Name: multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in callinectes sapidus
Uploaded: 2022-05-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (CHE-1710140 ו- CHE-2108223) ומכוני הבריאות הלאומיים (NIH) באמצעות מענק R01DK071801. A.P. נתמך בחלקו על ידי מענק ההדרכה לממשק כימיה-ביולוגיה של NIH (T32 GM008505). N.V.Q. נתמך בחלקו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, תחת פרס שירות המחקר הלאומי של רות ל. קירששטיין מהמכון הלאומי לריאות ודם ללב למרכז לחקר הלב וכלי הדם של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון (T32 HL007936). L.L. רוצה להכיר במענקי NIH R56 MH110215, S10RR029531 ו- S10OD025084, כמו גם תמיכה במימון של פרופסורה להישגים מצטיינים של וילאס ופרופסור צ'ארלס מלבורן ג'ונסון במימון הקרן לחקר בוגרי ויסקונסין ובית הספר לרוקחות של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון.

כל דגימת הרקמות שתוארה בוצעה בהתאם להנחיות של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון.
1. ניתוח LC-ESI-MS של נוירופפטידים
<ol><li>מיצוי והתפלה של נוירופפטידים<ol>
<li>לפני רכישת רקמות, הכינו מתנול חומצי (acMeOH) (90:9:1 MeOH:water:acetic acid) כמתוארב-16.</li>
		<li>אספו רקמת מוח מהסרטנים<sup class="xref...

