Name: ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms
Uploaded: 2022-01-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms at JoVE.com

Forfatterne ønsker å uttrykke sin takknemlighet til Aline Burda Farias for teknisk assistanse med vakuumovnen, samt til administrasjonen ved Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brasil) for å gi tilgang til nevnte utstyr. Dette arbeidet ble delvis finansiert av tilskudd CNPq 445954/2020-5.

1. Fremstilling av stamløsninger og gelifiseringsblanding
MERK: Fire stamløsninger vil bli fremstilt (400 mg/ml melezitose, 400 mg/ml trehalose, 0,75 mg/ml lysin og 200 mg/ml glykogen) og blandet i henhold til andelen vist i tabell 1 for å produsere gelifiseringsblandingen. Selv om protokollen beskriver 10 ml lagerløsningsproduksjon, kan den tilpasses for lavere eller høyere volumer.
<ol><li>Melezitose løsning<ol><li>Vei 4 g melezitose i et 15 ml plast...

<ol>
	<li>Lewinsohn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carlos+Chagas+(1879-1934):+the+discovery+of+Trypanosoma+cruzi+and+of+American+trypanosomiasis+(foot-notes+to+the+history+of+Chagas's+disease).">Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease).</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).</li><li>Bern, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+Chagas+disease+in+the+United+States:+A+systematic+review.">Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review.</a> The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).</li><li>Pereira, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease+as+a+foodborne+illness.">Chagas' disease as a foodborne illness.</a> Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).</li><li>Tanowitz, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease.">Chagas' disease.</a> Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).</li><li>Rassi, A., Marin-Neto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+validation+of+quantitative+real-time+PCR+methods+for+quantification+of+trypanosoma+cruzi+DNA+in+blood+samples+from+chagas+disease+patients.">Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).</li><li>Rivero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Trypanosoma+cruzi+by+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+potential+novel+tool+for+the+detection+of+congenital+Chagas+infection.">Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).</li><li>Schijman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnosis+of+Trypanosoma+cruzi.">Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi.</a> Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).</li><li>Besuschio, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+cruzi+loop-mediated+isothermal+amplification+(Trypanosoma+cruzi+Loopamp)+kit+for+detection+of+congenital,+acute+and+Chagas+disease+reactivation.">Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).</li><li>Duffy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+real-time+PCR+strategy+for+monitoring+bloodstream+parasitic+loads+in+chagas+disease+patients.">Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).</li><li>Melo, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+real+time+PCR+to+quantify+parasite+load+in+serum+samples+from+chronic+Chagas+disease+patients.">Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients.</a> Parasites &amp; Vectors. 8 (1), 154 (2015).</li><li>Parrado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+serial+blood+sampling+and+PCR+replicates+for+treatment+monitoring+of+patients+with+chronic+Chagas+disease.">Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).</li><li>de Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ready-to-use+duplex+qPCR+to+detect+Leishmania+infantum+DNA+in+naturally+infected+dogs.">A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs.</a> Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).</li><li>Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+concept+for+a+portable+platform+for+molecular+diagnosis+of+tropical+diseases.">Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).</li><li>Costa, A. D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready-to-use+qPCR+for+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+or+Trypanosoma+cruzi+in+food+matrices.">Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices.</a> Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-storage+of+gelified+reagents+in+a+lab-on-a-foil+system+for+rapid+nucleic+acid+analysis.">Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis.</a> Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).</li><li>Kamau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample-ready+multiplex+qPCR+assay+for+detection+of+malaria.">Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria.</a> Malaria Journal. 13, 158 (2014).</li><li>Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+further+challenges+in+lyophilization.">Recent advances and further challenges in lyophilization.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).</li><li>Rosado, P. M. F. S., L&#243;pez, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+preparing+stabilised+reaction+mixtures,+which+are+totally+or+partially+dried,+comprising+at+least+one+enzyme,+reaction+mixtures+and+kits+containing+said+mixtures.">Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures.</a> PubChem. , (2002).</li><li>Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+fast+and+easy+sample-to-answer+protocol+for+tuberculosis+screening+in+point-of-care+settings:+A+proof+of+concept+study.">Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study.</a> PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).</li><li>Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+improved+U.S.+food+and+drug+administration+method+for+the+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+in+produce+using+real-time+PCR.">Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR.</a> Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).</li><li>Iglesias, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+new+gelled+nested+PCR+test+for+the+diagnosis+of+imported+malaria:+comparison+with+microscopy,+rapid+diagnostic+test,+and+real-time+PCR.">Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR.</a> Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).</li><li>Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnostics+for+Chagas+disease:+up+to+date+and+novel+methodologies.">Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).</li></ol>

De siste årene har fremhevet behovet for å finne mer følsomme og spesifikke teknologier for å diagnostisere tropiske og forsømte sykdommer. Selv om det er viktig for epidemiologisk kontroll, har parasitologiske (optisk mikroskopi) og serologiske tester begrensninger, spesielt når det gjelder følsomhet og pasientnær anvendelighet. DNA-amplifikasjonsteknikker som PCR, isotermisk forsterkning og respektive variasjoner har lenge vært brukt i laboratorieinnstillinger, men teknologiske hindringer utelukker at den bruk...

