Name: ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms
Uploaded: 2022-01-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms at JoVE.com

Yazarlar, vakumlu fırınla ilgili teknik yardım için Aline Burda Farias'a ve söz konusu ekipmana erişime izin verdikleri için Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brezilya) yönetimine şükranlarını sunmak isterler. Bu çalışma kısmen hibe CNPq 445954/2020-5 tarafından finanse edilmiştir.

1. Stok çözeltilerinin ve jelifikasyon karışımının hazırlanması
NOT: Dört stok çözeltisi hazırlanacak (400 mg/mL melezitoz, 400 mg/mL trehaloz, 0.75 mg/mL lizin ve 200 mg/mL glikojen) ve jelleşme karışımını üretmek için Tablo 1'de gösterilen orana göre karıştırılacaktır. Protokol 10 mL'lik stok çözümleri üretimini tanımlasa da, daha düşük veya daha yüksek hacimler için uyarlanabilir.
<ol><li>Melezitoz çözeltisi<ol><li>...

<ol>
	<li>Lewinsohn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carlos+Chagas+(1879-1934):+the+discovery+of+Trypanosoma+cruzi+and+of+American+trypanosomiasis+(foot-notes+to+the+history+of+Chagas's+disease).">Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease).</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).</li><li>Bern, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+Chagas+disease+in+the+United+States:+A+systematic+review.">Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review.</a> The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).</li><li>Pereira, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease+as+a+foodborne+illness.">Chagas' disease as a foodborne illness.</a> Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).</li><li>Tanowitz, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas'+disease.">Chagas' disease.</a> Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).</li><li>Rassi, A., Marin-Neto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+validation+of+quantitative+real-time+PCR+methods+for+quantification+of+trypanosoma+cruzi+DNA+in+blood+samples+from+chagas+disease+patients.">Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).</li><li>Rivero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Trypanosoma+cruzi+by+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+potential+novel+tool+for+the+detection+of+congenital+Chagas+infection.">Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).</li><li>Schijman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnosis+of+Trypanosoma+cruzi.">Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi.</a> Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).</li><li>Besuschio, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+cruzi+loop-mediated+isothermal+amplification+(Trypanosoma+cruzi+Loopamp)+kit+for+detection+of+congenital,+acute+and+Chagas+disease+reactivation.">Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).</li><li>Duffy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+real-time+PCR+strategy+for+monitoring+bloodstream+parasitic+loads+in+chagas+disease+patients.">Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).</li><li>Melo, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+real+time+PCR+to+quantify+parasite+load+in+serum+samples+from+chronic+Chagas+disease+patients.">Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients.</a> Parasites &amp; Vectors. 8 (1), 154 (2015).</li><li>Parrado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+serial+blood+sampling+and+PCR+replicates+for+treatment+monitoring+of+patients+with+chronic+Chagas+disease.">Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).</li><li>de Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ready-to-use+duplex+qPCR+to+detect+Leishmania+infantum+DNA+in+naturally+infected+dogs.">A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs.</a> Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).</li><li>Rampazzo, R. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+concept+for+a+portable+platform+for+molecular+diagnosis+of+tropical+diseases.">Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).</li><li>Costa, A. D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready-to-use+qPCR+for+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+or+Trypanosoma+cruzi+in+food+matrices.">Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices.</a> Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-storage+of+gelified+reagents+in+a+lab-on-a-foil+system+for+rapid+nucleic+acid+analysis.">Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis.</a> Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).</li><li>Kamau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample-ready+multiplex+qPCR+assay+for+detection+of+malaria.">Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria.</a> Malaria Journal. 13, 158 (2014).</li><li>Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+further+challenges+in+lyophilization.">Recent advances and further challenges in lyophilization.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).</li><li>Rosado, P. M. F. S., L&#243;pez, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+preparing+stabilised+reaction+mixtures,+which+are+totally+or+partially+dried,+comprising+at+least+one+enzyme,+reaction+mixtures+and+kits+containing+said+mixtures.">Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures.</a> PubChem. , (2002).</li><li>Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+fast+and+easy+sample-to-answer+protocol+for+tuberculosis+screening+in+point-of-care+settings:+A+proof+of+concept+study.">Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study.</a> PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).</li><li>Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+improved+U.S.+food+and+drug+administration+method+for+the+detection+of+Cyclospora+cayetanensis+in+produce+using+real-time+PCR.">Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR.</a> Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).</li><li>Iglesias, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+new+gelled+nested+PCR+test+for+the+diagnosis+of+imported+malaria:+comparison+with+microscopy,+rapid+diagnostic+test,+and+real-time+PCR.">Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR.</a> Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).</li><li>Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnostics+for+Chagas+disease:+up+to+date+and+novel+methodologies.">Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).</li></ol>