<ol>
	<li>H&#246;kfelt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptides+-+an+overview.">Neuropeptides - an overview.</a> Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).</li><li>Radhakrishnan, V., Henry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+of+neuropeptides+in+the+sensory+spinal+cord.">Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord.</a> Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).</li><li>N&#228;ssel, D. R., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+neuropeptides+by+immunocytochemistry.">Detection of neuropeptides by immunocytochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 72, 71-101 (1997).</li><li>Martins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Neuropeptide+Y+Receptors+Modulates+Retinal+Ganglion+Cell+Physiology+and+Exerts+Neuroprotective+Actions+In+Vitro.">Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro.</a> ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).</li><li>Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuropeptide+Y+and+its+metabolites+by+high-performance+liquid+chromatography-electrospray+ionization+mass+spectrometry+and+integrated+sample+clean-up+with+a+novel+restricted-access+sulphonic+acid+cation+exchanger.">Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger.</a> Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).</li><li>Salisbury, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+MALDI-TOF+mass+spectrometry+workflow+for+Drosophila+melanogaster+differential+neuropeptidomics.">A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics.</a> Molecular Brain. 6, 60 (2013).</li><li>Schmerberg, C. M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function-driven+discovery+of+neuropeptides+with+mass+spectrometry-based+tools.">Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools.</a> Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).</li><li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics:+Mass+Spectrometry-Based+Identification+and+Quantitation+of+Neuropeptides.">Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides.</a> Genomics &amp; Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).</li><li>Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+mass+spectrometry+for+the+quantitative+analysis+of+neuropeptides.">Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides.</a> Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).</li><li>Pratavieira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+Imaging+Analysis+of+Neuropeptides+in+Africanized+Honeybee+(+Apis+mellifera)+Brain:+Effect+of+Aggressiveness.">MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness.</a> Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).</li><li>Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Effective+Sample+Preparation+Strategy+for+MALDI-MS+Imaging+of+Neuropeptide+Changes+in+the+Crustacean+Brain+Due+to+Hypoxia+and+Hypercapnia+Stress.">A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).</li><li>Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics:+Improvements+in+Mass+Spectrometry+Imaging+Analysis+and+Recent+Advancements.">Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements.</a> Current Protein &amp; Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).</li><li>Li, L., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptides+in+the+brain:+mass+spectrometry-based+measurement+approaches+and+challenges.">Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Precipitation+and+Delipidation+Enables+Efficient+Enrichment+of+Low-Molecular+Weight+Proteins+and+Peptides+from+Human+Plasma.">Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma.</a> Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAKS+DB:+de+novo+sequencing+assisted+database+search+for+sensitive+and+accurate+peptide+identification.">PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).</li><li>Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+evaluation+of+neuropeptidomic+profiles+upon+heat+stabilization+treatment+of+neuroendocrine+tissues+in+crustaceans.">Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans.</a> Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).</li><li>Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+borealis+stomatogastric+nervous+system+dissection.">Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).</li><li>DeLaney, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRESnovo:+Prescreening+Prior+to+de+novo+Sequencing+to+Improve+Accuracy+and+Sensitivity+of+Neuropeptide+Identification.">PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).</li><li>Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+neuropeptide+modulation+of+premotor+and+motor+neurons+in+the+lobster+cardiac+ganglion.">Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion.</a> Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+in+silico+transcriptome+mining+and+biological+mass+spectrometry+for+neuropeptide+discovery+in+the+Pacific+white+shrimp+Litopenaeus+vannamei.">Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei.</a> Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).</li><li>Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacean+neuropeptides.">Crustacean neuropeptides.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).</li><li>DeLaney, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques,+applications+and+perspectives+in+neuropeptide+research.">New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>Habenstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic,+peptidomic,+and+mass+spectrometry+imaging+analysis+of+the+brain+in+the+ant+Cataglyphis+nodus.">Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus.</a> Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).</li><li>Maes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+sensitivity+of+the+nano+ultra-high+performance+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometric+analysis+of+low-concentrated+neuropeptides+by+reducing+aspecific+adsorption+and+optimizing+the+injection+solvent.">Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent.</a> Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+photochemically+promoted+click+chemistry+for+enhanced+neuropeptide+visualization+and+rapid+protein+labeling.">Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling.</a> Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).</li><li>Corbi&#232;re, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+Identification+of+Bioactive+Neuropeptides+in+Vertebrates.">Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).</li><li>Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+neuropeptides+in+crustacean+hemolymph+via+MALDI+mass+spectrometry.">Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry.</a> Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).</li><li>Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andr&#233;n, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Tissue+Sample+Stabilization+and+Extraction+Strategies+for+Neuropeptidomics.">Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics.</a> Peptidomics: Methods and Strategies. , 41-49 (2018).</li><li>Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Imaging:+A+Review+of+Emerging+Advancements+and+Future+Insights.">Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights.</a> Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).</li><li>Phetsanthad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mass+spectrometry+analysis+of+neuropeptides.">Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides.</a> Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).</li><li>P&#233;rez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSroi:+A+pre-processing+tool+for+mass+spectrometry-based+studies.">MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).</li><li>Christie, A. E., Chi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+the+neuropeptidomes+of+members+of+the+Astacidea+(Crustacea,+Decapoda)+using+publicly+accessible+transcriptome+shotgun+assembly+(TSA)+sequence+data.">Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data.</a> General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).</li><li>Livnat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+d-Amino+Acid-Containing+Neuropeptide+Discovery+Funnel.">A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel.</a> Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).</li><li>Lehrer, R. I., Ganz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensins:+endogenous+antibiotic+peptides+from+human+leukocytes.">Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes.</a> Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).</li></ol>

הזיהוי המדויק, הכימות והלוקליזציה של נוירופפטידים ופפטידים אנדוגניים שנמצאים במערכת העצבים חיוניים להבנת תפקודם23,24. ספקטרומטריית מסות היא טכניקה רבת עוצמה שיכולה לאפשר לכל זה להתבצע, אפילו באורגניזמים ללא גנום בעל רצף מלא. מדגימה היכולת של פרוטוקול זה לז?...