Chagas sykdom ble oppdaget tidligi det 20. århundre i landlige regioner i Brasil, hvor fattigdom var utbredt 1,2. Selv i dag fortsetter sykdommen å være knyttet til sosiale og økonomiske determinanter for helse i Amerika. Chagas sykdom er bifasisk, bestående av en akutt og kronisk fase. Det er forårsaket av infeksjon av Trypanosoma cruzi parasitten, overføres av insektvektorer, blodtransfusjoner via medfødt rute, eller oral inntak av forurenset mat 3,4.
Diagnosen av Chagas sykdom kan gjøres gjennom observasjon av kliniske symptomer (spesielt Romaña-tegnet), blodutstrykmikroskopi, serologi og molekylære tester som sanntids PCR (qPCR) eller isotermisk forsterkning 4,5,6,7,8,9. Kliniske symptomer og blodutstrykmikroskopi brukes ved mistanke om akutte infeksjoner, mens søk etter antistoffer brukes som screeningverktøy hos asymptomatiske pasienter. På grunn av sin følsomhet og spesifisitet har qPCR blitt foreslått å bli brukt som et overvåkingsverktøy for kroniske pasienter, for akutte pasienter som gjennomgår behandling som måler parasittbelastningen i blodet, og som surrogatmarkør for terapeutisk svikt 6,8,10,11,12 . Selv om det er mer følsomt og spesifikt enn dagens tilgjengelige tester, er qPCR effektivt forhindret fra å bli kjent som diagnostiske verktøy i underprivilegerte regioner over hele verden på grunn av kravet om frysende temperaturer for transport og lagring13,14,15.
For å omgå denne hindringen har bevaringsteknikker som lyofilisering og gelifisering blitt utforsket16,17. Mens lyofilisering gir bevaring i årevis, krever det spesiallagde reagenser uten tilstedeværelse av glyserol, som ofte brukes til enzymstabilisering / bevaring18. Mens gelifisering har vist seg å gi bevaring i flere måneder, tillater det bruk av vanlige reagenser19. Gelifiseringsløsningen består av fire komponenter, hver med spesifikke roller i prosessen: sukkertrehalose og melezitose beskytter biomolekylene under uttørkingsprosessen ved å redusere frie vannmolekyler i løsningen, glykogen produserer en bredere beskyttende matrise, og aminosyren lysin brukes som en fri radikalscavenger for å hemme oksidasjonsreaksjonene mellom biomolekylets karboksyl, amino- og fosfatgrupper. Disse komponentene definerer en sol-gelblanding som forhindrer tap av tertiær eller kvaternær struktur under uttørkingsprosessen, og bidrar dermed til å opprettholde biomolekylenes aktivitet ved rehydrering19. Når reaksjonsrørene er stabilisert, kan reaksjonene lagres i noen måneder ved 2-8 °C eller noen uker ved 21-23 °C i stedet for de vanlige -20 °C. Denne tilnærmingen er allerede innarbeidet i tester som er utformet for å diagnostisere sykdommer som Chagas sykdom, malaria, leishmaniasis, tuberkulose og ciklosporiasis13,14,15,20.
Det nåværende arbeidet beskriver alle trinnene for å forberede de nødvendige løsningene for gelifiseringsprosedyren, fallgruvene i prosessen og det forventede endelige aspektet av en bruksklar gelifisert qPCR inne i åtte-rørsstrimler. Den samme protokollen kan tilpasses for enkeltrør eller 96-brønnsplater. Til slutt vil deteksjonen av T. cruzi DNA bli vist som en kontrollkjøring.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bentonite clay bags (activated)</td>
			<td>Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain)</td>
			<td>026157/STD</td>
			<td>Not to be confused with silica gel packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td>Cat# US16445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>Cat# 365650250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melezitoze</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 63620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mastermix</td>
			<td>preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paran&#225; (IBMP, Curitiba, Brazil)</td>
			<td>Chagas NAT kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software for vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>Celsius v10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypanosoma cruzi DNA</td>
			<td>from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>VO-400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms

