Name: ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms
Uploaded: 2022-01-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms at JoVE.com

Авторы хотели бы выразить благодарность Алин Бурда Фариас за техническую помощь с вакуумной печью, а также администрации Института молекулярной биологии Параны (IBMP, Куритиба, Бразилия) за предоставление доступа к указанному оборудованию. Эта работа была частично профинансирована грантом CNPq 445954/2020-5.

1. Приготовление стоковых растворов и гелеобразующих смесей
ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре исходных раствора будут приготовлены (400 мг/мл мелезитозы, 400 мг/мл трегалозы, 0,75 мг/мл лизина и 200 мг/мл гликогена) и смешаны в соответствии с пропорцией, указанной в таблице 1 , д...

<ol>
	<li>Lewinsohn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carlos+Chagas+(1879-1934):+the+discovery+of+Trypanosoma+cruzi+and+of+American+trypanosomiasis+(foot-notes+to+the+history+of+Chagas's+disease).">Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease).</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).</li><li>Bern, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+Chagas+disease+in+the+United+States:+A+systematic+review.">Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review.</a> The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).</li><li>Pereira, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease+as+a+foodborne+illness.">Chagas' disease as a foodborne illness.</a> Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).</li><li>Tanowitz, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease.">Chagas' disease.</a> Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).</li><li>Rassi, A., Marin-Neto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+validation+of+quantitative+real-time+PCR+methods+for+quantification+of+trypanosoma+cruzi+DNA+in+blood+samples+from+chagas+disease+patients.">Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).</li><li>Rivero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Trypanosoma+cruzi+by+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+potential+novel+tool+for+the+detection+of+congenital+Chagas+infection.">Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).</li><li>Schijman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnosis+of+Trypanosoma+cruzi.">Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi.</a> Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).</li><li>Besuschio, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+cruzi+loop-mediated+isothermal+amplification+(Trypanosoma+cruzi+Loopamp)+kit+for+detection+of+congenital,+acute+and+Chagas+disease+reactivation.">Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).</li><li>Duffy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+real-time+PCR+strategy+for+monitoring+bloodstream+parasitic+loads+in+chagas+disease+patients.">Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).</li><li>Melo, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+real+time+PCR+to+quantify+parasite+load+in+serum+samples+from+chronic+Chagas+disease+patients.">Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients.</a> Parasites &amp; Vectors. 8 (1), 154 (2015).</li><li>Parrado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+serial+blood+sampling+and+PCR+replicates+for+treatment+monitoring+of+patients+with+chronic+Chagas+disease.">Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).</li><li>de Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ready-to-use+duplex+qPCR+to+detect+Leishmania+infantum+DNA+in+naturally+infected+dogs.">A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs.</a> Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).</li><li>Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+concept+for+a+portable+platform+for+molecular+diagnosis+of+tropical+diseases.">Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).</li><li>Costa, A. D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready-to-use+qPCR+for+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+or+Trypanosoma+cruzi+in+food+matrices.">Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices.</a> Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-storage+of+gelified+reagents+in+a+lab-on-a-foil+system+for+rapid+nucleic+acid+analysis.">Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis.</a> Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).</li><li>Kamau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample-ready+multiplex+qPCR+assay+for+detection+of+malaria.">Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria.</a> Malaria Journal. 13, 158 (2014).</li><li>Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+further+challenges+in+lyophilization.">Recent advances and further challenges in lyophilization.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).</li><li>Rosado, P. M. F. S., L&#243;pez, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+preparing+stabilised+reaction+mixtures,+which+are+totally+or+partially+dried,+comprising+at+least+one+enzyme,+reaction+mixtures+and+kits+containing+said+mixtures.">Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures.</a> PubChem. , (2002).</li><li>Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+fast+and+easy+sample-to-answer+protocol+for+tuberculosis+screening+in+point-of-care+settings:+A+proof+of+concept+study.">Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study.</a> PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).</li><li>Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+improved+U.S.+food+and+drug+administration+method+for+the+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+in+produce+using+real-time+PCR.">Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR.</a> Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).</li><li>Iglesias, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+new+gelled+nested+PCR+test+for+the+diagnosis+of+imported+malaria:+comparison+with+microscopy,+rapid+diagnostic+test,+and+real-time+PCR.">Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR.</a> Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).</li><li>Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnostics+for+Chagas+disease:+up+to+date+and+novel+methodologies.">Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).</li></ol>

Последние годы подчеркнули необходимость поиска более чувствительных и специфических технологий, помогающих диагностировать тропические и забытые болезни. Несмотря на важность эпидемиологического контроля, паразитологические (оптическая микроскопия) и серологические тесты имеют ?...