Son yıllarda, tropikal ve ihmal edilmiş hastalıkların teşhisine yardımcı olmak için daha hassas ve spesifik teknolojiler bulma ihtiyacı vurgulanmıştır. Epidemiyolojik kontrol için önemli olmakla birlikte, parazitolojik (optik mikroskopi) ve serolojik testlerin özellikle duyarlılık ve bakım noktası uygulanabilirliği açısından sınırlamaları vardır. PCR, izotermal amplifikasyon ve ilgili varyasyonlar gibi DNA amplifikasyon teknikleri laboratuvar ortamlarında uzun zamandır kullanılmaktadır, anc...

Chagas hastalığı, 20. yüzyılın başlarında, yoksulluğun yaygın olduğu Brezilya'nın kırsal bölgelerinde keşfedildi 1,2. Bugün bile, hastalık Amerika'da sağlığın sosyal ve ekonomik belirleyicilerine bağlı olmaya devam etmektedir. Chagas hastalığı bifaziktir, akut ve kronik bir fazdan oluşur. Trypanosoma cruzi parazitinin enfeksiyonundan kaynaklanır, böcek vektörleri tarafından bulaşır, konjenital yolla kan transfüzyonu veya kontamine gıdaların oral alımı 3,4.
Chagas hastalığının teşhisi, klinik semptomların (özellikle Romaña belirtisi), kan yayma mikroskobu, seroloji ve gerçek zamanlı PCR (qPCR) veya izotermal amplifikasyon 4,5,6,7,8,9 gibi moleküler testlerin gözlemlenmesiyle yapılabilir. Klinik semptomlar ve kan yayma mikroskobu şüpheli akut enfeksiyon vakalarında kullanılırken, asemptomatik hastalarda antikor arayışı tarama aracı olarak kullanılmaktadır. Duyarlılığı ve özgüllüğü nedeniyle, qPCR'nin kronik hastalar için bir izleme aracı olarak, kandaki parazit yükünü ölçen tedavi gören akut hastalar için ve terapötik başarısızlığın vekil bir belirteci olarak kullanılması önerilmiştir 6,8,10,11,12 . Şu anda mevcut testlerden daha hassas ve spesifik olmasına rağmen, qPCR'nin nakliye ve depolama için donma sıcaklıklarının gerekliliği nedeniyle dünya çapında imtiyazsız bölgelerde tanılama araçları olarak bilinmesi etkili bir şekilde engellenmiştir13,14,15.
Bu engeli aşmak için, liyofilizasyon ve jelleştirme gibi koruma teknikleri araştırılmıştır16,17. Liyofilizasyon yıllarca koruma sağlarken, enzim stabilizasyonu / konservasyonu için yaygın olarak kullanılan gliserol varlığı olmadan özel olarak yapılmış reaktifler gerektirir18. Jelleşmenin aylarca koruma sağladığı gösterilmiş olsa da, düzenli reaktiflerin kullanılmasına izin verir19. Jelifikasyon çözeltisi, her biri proseste belirli rollere sahip dört bileşenden oluşur: şekerler trehaloz ve melozitoz, çözeltideki serbest su moleküllerini azaltarak kuruma işlemi sırasında biyomolekülleri korur, glikojen daha geniş bir koruyucu matris üretir ve amino asit lizini, biyomolekülün karboksili arasındaki oksitleyici reaksiyonları inhibe etmek için serbest radikal temizleyici olarak kullanılır, amino ve fosfat grupları. Bu bileşenler, kuruma işlemi sırasında üçüncül veya kuaterner yapının kaybını önleyen bir sol-jel karışımı tanımlar, böylece biyomoleküllerin rehidrasyon üzerine aktivitesini korumaya yardımcı olur19. Reaksiyon tüplerinin içinde stabilize edildikten sonra, reaksiyonlar normal -20 ° C yerine 2-8 ° C'de birkaç ay veya 21-23 ° C'de birkaç hafta saklanabilir. Bu yaklaşım, Chagas hastalığı, sıtma, leishmaniasis, tüberküloz ve siklosporiyazis13,14,15,20 gibi hastalıkların teşhisine yardımcı olmak için tasarlanmış testlere dahil edilmiştir.
Bu çalışma, jelleştirme prosedürü için gerekli çözümleri hazırlamak için tüm adımları, süreçteki tuzakları ve sekiz tüplü şeritler içinde kullanıma hazır jelleştirilmiş bir qPCR'nin beklenen son yönünü açıklamaktadır. Aynı protokol tek tüpler veya 96 delikli plakalar için uyarlanabilir. Son olarak, T. cruzi DNA'sının tespiti bir kontrol çalışması olarak gösterilecektir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bentonite clay bags (activated)</td>
			<td>Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain)</td>
			<td>026157/STD</td>
			<td>Not to be confused with silica gel packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td>Cat# US16445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>Cat# 365650250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melezitoze</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 63620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR mastermix</td>
			<td>preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paran&#225; (IBMP, Curitiba, Brazil)</td>
			<td>Chagas NAT kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>preferred vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software for vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>Celsius v10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypanosoma cruzi DNA</td>
			<td>from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>Memmert Gmbh</td>
			<td>VO-400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ready-to-use qpcr for detection of dna from trypanosoma cruzi or other pathogenic organisms

