Name: multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in callinectes sapidus
Uploaded: 2022-05-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus at JoVE.com

この研究は、米国国立科学財団(CHE-1710140およびCHE-2108223)および米国国立衛生研究所(NIH)の助成金R01DK071801を通じて支援されました。A.P.は、NIH化学生物学界面トレーニング助成金(T32 GM008505)によって部分的に支援されました。N.V.Q.は、国立心肺血液研究所からウィスコンシン大学マディソン心臓血管研究センター(T32 HL007936)へのルース・L・キルシュシュタイン国立研究サービス賞の下で、国立衛生研究所によって部分的に支援されました。L.L.は、NIHの助成金R56 MH110215、S10RR029531、S10OD025084、ならびにウィスコンシン同窓会研究財団とウィスコンシン大学マディソン薬学部が提供する資金援助を受けて、ヴィラス特別業績教授職とチャールズメルボルンジョンソン教授職からの資金援助を認めたいと思います。

記載された全ての組織サンプリングは、ウィスコンシン大学マディソン校ガイドラインに準拠して実施した。
1. 神経ペプチドのLC-ESI-MS解析
<ol><li>ニューロペプチドの抽出と脱塩<ol>
<li>組織取得に先立って、16に記載のように酸性化メタノール(acMeOH)(90:9:1 MeOH:水:酢酸)を調製する。</li>
		<li>甲殻類17 から脳組織を採取し、鉗...

<ol>
	<li>H&#246;kfelt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptides+-+an+overview.">Neuropeptides - an overview.</a> Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).</li><li>Radhakrishnan, V., Henry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+of+neuropeptides+in+the+sensory+spinal+cord.">Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord.</a> Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).</li><li>N&#228;ssel, D. R., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+neuropeptides+by+immunocytochemistry.">Detection of neuropeptides by immunocytochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 72, 71-101 (1997).</li><li>Martins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Neuropeptide+Y+Receptors+Modulates+Retinal+Ganglion+Cell+Physiology+and+Exerts+Neuroprotective+Actions+In+Vitro.">Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro.</a> ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).</li><li>Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuropeptide+Y+and+its+metabolites+by+high-performance+liquid+chromatography-electrospray+ionization+mass+spectrometry+and+integrated+sample+clean-up+with+a+novel+restricted-access+sulphonic+acid+cation+exchanger.">Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger.</a> Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).</li><li>Salisbury, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+MALDI-TOF+mass+spectrometry+workflow+for+Drosophila+melanogaster+differential+neuropeptidomics.">A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics.</a> Molecular Brain. 6, 60 (2013).</li><li>Schmerberg, C. M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function-driven+discovery+of+neuropeptides+with+mass+spectrometry-based+tools.">Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools.</a> Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).</li><li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics:+Mass+Spectrometry-Based+Identification+and+Quantitation+of+Neuropeptides.">Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides.</a> Genomics &amp; Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).</li><li>Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+mass+spectrometry+for+the+quantitative+analysis+of+neuropeptides.">Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides.</a> Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).</li><li>Pratavieira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+Imaging+Analysis+of+Neuropeptides+in+Africanized+Honeybee+(+Apis+mellifera)+Brain:+Effect+of+Aggressiveness.">MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness.</a> Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).</li><li>Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Effective+Sample+Preparation+Strategy+for+MALDI-MS+Imaging+of+Neuropeptide+Changes+in+the+Crustacean+Brain+Due+to+Hypoxia+and+Hypercapnia+Stress.">A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).</li><li>Vu, N. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptides+in+the+brain:+mass+spectrometry-based+measurement+approaches+and+challenges.">Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Precipitation+and+Delipidation+Enables+Efficient+Enrichment+of+Low-Molecular+Weight+Proteins+and+Peptides+from+Human+Plasma.">Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma.</a> Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAKS+DB:+de+novo+sequencing+assisted+database+search+for+sensitive+and+accurate+peptide+identification.">PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).</li><li>Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+evaluation+of+neuropeptidomic+profiles+upon+heat+stabilization+treatment+of+neuroendocrine+tissues+in+crustaceans.">Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans.</a> Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).</li><li>Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+borealis+stomatogastric+nervous+system+dissection.">Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+neuropeptide+modulation+of+premotor+and+motor+neurons+in+the+lobster+cardiac+ganglion.">Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion.</a> Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+in+silico+transcriptome+mining+and+biological+mass+spectrometry+for+neuropeptide+discovery+in+the+Pacific+white+shrimp+Litopenaeus+vannamei.">Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei.</a> Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).</li><li>Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacean+neuropeptides.">Crustacean neuropeptides.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).</li><li>DeLaney, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques,+applications+and+perspectives+in+neuropeptide+research.">New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>Habenstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic,+peptidomic,+and+mass+spectrometry+imaging+analysis+of+the+brain+in+the+ant+Cataglyphis+nodus.">Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus.</a> Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).</li><li>Maes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+sensitivity+of+the+nano+ultra-high+performance+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometric+analysis+of+low-concentrated+neuropeptides+by+reducing+aspecific+adsorption+and+optimizing+the+injection+solvent.">Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent.</a> Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+photochemically+promoted+click+chemistry+for+enhanced+neuropeptide+visualization+and+rapid+protein+labeling.">Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling.</a> Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).</li><li>Corbi&#232;re, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+Identification+of+Bioactive+Neuropeptides+in+Vertebrates.">Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).</li><li>Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+neuropeptides+in+crustacean+hemolymph+via+MALDI+mass+spectrometry.">Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry.</a> Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).</li><li>Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andr&#233;n, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Tissue+Sample+Stabilization+and+Extraction+Strategies+for+Neuropeptidomics.">Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics.</a> Peptidomics: Methods and Strategies. , 41-49 (2018).</li><li>Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Imaging:+A+Review+of+Emerging+Advancements+and+Future+Insights.">Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights.</a> Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).</li><li>Phetsanthad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mass+spectrometry+analysis+of+neuropeptides.">Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides.</a> Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).</li><li>P&#233;rez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSroi:+A+pre-processing+tool+for+mass+spectrometry-based+studies.">MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).</li><li>Christie, A. E., Chi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+the+neuropeptidomes+of+members+of+the+Astacidea+(Crustacea,+Decapoda)+using+publicly+accessible+transcriptome+shotgun+assembly+(TSA)+sequence+data.">Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data.</a> General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).</li><li>Livnat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+d-Amino+Acid-Containing+Neuropeptide+Discovery+Funnel.">A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel.</a> Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).</li><li>Lehrer, R. I., Ganz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensins:+endogenous+antibiotic+peptides+from+human+leukocytes.">Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes.</a> Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).</li></ol>