Болезнь Шагаса была обнаружена в начале 20века в сельских районах Бразилии, где бедность была широко распространена 1,2. Даже сегодня болезнь по-прежнему связана с социальными и экономическими детерминантами здоровья в Северной и Южной Америке. Болезнь Шагаса двухфазна, включает в себя острую и хроническую фазы. Он вызван инфекцией паразитом Trypanosoma cruzi, передаваемой насекомыми-переносчиками, переливанием крови врожденным путем или пероральным приемом зараженной пищи 3,4.
Диагностика болезни Шагаса может быть проведена путем наблюдения клинических симптомов (особенно знака Романьи), микроскопии мазка крови, серологии и молекулярных тестов, таких как ПЦР в реальном времени (qPCR) или изотермическая амплификация 4,5,6,7,8,9. Клинические симптомы и микроскопия мазка крови используются при подозрении на острые инфекции, в то время как поиск антител используется в качестве инструмента скрининга у бессимптомных пациентов. Из-за своей чувствительности и специфичности qPCR было предложено использовать в качестве инструмента мониторинга для хронических пациентов, для острых пациентов, проходящих лечение, измеряя паразитарную нагрузку в крови, и в качестве суррогатного маркера терапевтической недостаточности 6,8,10,11,12 . Несмотря на то, что qPCR является более чувствительным и специфическим, чем имеющиеся в настоящее время тесты, он фактически не может быть известен как диагностические инструменты в неблагополучных регионах по всему миру из-за требования низких температур для транспортировки и хранения 13,14,15.
Чтобы обойти это препятствие, методы сохранения, такие как лиофилизация и гелеобразование, были изучены16,17. В то время как лиофилизация обеспечивает сохранение в течение многих лет, она требует специально изготовленных реагентов без присутствия глицерина, который обычно используется для стабилизации / сохранения ферментов18. Хотя было показано, что гелеобразование обеспечивает сохранение в течение нескольких месяцев, оно позволяет использовать обычные реагенты19. Раствор для гелеобразования содержит четыре компонента, каждый из которых играет определенную роль в процессе: сахара трегалоза и мелезитоза защищают биомолекулы в процессе высыхания, уменьшая молекулы свободной воды в растворе, гликоген производит более широкую защитную матрицу, а аминокислота лизин используется в качестве поглотителя свободных радикалов для ингибирования реакций окисления между карбоксилом биомолекулы, амино- и фосфатные группы. Эти компоненты определяют золь-гелевую смесь, которая предотвращает потерю третичной или четвертичной структуры в процессе высыхания, тем самым помогая поддерживать активность биомолекул при регидратации19. После стабилизации внутри реакционных трубок реакции могут храниться в течение нескольких месяцев при 2-8 °C или нескольких недель при 21-23 °C вместо обычных -20 °C. Этот подход уже был включен в тесты, предназначенные для диагностики таких заболеваний, как болезнь Шагаса, малярия, лейшманиоз, туберкулез и циклоспориаз 13,14,15,20.
Настоящая работа описывает все этапы подготовки необходимых растворов для процедуры гелеобразования, подводные камни в процессе и ожидаемый конечный аспект готовой к использованию гелеобразной qPCR внутри восьмитрубных полосок. Тот же протокол может быть адаптирован для одиночных труб или плит с 96 скважинами. Наконец, обнаружение ДНК T. cruzi будет показано как контрольный запуск.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bentonite clay bags (activated)</td>
			<td>Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain)</td>
			<td>026157/STD</td>
			<td>Not to be confused with silica gel packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td>Cat# US16445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>Cat# 365650250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melezitoze</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 63620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mastermix</td>
			<td>preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paran&#225; (IBMP, Curitiba, Brazil)</td>
			<td>Chagas NAT kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software for vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>Celsius v10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypanosoma cruzi DNA</td>
			<td>from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>VO-400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms

ПЦР в реальном времени (qPCR) является удивительно чувствительным и точным методом, который позволяет амплифицировать мельчайшие количества мишеней нуклеиновых кислот из множества образцов. Он широко используется во многих областях исследований и достиг промышленного применения в таких областях, как диагностика человека и выбор признаков в культурах генетически модифицированных организмов (ГМО). Однако qPCR не является методом защиты от ошибок. Смешивание всех реагентов в одну мастер-смесь, впоследствии распределенную по 96 скважинам обычной пластины qPCR, может привести к ошибкам оператора, таким как неправильное смешивание реагентов или неточное дозирование в скважины. Здесь представлен метод, называемый гелеобразованием, при котором большая часть воды, присутствующей в основной смеси, замещается реагентами, которые образуют золь-гелевую смесь при подаче в вакуум. В результате реагенты qPCR эффективно сохраняются в течение нескольких недель при комнатной температуре или нескольких месяцев при 2-8oC. Детали приготовления каждого растворапоказаны здесь вместе с ожидаемым аспектом гелеобразной реакции, предназначенной для обнаружения спутниковой ДНК T. cruzi (сатДНК). Аналогичная процедура может быть применена для обнаружения других организмов. Запуск гелеобразного запуска qPCR так же прост, как извлечение пластины из холодильника, добавление образцов в соответствующие колодцы и начало запуска, тем самым уменьшая время настройки реакции с полной пластиной до времени, необходимого для загрузки образцов. Кроме того, гелеобразные реакции ПЦР могут производиться и контролироваться на качество партиями, экономя время и избегая распространенных ошибок оператора при выполнении рутинных реакций ПЦР.

Три реагента, образующих гелеобразную смесь, легко солюбилизируются при сильном вихре. Тем не менее, гликоген требует тщательного вихря, чтобы гарантировать, что порошок был полностью солюбилизирован. К сожалению, сильное вихрь производит много пузырьков, что затрудняет определение ф?...

Watch this Scientific Journal Video about Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms at JoVE.com

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

В настоящей работе описываются этапы получения готовой к использованию qPCR для обнаружения ДНК T. cruzi , которая может быть предварительно загружена в реакционный сосуд и храниться в холодильнике в течение нескольких месяцев.

Готовая к использованию qPCR для обнаружения ДНК из Trypanosoma cruzi или других патогенных организмов