Real-time PCR (qPCR) er en bemerkelsesverdig følsom og presis teknikk som gjør det mulig å forsterke små mengder nukleinsyremål fra en rekke prøver. Det har blitt mye brukt i mange forskningsområder og oppnådd industriell anvendelse på områder som menneskelig diagnostikk og egenskapsvalg i avlinger av genmodifiserte organismer (GMO) avlinger. qPCR er imidlertid ikke en feilsikker teknikk. Blanding av alle reagenser i en enkelt masterblanding som deretter distribueres på 96 brønner i en vanlig qPCR-plate, kan føre til operatørfeil som feil blanding av reagenser eller unøyaktig dispensering i brønnene. Her presenteres en teknikk som kalles gelifisering, hvorved det meste av vannet som er tilstede i masterblandingen erstattes av reagenser som danner en sol-gelblanding når den sendes til et vakuum. Som et resultat blir qPCR-reagenser effektivt bevart i noen uker ved romtemperatur eller noen måneder ved 2-8 oC. Detaljer om fremstilling av hver løsning vises her sammen med det forventede aspektet av en gelifisert reaksjon designet for å oppdage T. cruzi satellitt-DNA (satDNA). En lignende prosedyre kan brukes til å oppdage andre organismer. Å starte en gelifisert qPCR-kjøring er så enkelt som å fjerne platen fra kjøleskapet, legge prøvene til deres respektive brønner og starte kjøringen, og dermed redusere oppsettstiden for en fullplatereaksjon på tiden det tar å laste prøvene. I tillegg kan gelifiserte PCR-reaksjoner produseres og kontrolleres for kvalitet i batcher, noe som sparer tid og unngår vanlige operatørfeil mens du kjører rutinemessige PCR-reaksjoner.

Tre av reagensene som danner gelifiseringsblandingen, oppløses lett ved kraftig vortexing. Glykogen krever imidlertid forsiktig vortexing for å sikre at pulveret er fullstendig oppløselig. Dessverre produserer kraftig vortexing mange bobler, noe som gjør det vanskelig å bestemme det faktiske volumet av løsningen (figur 1A-B). Derfor er det viktig å la glykogenoppløsningen hvile i kjøleskapet til det meste av løsningen fanget i boblene har flyttet n...

Watch this Scientific Journal Video about Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms at JoVE.com

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Det foreliggende arbeidet beskriver trinnene for å produsere klar til bruk qPCR for T. cruzi DNA-deteksjon som kan forhåndslastes på reaksjonsbeholderen og lagres i kjøleskapet i flere måneder.

Klar til bruk qPCR for påvisning av DNA fra Trypanosoma cruzi eller andre patogene organismer