מערכת העצבים מורכבת ודורשת רשת של נוירונים כדי להעביר אותות ברחבי האורגניזם. מערכת העצבים מתאמת מידע חושי ותגובה ביולוגית. האינטראקציות המורכבות והמפותלות המעורבות בהעברת אותות דורשות מולקולות איתות רבות ושונות כגון נוירוטרנסמיטורים, סטרואידים ונוירופפטידים. מכיוון שנוירופפטידים הם מולקולות האיתות המגוונות והחזקות ביותר הממלאות תפקידי מפתח בהפעלת תגובות פיזיולוגיות ללחץ ולגירויים אחרים, מעניין לקבוע את תפקידם הספציפי בתהליכים פיזיולוגיים אלה. תפקוד הנוירופפטידים קשור למבנה חומצות האמינו שלהם, הקובע את הניידות, האינטראקציה עם הקולטנים וזיקה1. טכניקות כגון היסטוכימיה, שהיא חשובה משום שניתן לסנתז, לאחסן ולשחרר נוירופפטידים באזורים שונים של הרקמה, ואלקטרופיזיולוגיה שימשה כדי לחקור את המבנה והתפקוד של הנוירופפטידים 2,3,4, אך שיטות אלה מוגבלות על ידי תפוקה וספציפיות כדי לפתור את מגוון הרצף העצום של הנוירופפטידים.
ספקטרומטריית מסות (MS) מאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה של מבנה נוירופפטידים ושפע. ניתן לבצע זאת באמצעות טכניקות שונות של טרשת נפוצה, בדרך כלל כרומטוגרפיה נוזלית-יינון אלקטרוספריי MS (LC-ESI-MS)5 ו-MS ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI-MS)6. באמצעות מדידות מסה ברמת דיוק גבוהה ופיצול טרשת נפוצה, טרשת נפוצה מספקת את היכולת להקצות רצף חומצות אמינו ומצב של שינוי לאחר התרגום (PTM) לנוירופפטידים מתערובות מורכבות ללא ידע א-פריורי כדי לסייע באיתור תפקודם 7,8. בנוסף למידע איכותני, טרשת נפוצה מאפשרת מידע כמותי של נוירופפטידים באמצעות כמות ללא תוויות (LFQ) או שיטות מבוססות תווית כגון תיוג איזוטופי או איזוברי9. היתרונות העיקריים של LFQ כוללים את הפשטות שלו, עלות נמוכה של ניתוח, וירידה בשלבי הכנת הדגימה שיכולים למזער את אובדן הדגימה. עם זאת, החסרונות של LFQ כוללים עלויות זמן מכשיר מוגברות מכיוון שהוא דורש שכפולים טכניים מרובים כדי לטפל בשגיאות כמותיות מהשונות בריצה לריצה. זה גם מוביל לירידה ביכולת לכמת במדויק וריאציות קטנות. שיטות מבוססות תווית נתונות לשונות פחות שיטתית מכיוון שניתן לסמן דגימות מרובות באופן דיפרנציאלי באמצעות מגוון איזוטופים יציבים, לשלב אותן בדגימה אחת ולנתח אותן באמצעות ספקטרומטריית מסות בו זמנית. זה גם מגדיל את התפוקה, אם כי תוויות איזוטופיות יכולות לגזול זמן רב ויקר לסנתז או לרכוש. המורכבות הספקטרלית של ספקטרום מסת סריקה מלאה (MS1) עולה גם היא ככל שהריבוב עולה, מה שמקטין את מספר הנוירופפטידים הייחודיים המסוגלים להיות מפוצלים ולכן, מזוהים. לעומת זאת, תיוג איזוברי אינו מגביר את המורכבות הספקטרלית ברמת MS1, אם כי הוא מציב אתגרים לאנליטים בעלי שפע נמוך כגון נוירופפטידים. מכיוון שהכמות האיזוברית מתבצעת ברמת ספקטרום מסת יון השבר (MS2), ייתכן שלא ניתן יהיה לכמת נוירופפטידים בעלי שפע נמוך מכיוון שניתן לבחור רכיבי מטריצה שופעים יותר לפיצול וייתכן שלמי שנבחר אין שפע גבוה מספיק כדי לכמת אותם. עם תיוג איזוטופי, ניתן לבצע כמות על כל פפטיד מזוהה.
בנוסף לזיהוי וכימות, ניתן לקבל מידע לוקליזציה על ידי MS באמצעות הדמיית MALDI-MS (MALDI-MSI)10. על-ידי רסטר לייזר על פני משטח דגימה, ניתן לקמפל ספקטרה של MS לתמונת מפת חום עבור כל ערך m/z . מיפוי עוצמת האותות הנוירופפטידיים הארעיים באזורים שונים על פני מצבים שונים יכול לספק מידע רב ערך לקביעת תפקוד11. לוקליזציה של נוירופפטידים חשובה במיוחד מכיוון שתפקוד הנוירופפטידים עשוי להשתנות בהתאם למיקום12.
נוירופפטידים נמצאים בשפע נמוך יותר in vivo מאשר מולקולות איתות אחרות, כגון מוליכים עצביים, ולכן דורשים שיטות רגישות לגילוי13. ניתן להשיג זאת באמצעות הסרת רכיבי מטריצת שפע גבוהים יותר, כגון שומנים11,14. שיקולים נוספים לניתוח נוירופפטידים צריכים להיעשות בהשוואה לתהליכי עבודה נפוצים של פרוטאומיקה, בעיקר משום שרוב הניתוחים הנוירו-פפטידומיים משמיטים עיכול אנזימטי. זה מגביל את אפשרויות התוכנה לניתוח נתונים של נוירופפטידים מכיוון שרובם נבנו עם אלגוריתמים המבוססים על נתוני פרוטאומיקה והתאמות חלבונים המבוססות על זיהוי פפטידים. עם זאת, תוכנות רבות כגון PEAKS15 מתאימות יותר לניתוח נוירופפטידים בשל יכולות ריצוף דה נובו שלהן. יש לקחת בחשבון מספר גורמים לניתוח נוירופפטידים החל משיטת החילוץ ועד לניתוח נתוני טרשת נפוצה.
הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים שיטות להכנת דגימות ותיוג איזוטופי של דימתיל, איסוף נתונים וניתוח נתונים של נוירופפטידים על ידי LC-ESI-MS, MALDI-MS ו-MALDI-MSI. באמצעות תוצאות מייצגות ממספר ניסויים, מדגימים את התועלת והיכולת של שיטות אלה לזהות, לכמת ולמקם נוירופפטידים מסרטנים כחולים, Callinectes sapidus. כדי להבין טוב יותר את מערכת העצבים, מערכות מודל משמשות בדרך כלל. לאורגניזמים רבים אין גנום ברצף מלא זמין, מה שמונע גילוי נוירופפטידי מקיף ברמת הפפטיד. על מנת למתן את האתגר הזה, נכלל פרוטוקול לזיהוי נוירופפטידים חדשים וכריית תעתיקים ליצירת מסדי נתונים עבור אורגניזמים ללא מידע גנומי מלא. כל הפרוטוקולים המוצגים כאן יכולים להיות מותאמים לדגימות נוירופפטידים מכל מין, כמו גם ליישם לניתוח של כל פפטידים אנדוגניים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Reagents, and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>39319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borane pyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker peptide calibration mix</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary</td>
			<td>Polymicro</td>
			<td>1068150019</td>
			<td>to make nanoflow column (75 &#181;m inner diameter x 360 &#181;m outer diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat cup</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6032</td>
			<td>any cup or mold should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde - D2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>492620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214340</td>
			<td>place in 37 &#176;C water bath to melt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>15553953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies</td>
			<td>CB-90IN-S107</td>
			<td>25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS vials</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TFMSCERT5000-30LVW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol Optima LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Hydrophobic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Indicator strips</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>109450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red phosphorus clusters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>343242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed phase C18 material</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002350</td>
			<td>manually packed into nanoflow column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wite-out pen</td>
			<td>BIC</td>
			<td>150810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Z720070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments and Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic matrix sprayer system- M5</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge - 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-401-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat- HM 550</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>956564A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant</td>
			<td>Drierite</td>
			<td>2088701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI stainless steel target plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>8280781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite XLS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td>200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapifleX MALDI-TOF/TOF</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac - SVC100</td>
			<td>Savant</td>
			<td>SVC-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td>2510R-MTH</td>
			<td>for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB120110</td>
			<td>FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump- Alcatel 2008 A</td>
			<td>Ideal Vacuum Products</td>
			<td>P10976</td>
			<td>ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37C) - Isotemp 110</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-460-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expasy</td>
			<td>https://web.expasy.org/translate/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexAnalysis</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexControl</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEAKS Studio</td>
			<td>Bioinformatics Solutions, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td>https://scils.de/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SignalP 5.0</td>
			<td>https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tBLASTn</td>
			<td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&#38;BLAST_ 
			PROGRAMS=tblastn&#38;PAGE_ 
			TYPE=BlastSearch&#38;SHOW_ 
			DEFAULTS=on&#38;LINK_LOC 
			=blasthome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in callinectes sapidus