Gerçek zamanlı PCR (qPCR), çok sayıda numuneden nükleik asit hedeflerinin dakika miktarlarını yükseltmeye olanak tanıyan son derece hassas ve hassas bir tekniktir. Birçok araştırma alanında yaygın olarak kullanılmış ve genetiği değiştirilmiş organizmaların (GDO) mahsullerinin mahsullerinde insan teşhisi ve özellik seçimi gibi alanlarda endüstriyel uygulama sağlamıştır. Ancak, qPCR hatasız bir teknik değildir. Tüm reaktiflerin daha sonra normal bir qPCR plakasının 96 kuyucuğuna dağıtılan tek bir ana karışımda karıştırılması, reaktiflerin yanlış karıştırılması veya kuyucuklara yanlış dağıtılması gibi operatör hatalarına yol açabilir. Burada, jelleştirme adı verilen bir teknik sunulmaktadır, bu sayede ana karışımda bulunan suyun çoğu, bir vakuma gönderildiğinde bir sol-jel karışımı oluşturan reaktiflerle ikame edilir. Sonuç olarak, qPCR reaktifleri oda sıcaklığında birkaç hafta veya 2-8 oC'de birkaç ay boyunca etkili bir şekilde korunur Her bir çözeltinin hazırlanmasının ayrıntıları, T. cruzi uydu DNA'sını (satDNA) tespit etmek için tasarlanmış jelleştirilmiş bir reaksiyonun beklenen yönüyle birlikte burada gösterilmiştir. Diğer organizmaları tespit etmek için benzer bir prosedür uygulanabilir. Jelleştirilmiş bir qPCR çalıştırması başlatmak, plakayı buzdolabından çıkarmak, numuneleri kendi kuyularına eklemek ve çalıştırmayı başlatmak kadar basittir, böylece tam plaka reaksiyonunun kurulum süresini, numuneleri yüklemek için gereken süreye düşürür. Ek olarak, jelize PCR reaksiyonları partiler halinde kalite için üretilebilir ve kontrol edilebilir, böylece zamandan tasarruf edilir ve rutin PCR reaksiyonları çalıştırılırken yaygın operatör hatalarından kaçınılabilir.

