 기포를 생성하여 용액의 실제 부피를 결정하기가 어렵습니다 (그림 1A-B). 따라서 기포 안에 갇힌 대부분의 용액이 주 용액 본체로 이동할 때까지 글리코?...

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Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

본 연구는 반응 용기에 미리 로드되어 몇 달 동안 냉장고에 보관할 수 있는 T. cruzi DNA 검출을 위해 즉시 사용 가능한 qPCR을 생산하는 단계를 설명합니다.

트리파노소마 크루지 또는 기타 병원성 유기체의 DNA 검출을 위한 즉시 사용 가능한 qPCR

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

겔화 프로토콜은 실행을 시작하는 데 필요한 시간과 단계를 줄이는 즉시 사용 가능한 qPCR 반응을 생성합니다. 이 프로토콜을 사용하면 qPCR 반응을 한 번에 품질 및 대량으로 생산 및 제어할 수 있으므로 레시피 계산 또는 웰에 분취 중 작업자 오류 가능성이 줄어듭니다. 이 방법은 종래의 냉동 포맷에서 이미 완전히 최적화된 임의의 qPCR에 적용될 수 있다.이 방법의 시각적 데모는 두 가지 주요 품질 관리 단계가 시각적이기 때문에 중요합니다. 멜레지토스 용액을 준비하려면 15밀리리터 플라스틱 튜브에 4g의 멜레지토스를 계량하고 6밀리리터의 뉴클레아제 자유수를 넣고 분말이 용해될 때까지 최대 속도로 와동시킵니다. 뉴클레아제 자유수로 최종 부피를 10 밀리리터로 만든 다음 라벨을 붙이고 섭씨 2도에서 8도까지 최대 6 개월 동안 보관하십시오.트레할로스 용액을 준비하려면 15 밀리리터 플라스틱 튜브에 트레할로스 4 그램의 무게를 달고 6 밀리리터의 뉴 클레아제 자유수를 넣고 분말이 용해 될 때까지 최대 속도로 와동합니다. 그런 다음 뉴클레아제 자유수로 부피를 10 밀리리터로 구성하고 0.2 미크론 필터를 통해 용액을 여과합니다. 용액에 라벨을 붙이고 섭씨 2도에서 8도까지 최대 6개월 동안 보관하십시오.글리코겐 용액을 준비하려면 15 밀리리터 튜브에 글리코겐 2g의 무게를 달고 6 밀리리터의 뉴 클레아제 자유 물을 넣고 분말이 용해 될 때까지 와동시킵니다. 글리코겐의 가용화는 많은 거품을 생성하기 때문에 용액을 섭씨 2도에서 8도에서 12시간 동안 유지하십시오. 다음날, 배양에서 용액을 제거하고, 뉴 클레아제 자유 수로 부피를 10 밀리리터로 보충하고, 표지 된 용액을 섭씨 2도에서 8도까지 최대 6 개월 동안 저장한다.라이신 용액을 준비하려면 15 밀리리터 튜브에 라이신 7.5 밀리그램의 무게를 달고 6 밀리리터의 뉴 클레아제 자유 물을 넣고 분말이 용해 될 때까지 와동시킵니다. 뉴클레아제 자유 수로 부피를 10 밀리리터로 구성하십시오. 0.2 미크론 필터를 통해 용액을 여과하고 섭씨 2도에서 8도에서 최대 6 개월 동안 보관하십시오.겔화 혼합물을 준비하려면 50 밀리리터 플라스틱 튜브에 적절한 양의 스톡 용액을 혼합하십시오. 튜브를 10 번 뒤집어 시약을 혼합하고 라벨이 붙은 용액을 섭씨 2도에서 8도까지 최대 3 개월 동안 보관하십시오. 겔화를 위해 qPCR 마스터 믹스를 준비하려면 냉장 용기에서 시약을 해동합니다.그런 다음 1.5 밀리리터 튜브에 적절한 양의 시약을 혼합하여 8 튜브 스트립 또는 96 웰 플레이트에 충분한 마스터 믹스를 준비합니다. 다음으로 피펫 18.5 마이크로리터의 겔화 마스터 믹스를 각 반응 웰에 놓고 튜브 또는 플레이트를 진공 오븐 내부의 열전도성 지지체에 놓습니다. 96웰 플레이트를 사용하는 경우 수분 흡수를 위해 96웰 플레이트 2개당 벤토나이트 점토 백 1개를 오븐에 넣습니다.사이클이 완료되면 부피가 약 5 마이크로 리터로 눈에 띄게 감소하고 손가락으로 튜브 또는 플레이트를 두드릴 때 액체가 움직이지 않는지 확인하여 시약의 적절한 겔화를 위해 튜브 또는 플레이트를 확인하십시오. 사용하기 전에 튜브 또는 플레이트를 섭씨 2도에서 8도에서 12시간 동안 밀봉하고 보관하십시오. 겔화된 qPCR을 사용하려면 냉장고에서 튜브 스트립 또는 플레이트를 제거하고 샘플 조작을 위해 워크스테이션에서 엽니다.15 마이크로리터의 뉴클레아제 자유수와 5마이크로리터의 DNA 샘플을 각 반응 용기에 첨가한다. 튜브 또는 플레이트를 밀봉하고 원하는 실험을 실행하고 정기적인 데이터 분석을 수행합니다. 본 프로토콜에서, 챔버 내부의 온도는 섭씨 30도에서 일정하게 유지되는 반면, 압력은 910 내지 930 밀리바 사이에서 그리고 거의 진공에 가깝게 변한다.진공 사이클 후, 튜브 내부의 마스터 믹스는 부피가 감소하고 바닥에서 겔화되며 튜브를 두드릴 때 벽에 튀지 않습니다. 겔화가 불완전하면 튜브를 두드릴 때 액체가 튜브 벽에 튀어 나옵니다. 공개된 올리고뉴클레오티드 서열을 사용한 트리파노소마 크루지-DNA 검출이 여기에 표시됩니다.겔화가 올바르게 실행되지 않았을 때 동일한 샘플을 검출하면 감도가 손실되었습니다. 가장 중요한 단계는 겔화 전에 시약 부피를 계산하는 것입니다. 작업자는 공정 중에 물이 제거되므로 물을 추가하지 않는 것을 기억해야합니다.프로토콜 단계를 면밀히 따른다면 기본적인 실험실 및 분자 생물학 기술을 갖춘 작업자가 겔화 과정을 수행하는 데 어려움이 없습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

연구

생화학

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

꿀벌에서 두뇌 Homogenate에서 Phospholipase C 활동의 탐지

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

F1의 절연-ATPase 기생 원생 생물 Trypanosoma brucei 에서

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

단백질 지 방화 Immunoblotting 또는 단백질의 분석에 대 한 애기에서 엽록체 하위 구획의 준비

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

차에서 파생된 새로 설립된 세포 현탁액 배양에서 6개의 전신 살충제의 물질대사에 관한 연구(동백나무시넨시스 L.) 잎

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

Ethidium 평범한 사람 또는 대체 염료 대신 Thiazole 오렌지를 사용 하 여 DNA 전기 이동 법

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

고처리량 프리마제 프로파일링을 사용하여 DNA 프리마제에 의한 DNA 서열 인식

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 단일 분자 이미징

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

체외 β-갈락토시다제를 발현하는 기생충을 이용한 트리파노소마 크루지 의 모든 생애주기 단계에 대한 약물 스크리닝

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...