נוירופפטידים מאותתים על מולקולות המווסתות כמעט את כל התהליכים הפיזיולוגיים וההתנהגותיים, כגון התפתחות, רבייה, צריכת מזון ותגובה לגורמי עקה חיצוניים. עם זאת, המנגנונים הביוכימיים וההשלמה המלאה של הנוירופפטידים והתפקידים התפקודיים שלהם עדיין אינם מובנים היטב. אפיון הפפטידים האנדוגניים האלה נפגע על ידי המגוון העצום בתוך סוג זה של מולקולות איתות. בנוסף, נוירופפטידים הם ביו-אקטיביים בריכוזים נמוכים פי 100 - פי 1000 מזה של נוירוטרנסמיטורים והם נוטים להתפרקות אנזימטית לאחר שחרור סינפטי. ספקטרומטריית מסות (MS) היא כלי אנליטי רגיש ביותר שיכול לזהות, לכמת ולמקם אנליטים ללא ידע א-פריורי מקיף. הוא מתאים היטב ליצירת פרופיל גלובלי של נוירופפטידים ולסיוע בגילוי של פפטידים חדשים. בשל השפע הנמוך והמגוון הכימי הגבוה של סוג זה של פפטידים, מספר שיטות להכנת דגימות, פרמטרים לרכישת טרשת נפוצה ואסטרטגיות ניתוח נתונים הותאמו מטכניקות פרוטאומיקה כדי לאפשר אפיון נוירופפטידי אופטימלי. כאן מתוארות שיטות לבידוד נוירופפטידים מרקמות ביולוגיות מורכבות לצורך אפיון רצף, כמות ולוקליזציה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית (LC)-MS וספיגת/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI)-MS. פרוטוקול להכנת מסד נתונים נוירופפטידי מהסרטן הכחול, Callinectes sapidus, אורגניזם ללא מידע גנומי מקיף, נכלל. ניתן להתאים זרימות עבודה אלה לחקר סוגים אחרים של פפטידים אנדוגניים במינים שונים באמצעות מגוון מכשירים.