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

Протокол гелеобразования производит готовые к использованию реакции qPCR, которые уменьшают время и шаги, необходимые для начала запуска. Этот протокол позволяет производить и контролировать реакции qPCR для качества и больших количеств одновременно, уменьшая вероятность ошибки оператора во время расчетов рецептуры или аликвотирования в скважины. Этот метод может быть применен к любой qPCR, которая уже полностью оптимизирована в обычном замороженном формате.Визуальная демонстрация этого метода важна, потому что два основных этапа контроля качества являются визуальными. Чтобы приготовить раствор мелезитозы, взвесьте четыре грамма мелезитозы в пластиковой трубке объемом 15 миллилитров, добавьте шесть миллилитров воды, свободной от нуклеазы, и вихрь на максимальной скорости, пока порошок не будет солюбилизирован. Сделайте окончательный объем до 10 миллилитров водой без нуклеазы, затем нанесите метку и храните раствор при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение шести месяцев.Чтобы приготовить раствор трегалозы, взвесьте четыре грамма трегалозы в пластиковой трубке объемом 15 миллилитров, добавьте шесть миллилитров воды, свободной от нуклеазы, и вихрь на максимальной скорости, пока порошок не будет солюбилизирован. Затем восполните объем до 10 миллилитров водой без нуклеаз и процедите раствор через фильтр 0,2 микрона. Маркируйте и храните раствор при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение шести месяцев.Чтобы приготовить раствор гликогена, взвесьте два грамма гликогена в 15-миллилитровой трубке, добавьте шесть миллилитров воды, свободной от нуклеазы, и вихрь до тех пор, пока порошок не будет солюбилизирован. Держите раствор при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение восьми-12 часов, потому что солюбилизация гликогена производит много пузырьков. На следующий день, удалив раствор из инкубации, восполняют объем до 10 миллилитров безнуклеазной водой и хранят меченый раствор при двух-восьми градусах Цельсия до шести месяцев.Чтобы приготовить раствор лизина, взвесьте 7,5 миллиграммов лизина в 15-миллилитровой пробирке, добавьте шесть миллилитров воды без нуклеазы и вихрь до тех пор, пока порошок не будет солюбилизирован. Восполнить объем до 10 миллилитров водой без нуклеазы. Отфильтруйте раствор через 0,2-микронный фильтр и храните при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение шести месяцев.Для приготовления гелеобразующей смеси смешайте соответствующие объемы бульонных растворов в пластиковой тубе объемом 50 миллилитров. Смешайте реагенты, перевернув трубку 10 раз, и храните меченый раствор при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение трех месяцев. Чтобы приготовить мастер-микс qPCR для гелеобразования, разморозьте реагенты в рефрижераторном контейнере.Затем смешайте соответствующие объемы реагентов в трубке объемом 1,5 миллилитра, чтобы приготовить достаточное количество основной смеси для полосы из восьми трубок или пластины из 96 лунок. Далее пипетка 18,5 микролитров мастер-гелеобразования смешивается на каждую реакционную скважину и помещает трубки или пластину в теплопроводящую опору внутри вакуумной печи. Если вы используете 96 плит скважины, поместите один мешок бентонитовой глины в печь на каждые две 96 плит скважины для поглощения воды.Когда цикл завершен, проверьте трубки или пластины на правильное гелеобразование реагентов, убедившись, что объем заметно уменьшается примерно до пяти микролитров и жидкости не перемещаются при постукивании по трубкам или пластинам пальцами. Запечатайте и храните трубки или пластины при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение восьми-12 часов перед использованием. Чтобы использовать гелеобразную qPCR, извлеките полоску или пластину из холодильника и откройте ее на рабочем месте для обработки образцов.Добавьте 15 микролитров воды без нуклеазы и пять микролитров образца ДНК в каждый реакционный сосуд. Запечатайте трубки или пластины, проведите нужный эксперимент и выполните регулярный анализ данных. В настоящем протоколе температура внутри камеры поддерживается постоянной на уровне 30 градусов цельсия, в то время как давление колеблется от 910 до 930 миллибар и около вакуума.После вакуумного цикла мастер-микс внутри трубки уменьшается в объеме, становится гелеобразной на дне и не брызгает на стенки при постукивании трубок. Если гелеобразование неполное, жидкость разбрызгивается на стенки трубки, когда трубки постукиваются. Обнаружение ТРИПАНОСОМА КРУЗ-ДНК с использованием опубликованных олигонуклеотидных последовательностей показано здесь.Обнаружение того же образца, когда гелеобразование было выполнено неправильно, приводило к потере чувствительности. Наиболее важным этапом является расчет объема реагентов перед гелеобразованием. Оператор должен помнить о том, чтобы не добавлять воду, так как она будет удалена во время процесса.Если шаги протокола будут тщательно соблюдаться, операторы с базовыми лабораторными и молекулярными биологическими навыками не будут испытывать трудностей с выполнением процесса гелеобразования.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Обнаружение и визуализация ДНК-индуцированных белковых комплексов в суспензионных клеточных культурах с использованием анализа лигирования близости

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Определение активности фосфолипазы C в мозг огневки от пчелы

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Изоляции F1-АТФазы от паразитических протисты Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Подготовка хлоропласта суб отсеков от Arabidopsis для анализа белка локализации Immunoblotting или протеомики

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Изучение метаболизма шести системных инсектицидов в недавно созданной культуре подвески клеток, полученных из чая(Камелия Sinensis L.) Листья

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

Электрофорез ДНК, вместо тиазол оранжевый бромид Ethidium или альтернативных красители

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Распознавание последовательности ДНК с помощью высокопроходимых профилирований primase

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Непрерывный флуоресцентный анализ метилирования ДНК на основе эндонуклеазы для скрининга ингибиторов ДНК-метилтрансферазы

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Одномолекулярная визуализация конденсатов EWS-FLI1, собранных на ДНК

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

В пробирке Медикаментозный скрининг на всех стадиях жизненного цикла Trypanosoma cruzi с использованием паразитов, экспрессирующих β-галактозидазу

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...