Jelleşme karışımını oluşturan reaktiflerden üçü, kuvvetli vorteks üzerinde kolayca çözünür. Bununla birlikte, glikojen tozun tamamen çözündüğünden emin olmak için dikkatli bir vorteks gerektirir. Ne yazık ki, güçlü vorteks, çözeltinin gerçek hacmini belirlemeyi zorlaştıran çok sayıda kabarcık üretir (Şekil 1A-B). Bu nedenle, glikojen çözeltisinin, kabarcıkların içinde sıkışmış çözeltinin çoğu ana çözelti g?...

Watch this Scientific Journal Video about Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms at JoVE.com

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Bu çalışma, reaksiyon kabına önceden yüklenebilen ve birkaç ay boyunca buzdolabında saklanabilen T. cruzi DNA tespiti için kullanıma hazır qPCR üretme adımlarını açıklamaktadır.

Trypanosoma cruzi veya Diğer Patojenik Organizmalardan DNA Tespiti için Kullanıma Hazır qPCR

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

Jelleştirme protokolü, bir çalıştırmayı başlatmak için gereken süreyi ve adımları azaltan kullanıma hazır qPCR reaksiyonları üretir. Bu protokol, qPCR reaksiyonlarının aynı anda kalite ve büyük miktarlarda üretilmesini ve kontrol edilmesini sağlayarak reçete hesaplamaları sırasında operatör hatası olasılığını azaltır veya kuyulara. Bu yöntem, geleneksel dondurulmuş formatta zaten tamamen optimize edilmiş herhangi bir qPCR'ye uygulanabilir.Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir, çünkü ana kalite kontrol adımlarından ikisi görseldir. Melezitoz çözeltisini hazırlamak için, 15 mililitrelik plastik bir tüpte dört gram melezitozu tartın, altı mililitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve toz çözünene kadar maksimum hızda vorteks yapın. Son hacmi nükleaz içermeyen suyla 10 mililitreye çıkarın, ardından çözeltiyi altı aya kadar iki ila sekiz santigrat derecede etiketleyin ve saklayın.Trehaloz çözeltisini hazırlamak için, 15 mililitrelik plastik bir tüpte dört gram trehaloz tartın, toz çözünene kadar maksimum hızda altı mililitre nükleaz içermeyen su ve vorteks ekleyin. Daha sonra nükleaz içermeyen su ile hacmi 10 mililitreye kadar yükseltin ve çözeltiyi 0.2 mikronluk bir filtreden süzün. Çözeltiyi altı aya kadar iki ila sekiz santigrat derecede etiketleyin ve saklayın.Glikojen çözeltisini hazırlamak için, 15 mililitrelik bir tüpte iki gram glikojen tartın, altı mililitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve toz çözünene kadar vorteks yapın. Çözeltiyi sekiz ila 12 saat boyunca iki ila sekiz santigrat derecede tutun, çünkü glikojen çözünmesi çok sayıda kabarcık üretir. Ertesi gün, çözeltiyi inkübasyondan çıkararak, nükleaz içermeyen su ile hacmi 10 mililitreye kadar oluşturun ve etiketli çözeltiyi altı aya kadar iki ila sekiz santigrat derecede saklayın.Lizin çözeltisini hazırlamak için, 15 mililitrelik bir tüpte 7.5 miligram lizin tartın, altı mililitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve toz çözünene kadar vorteks yapın. Nükleaz içermeyen su ile hacmi 10 mililitreye kadar yapın. Çözeltiyi 0,2 mikronluk bir filtreden süzün ve altı aya kadar iki ila sekiz santigrat derecede saklayın.Jelifikasyon karışımını hazırlamak için, uygun hacimlerde stok çözeltilerini 50 mililitrelik bir plastik tüp içinde karıştırın. Tüpü 10 kez ters çevirerek reaktifleri karıştırın ve etiketli çözeltiyi üç aya kadar iki ila sekiz santigrat derecede saklayın. qPCR ana karışımını jelifikasyona hazırlamak için, reaktifleri soğutulmuş bir kapta çözün.Daha sonra, sekiz tüp şeridi veya 96 kuyucuklu bir plaka için yeterli ana karışım hazırlamak için reaktiflerin uygun hacimlerini 1,5 mililitrelik bir tüpte karıştırın. Bir sonraki pipet 18.5 mikrolitre jelifikasyon ana her reaksiyon kuyusuna karışır ve tüpleri veya plakayı vakum fırınının içindeki ısı iletken desteğine yerleştirin. 