זרימת העבודה להכנת דגימות ולניתוח טרשת נפוצה מתוארת באיור 1. לאחר כריתה של רקמה עצבית, הומוגניזציה, מיצוי והתפלה מבוצעים כדי לטהר דגימות נוירופפטידים. אם רוצים כימות מבוסס תווית איזוטופית, דגימות מסומנות ומתותפלות שוב. הדגימה המתקבלת מנותחת באמצעות LC-MS/MS לצורך זיהוי וכימו?...

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus at JoVE.com

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

אפיון ספקטרומטרי של מסה של נוירופפטידים מספק מידע על רצף, כמות ולוקליזציה. זרימת עבודה אופטימלית זו שימושית לא רק למחקרי נוירופפטידים, אלא גם לפפטידים אנדוגניים אחרים. הפרוטוקולים המובאים כאן מתארים הכנת דגימות, רכישת טרשת נפוצה, ניתוח טרשת נפוצה ויצירת מסדי נתונים של נוירופפטידים באמצעות LC-ESI-MS, איתור MALDI-MS והדמיית MALDI-MS.

חקירה ספקטרומטרית מסה רבת פנים של נוירופפטידים בקלינקטס ספידוס

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...

הניתוח של פפטידים אנדוגניים, שהם קטנים יותר מרוב החלבונים, אך גדולים יותר מפפטידים מעוכלים רבים, הוא תחום שנבדק. פרוטוקול זה מטפל ב- scap בתהליכי עבודה מבוססי ספקטרומטריית מסות. ספקטרומטריית מסה היא רגישה מאוד וניתן להשתמש בה כדי להתמקד בנוירופפטידים ספציפיים בעלי עניין או ללכוד ולזהות מגוון של נוירופפטידים בתוך דגימה.הכמות והלוקליזציה של ביטוי נוירופפטידי על ידי ספקטרומטריית מסה יכולה להוביל לפיתוח טיפולים פפטידיים ולגילוי סמנים ביולוגיים נוירופפטידיים למחלות שונות. כדי להתחיל את מיצוי הנוירופפטידים לאסוף רקמת מוח מן הסרטנים באמצעות מלקחיים מיד למקם רקמה אחת כל אחד בצינור 0.6 מיליליטר המכיל 20 microliters של מתנול חומצי. הוסף 150 מיקרוליטרים של מתנול חומצי לדגימה.הגדר את הזמן הכולל של המטופל סוניק ל-24 שניות, זמן הדופק לשמונה שניות. השהה את הזמן ל-15 שניות משרעת עד 50% על הומוגנייזר קולי והומוגניזציה של הדגימות על הקרח. צנטריפוגה הדגימה בארבע מעלות צלזיוס ב 20, 000 GS במשך 20 דקות.עם פיפטה העביר את הסופרנטנט לצינור וייבש אותו ברכז ואקום בערך 35 מעלות צלזיוס. עבור התפלה לשחזר את דגימת הרקמה המופקת ב 20 microliters של 0.1% חומצה פורמית. מערבולת את התמיסה וקוניקים באמבט מים בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.החל 0.5 מיקרוליטרים של דגימה על רצועת pH כדי לוודא שה- pH הוא פחות מארבעה. צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ו-20, 000 GS למשך 30 שניות. הכינו שטיפת שיווי משקל הרטבה בתמיסות אשליה.השג קצה התפלה של 10 מיקרוליטר עם שרף C18. מניחים את קצה ההתפלה על פיפטה של 20 מיקרוליטר המוגדרת ל-15 מיקרוליטרים. שאפו את הקצה שלוש פעמים עם תמיסת הרטבה ושלוש פעמים עם פתרון שיתוף פעולה שווה.לשאוף במדגם 10 פעמים ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים בתמיסת שטיפה להשליך כל שטיפה. אלוט על ידי שאיפה 10 פעמים בכל אחד מפתרונות האשליה לפי סדר הגדלת האצטוניטריל. מייבשים את הנוירופפטידים הנרמזים ברכז ואקום.שחזרו את הנוירופפטידים המותפלים המיובשים בחמישה מיקרוליטרים של 0.1% חומצה פורמית. מערבולת את התמיסה וצליל אותה באמבט מים בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. בקצרה צנטריפוגה ב 2000 GS. לצורך איתור נוירופפטידים ורקמות קרום, פיפטה של דגימה בעלת שלוש טיפות מיקרוליטר על סרט הידרופובי.פיפטה שלושה מיקרוליטרים של מטריצת DHB ישירות על טיפת הדגימה. מערבבים את הפתרונות על ידי צנרת למעלה ולמטה. פיפטה מיקרוליטר אחד של תערובת הדגימה והמטריקס לתוך באר של צלחת המטרה מפלדת אל-חלד MALDI והשתמשה בקצה הפיפטה כדי לפזר כל תערובת החוצה לשולי המדגם היטב.זהה מיקרוליטר אחד של תערובת קליבר ומטריצה של אחד לאחד לתוך באר ליד הדגימה. הכנס לוחית מטרה המכילה כתמי דגימה מיובשים למכשיר זמן הטיסה של MALDI. עם מטריצת DHB להגדיר כוח לייזר ל 95% בחר רווח גלאי אופטימלי אוטומטי ומצב תנועה חכם של ספק דגימה מלאה.