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

Gelifiseringsprotokollen produserer bruksklare qPCR-reaksjoner som reduserer tiden og trinnene som kreves for å starte en kjøring. Denne protokollen gjør det mulig å produsere og kontrollere qPCR-reaksjoner for kvalitet og store mengder samtidig, noe som reduserer sjansene for operatørfeil under oppskriftsberegninger eller aliquoting i brønner. Denne metoden kan brukes på alle qPCR som allerede er fullt optimalisert i det konvensjonelle frosne formatet.Visuell demonstrasjon av denne metoden er viktig fordi to av de viktigste kvalitetskontrolltrinnene er visuelle. For å forberede melezitoseoppløsningen, veie fire gram melezitose i et 15 milliliter plastrør, tilsett seks milliliter nukleasefritt vann og virvel med maksimal hastighet til pulveret er oppløselig. Gjør det endelige volumet til 10 milliliter med nukleasefritt vann, merk deretter og oppbevar løsningen ved to til åtte grader Celsius i opptil seks måneder.For å forberede trehaloseoppløsningen, vei fire gram trehalose i et 15 milliliter plastrør, tilsett seks milliliter nukleasefritt vann og virvel ved maksimal hastighet til pulveret er oppløselig. Gjør deretter opp volumet til 10 milliliter med nukleasefritt vann og filtrer løsningen gjennom et 0, 2 mikron filter. Merk og oppbevar løsningen ved to til åtte grader Celsius i opptil seks måneder.For å fremstille glykogenoppløsningen, vei to gram glykogen i et 15 milliliter rør, tilsett seks milliliter nukleasefritt vann og virvel til pulveret er oppløselig. Hold løsningen ved to til åtte grader Celsius i åtte til 12 timer fordi oppløseliggjøring av glykogen produserer mange bobler. Neste dag, fjerner løsningen fra inkubasjon, utgjør volumet til 10 milliliter med nukleasefritt vann og lagrer den merkede løsningen ved to til åtte grader Celsius i opptil seks måneder.For å fremstille lysinoppløsningen veier du 7, 5 milligram lysin i et 15 milliliter rør, tilsett seks milliliter nukleasefritt vann og virvel til pulveret er oppløselig. Gjør opp volumet til 10 milliliter med nukleasefritt vann. Filtrer løsningen gjennom et 0,2 mikron filter og oppbevar ved to til åtte grader Celsius i opptil seks måneder.For å fremstille gelifiseringsblandingen, bland de riktige volumene av stamløsninger i et 50 milliliter plastrør. Bland reagensene ved å invertere røret 10 ganger og oppbevar den merkede løsningen ved to til åtte grader Celsius i opptil tre måneder. For å forberede qPCR-masterblandingen for gelifisering, tine reagensene i en kjølebeholder.Bland deretter passende volumer av reagensene i et 1, 5 milliliter rør for å forberede nok masterblanding for en åtte rørstrimmel eller en 96-brønnplate. Neste pipette 18,5 mikroliter av gelifiseringsmasteren blandes på hver reaksjonsbrønn og plasser rørene eller platen i den varmeledende støtten inne i vakuumovnen. Hvis du bruker 96 brønnplater, plasser en bentonitt leirepose i ovnen for hver to 96 brønnplater for vannabsorpsjon.Når syklusen er fullført, kontroller rørene eller platene for riktig gelifisering av reagensene ved å sikre at volumet er synlig redusert til omtrent fem mikroliter og væskene ikke beveger seg ved å tappe rørene eller platene med fingrene. Forsegl og oppbevar rørene eller platene ved to til åtte grader Celsius i åtte til 12 timer før bruk. For å bruke den gelifiserte qPCR, fjern rørstrimmelen eller platen fra kjøleskapet og åpne den i en arbeidsstasjon for prøvemanipulering.Tilsett 15 mikroliter nukleasefritt vann og fem mikroliter DNA-prøve til hvert reaksjonsbeholder. Forsegl rørene eller platene, kjør ønsket eksperiment og utfør regelmessig dataanalyse. I denne protokollen holdes temperaturen inne i kammeret konstant ved 30 grader Celsius, mens trykket varierer mellom 910 og 930 millibar og nær vakuum.Etter vakuumsyklusen reduseres masterblandingen inne i røret i volum, blir gelifisert i bunnen og spruter ikke på veggene når rørene tappes. Hvis gelifiseringen er ufullstendig, spruter væsken på rørveggene når rørene tappes. Trypanosoma cruzi-DNA-deteksjon ved bruk av publiserte oligonukleotidsekvenser er vist her.Påvisning av samme prøve når gelifisering ikke ble korrekt utført, resulterte i tap av følsomhet. Det mest kritiske trinnet er beregning av reagensvolum før gelifisering. Operatøren må huske å ikke legge til vann, siden det vil bli fjernet under prosessen.Hvis protokolltrinnene følges nøye, vil operatører med grunnleggende laboratorie- og molekylærbiologiske ferdigheter ikke ha noen problemer med å utføre gelifiseringsprosessen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Deteksjon og visualisering av DNA-skadeinducerte proteinkomplekser i suspensjoncellekulturer ved bruk av næringslysanalysen

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Deteksjon av fosfolipase C aktivitet i hjernen Homogenate fra Honeybee

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolering av F-1-ATPase fra den parasittiske Protist Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Utarbeidelse av Chloroplast sub deler fra Arabidopsis for analyse av Protein lokalisering av Immunoblotting eller Proteomikk

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studier på metabolismen av seks systemiske insektmidler i en nylig etablert Cell suspensjon kultur avledet fra Tea (Camellia Sinensis L.) Blader

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA geleelektroforese bruke Thiazole oransje i stedet for Ethidium Bromide eller alternativ fargestoffer

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA Sequence anerkjennelse av DNA Primase ved hjelp av høy gjennomstrømming Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbasert endonukleasekoblet DNA-metyleringsanalyse for å screene for DNA-metyltransferasehemmere

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Enkeltmolekylavbildning av EWS-FLI1-kondensater som monteres på DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

In vitro Narkotika screening mot alle livssyklus stadier av Trypanosoma cruzi Bruke parasitter Uttrykke β-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...