96 kuyucuk plakası kullanıyorsanız, su emilimi için her iki 96 kuyu plakası için fırına bir bentonit kil torbası yerleştirin.Döngü tamamlandığında, hacmin gözle görülür şekilde yaklaşık beş mikrolitreye düşürülmesini ve sıvıların tüplere veya plakalara parmaklarla dokunulduğunda hareket etmemesini sağlayarak tüplerin veya plakaların uygun jelifikasyonu için tüpleri veya plakaları kontrol edin. Tüpleri veya plakaları kullanımdan önce sekiz ila 12 saat boyunca iki ila sekiz santigrat derecede kapatın ve saklayın. Jelleştirilmiş qPCR'yi kullanmak için, tüp şeridini veya plakasını buzdolabından çıkarın ve numune manipülasyonu için bir iş istasyonunda açın.Her reaksiyon kabına 15 mikrolitre nükleaz içermeyen su ve beş mikrolitre DNA örneği ekleyin. Tüpleri veya plakaları kapatın, istediğiniz deneyi çalıştırın ve düzenli veri analizi yapın. Mevcut protokolde, odanın içindeki sıcaklık 30 santigrat derecede sabit tutulurken, basınç 910 ila 930 milibar arasında ve vakuma yakın arasında değişmektedir.Vakum döngüsünden sonra, tüpün içindeki ana karışım hacim olarak azalır, altta jelleşir ve tüplere dokunulduğunda duvarlara sıçramaz. Jelleşme eksikse, tüplere dokunulduğunda sıvı tüp duvarlarına sıçrar. Yayınlanmış oligonükleotid dizileri kullanılarak yapılan tripanosoma cruzi-DNA tespiti burada gösterilmiştir.Jelifikasyon doğru şekilde gerçekleştirilmediğinde aynı numunenin algılanması, hassasiyet kaybına neden oldu. En kritik adım, jelifikasyondan önce reaktif hacminin hesaplanmasıdır. Operatör, işlem sırasında çıkarılacağı için su eklememeyi hatırlamalıdır.Protokol adımları yakından takip edilirse, temel laboratuvar ve moleküler biyoloji becerilerine sahip operatörler jelleştirme işlemini gerçekleştirirken zorluk çekmeyecektir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Balarısı üzerinden beyin Homogenate Fosfolifaz C aktivite tespiti

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Yalıtım F1-ATPaz paraziter Protist Trypanosoma brucei üzerinden

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Kloroplast alt bölmeler Arabidopsis üzerinden hazırlanması Protein yerelleştirme Immunoblotting veya proteomik analizi için

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Çay (Camellia sinensis L.) türetilmiştir yeni kurulan hücre süspansiyon kültürü altı sistemik Böcek Ilacı metabolizması üzerinde çalışma Yaprak -ları

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA Elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Dna İlkase tarafından DNA Dizisi Tanıma Yüksek-Throughput Primase Profilleme kullanarak

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

İn Vitro β-galaktosidaz İfade Eden Parazitleri Kullanarak Trypanosoma cruzi'nin Tüm Yaşam Döngüsü Aşamalarına Karşı İlaç Taraması

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...