רכשו את MS Spectra בטווח של 200 עד 3, 200 M מעל Z והוסיפו ספקטרום מרובה מכל נקודה יחד כדי להגדיל את יחס האות הנוירופפטיד לרעש. ממלאים חצי קריוסטאט בג'לטין ומאפשרים לה להתמצק בטמפרטורת החדר. שמרו על שאריות ג'לטין נוזלי חם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.אספו את הרקמה העצבית הרצויה מבעל החיים והשתמשו במלקחיים כדי לטבול את הרקמה באופן מיידי בצינור 0.6 מיליליטר המכיל מים שעברו דה-יוניזציה למשך שנייה אחת. מניחים את הרקמה על גבי הג'לטין המוצק וממלאים את שארית הקריוסטט בג'לטין נוזלי. השתמש במלקחיים כדי למקם את הרקמה.מניחים את הקריוסטט על משטח שטוח ומקפיאים בקרח יבש. להכנת חתך הפרד את הדגימה המשובצת בג'לטין מתבנית הקריוסטט על ידי חיתוך התבנית. הרכיבו את הרקמה המוטבעת על צ'אק קריוסטאט על ידי צנרת טיפת מיליליטר אחת של מים שעברו דה-יוניזציה על הצ'אק ומיד לחיצה על הרקמה המוטבעת על הטיפה.לאחר הפיפטה הקפואה, יותר מים מתפרקים סביב הרקמה כדי להדק אותה עוד יותר לצ'אק. חתכו את הרקמה בעובי משוער של תא אחד. אגודל מרכיב כל מקטע על מגלשת זכוכית מצופה תחמוצת בדיל אינדיום על ידי הצבת צד אחד של המגלשה ליד החלקה והנחת אצבע בצד השני של המגלשה כדי לחמם באיטיות את הזכוכית ולאפשר לקטע להידבק למגלשה.ייצוא דה נובו רק פפטידים. CSV משיא עם ציון ביטחון מקומי ממוצע של גדול או שווה ל-75. חפש ברשימת הפפטידים מוטיבים ידועים של רצף המעידים על נוירופפטידים השייכים למשפחות נוירופפטידים ספציפיות.בחר רצף ידוע של חומצות אמינו הורמון טרום-פרו של עניין והשתמש בשחפת פיצוץ N כדי לחפש שאילתת רצף הורמונים טרום-פרו כנגד מסד נתונים. בחר את אורגניזם היעד ושנה מצפה שפרמטרים של אלגוריתם סף ל- 1000 יכללו יישורים בעלי ניקוד נמוך. הפעל את תוכנית blast ולאחר מכן בדוק את התוצאות עבור ציוני הומולוגיה גבוהים בין רצפי שאילתה ונושאים היוצרים יישורים משמעותיים.שמור את קובץ FASTA המכיל רצף נוקלאוטידים. תרגם את רצף הנוקלאוטידים של הורמון טרום-פרו לרצפי פפטידים של הורמון טרום-פרו באמצעות כלי התרגום של Expasy. עבור callinectes sapidus בחר מיטוכונדריאלי חסר חוליות עבור קוד גנטי והפעל את הכלי.בדוק אם יש רצף פפטידי אות ואתרי ביקוע פרו-הורמון ברצפי הפפטידים באמצעות האות P.זהו ספקטרום פיצול של נוירופפטיד המזוהה עם כיסוי רצף של 100% בשגיאת מסת שבר נמוכה עם גבול מקסימלי של 0.02 דלטון. הנה ספקטרום של נוירופפטיד המזוהה גם עם כיסוי רצף של 100%, אך עם מספר נמוך של יוני שבר, ולכן הביטחון של הזיהוי נמוך. אלה הם כרומטוגרמות היונים המופקות עבור נוירופפטיד יחיד שזוהה בשתי ריצות נפרדות ורצופות.למרות שזמן השמירה שונה מעט, עדיין ניתן להשתמש בו לכימות ללא תווית מכיוון שהזזת הזמן היא פחות מדקה אחת. זוהי דוגמה לספקטרום מסת סריקה מלא המכיל נוירופפטיד שכותרתו דימתיל והתוצאה היא תזוזת מסה של 4.025 דלטון בין הצורות הקלות והכבדות של הנוירופפטיד. ספקטרום מסת יון השבר של פפטיד ברצף דה נובו מדגים כיסוי פיצול טוב, כאשר יון שבר B ו-Y נצפה עבור כל חומצת אמינו עם שגיאת מסה נמוכה של 0.02 דלטון.זה מצביע על כך שנצפה פפטיד אנדוגני השייך למשפחת הנוירופפטידים RYMI של הסרטנים. דוגמאות לנקודות טובות שנוגעות בכל הקצוות של תחריט הבאר מוצגות בצד שמאל. ודוגמאות של כתמים רעים מוצגים בצד ימין.לאחר הדמיית MALDI MS של נוירופפטידים מרקמות קלינקטים סאפידוס, התקבלו תמונות התפלגות יונים של ערכי M over Z שונים המתאימים לנוירופפטידים שונים. אופטימיזציה של ממס חילוץ עבור סוג אנאלי מסוים היא חיונית. כמו כן ודא שמתרחשת הומוגניזציה מלאה והתאם את השיטה לפי הצורך.שום דבר לא יזוהה במורד הזרם אם הוא לא יחולץ. טכניקה זו יכולה לספק רשימה בסיסית של נוירופפטידים חשובים שניתן לחקור עוד יותר כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים, כמו גם לספק מידע לוקליזציה לא ממוקד ללא צורך בנוגדנים.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

מטריקס בסיוע לייזר Desorption / יינון זמן של טיסה (MALDI-TOF) Mass ניתוח Spectrometric של חלבונים שלמים גדול מ100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Mass spectrometric גישות לחקר מבנה חלבון ואינטראקציות באבקות Lyophilized

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

רצף של הצמח קיר Heteroxylans שימוש enzymic, כימית (מתילציה) הפיזיקליים (ספקטרומטריית מסה, תהודה מגנטית גרעינית) טכניקות

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

HKUST-1 as a Heterogeneous Catalyst for the Synthesis of Vanillin

HKUST-1 כמנוף הטרוגניות לסינתזה של ונילין

Vanillin (4-hydoxy-3-methoxybenzaldehyde) is the main component of the extract of vanilla bean. The natural vanilla scent is a mixture of approximately ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

אנליזת נשימה בזמן אמת באמצעות Nanoelectrospray משני יינון מצמידים ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

סינתזה וניתוח ספקטרומטר מסה של Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

דו-שלב פירוליזה-גז כרומטוגרפיה שיטה עם זיהוי ספקטרומטרי המוני לזיהוי של החומרים דיו קעקועים מוצרים מזויפים

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework

In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework

באתרו FTIR ספקטרוסקופיית ככלי לחקירת גז/אינטראקציה מוצקה: שיתוף משופר מים2 Adsorption ב uio-66 מתכת-אורגני המסגרת

In situ infrared spectroscopy is an inexpensive, highly sensitive, and selective valuable tool to investigate the interaction of polycrystalline solids ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

ספקטרומטריית מסה מונחית שושלת תאים פרוטאומיקה בעובר המתפתח (צפרדע)

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...