神経系に見られる神経ペプチドおよび内因性ペプチドの正確な同定、定量、および局在化は、それらの機能を理解する上で極めて重要である23,24。質量分析は、完全に配列決定されたゲノムを持たない生物でも、これらすべてを達成できる強力な技術です。LC-ESI-およびMALDI-MSの組み合わせを介してC. sapidusから採取された組織から神経ペプチ?...

神経系は複雑であり、生物全体に信号を伝達するためにニューロンのネットワークを必要とする。神経系は感覚情報と生物学的反応を調整します。シグナル伝達に関与する複雑で複雑な相互作用は、神経伝達物質、ステロイド、および神経ペプチドなどの多くの異なるシグナル伝達分子を必要とする。神経ペプチドは、ストレスおよび他の刺激に対する生理学的応答を活性化する上で重要な役割を果たす最も多様で強力なシグナル伝達分子であるため、これらの生理学的プロセスにおけるそれらの特異的役割を決定することは興味深い。神経ペプチドの機能は、移動度、受容体相互作用、および親和性を決定するアミノ酸構造に関連しています1。神経ペプチドの構造と機能を調べるために、神経ペプチドが組織の異なる領域で合成、保存、放出され得るため重要である組織化学、および電気生理学などの技術が採用されてきた2,3,4が、これらの方法は、神経ペプチドの膨大な配列多様性を解明するためのスループットおよび特異性によって制限されている。
質量分析(MS)は、神経ペプチドの構造と存在量のハイスループット分析を可能にします。これは、さまざまなMS技術、最も一般的には液体クロマトグラフィー - エレクトロスプレーイオン化MS(LC-ESI-MS)5およびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化MS(MALDI-MS)6を介して行うことができる。高精度の質量測定とMSフラグメンテーションを利用して、MSは、先験的な知識なしに複雑な混合物からの神経ペプチドにアミノ酸配列および翻訳後修飾(PTM)ステータスを割り当てる能力を提供し、その機能を確認するのに役立ちます7,8。定性的な情報に加えて、MSは標識フリー定量(LFQ)または同位体または等圧標識などの標識ベースの方法を通じて神経ペプチドの定量情報を可能にします9。LFQの主な利点には、そのシンプルさ、分析の低コスト、サンプル損失を最小限に抑えることができるサンプル調製ステップの削減が含まれます。しかし、LFQの欠点は、実行ごとの変動性からの定量的誤差に対処するために複数の技術的反復を必要とするため、計測器の時間コストの増加です。これはまた、小さな変動を正確に定量化する能力の低下にもつながる。標識ベースの方法は、複数のサンプルをさまざまな安定同位体を使用して差動的に標識し、1つのサンプルに結合し、質量分析によって同時に分析できるため、系統的な変動が少なくなります。これによりスループットも向上しますが、同位体標識は合成や購入に時間とコストがかかる可能性があります。フルスキャンマススペクトル(MS1)スペクトルの複雑さも多重化が増加するにつれて増加し、断片化して同定することができるユニークな神経ペプチドの数が減少する。逆に、等圧標識はMS1レベルでスペクトルの複雑さを増大させませんが、神経ペプチドなどの低存在量の分析物には課題をもたらします。等圧定量はフラグメントイオン質量スペクトル(MS2)レベルで行われるため、より豊富なマトリックス成分がフラグメンテーションのために選択され得るので、存在量の低い神経ペプチドは定量することができず、選択されたものは定量されるのに十分な存在量を有しない可能性がある。同位体標識により、同定されたすべてのペプチドに対して定量を行うことができます。
同定および定量化に加えて、局在化情報は、MALDI−MSイメージング(MALDI−MSI)10を介してMSによって得ることができる。サンプル表面を横切ってレーザーをラスタリングすることにより、MSスペクトルを各 m/z 値のヒートマップ画像にコンパイルすることができます。条件全体にわたる異なる領域における一過性ニューロペプチドシグナル強度のマッピングは、機能決定のための貴重な情報を提供することができる11。神経ペプチドの局在化は、神経ペプチドの機能が位置12によって異なる可能性があるため、特に重要である。
神経ペプチドは、神経伝達物質などの他のシグナル伝達分子よりもインビボで存在量が少なく、したがって検出には高感度な方法が必要である13。これは、脂質11、14などのより存在量の多いマトリックス成分の除去によって達成することができる。神経ペプチドの分析のための追加の考慮事項は、主にほとんどのneuropeptidomic分析が酵素消化を省略しているため、一般的なプロテオミクスワークフローと比較すると、行う必要があります。これは、ほとんどがプロテオミクスデータとペプチド検出によって知らされたタンパク質一致に基づくアルゴリズムで構築されたため、神経ペプチドデータ分析のためのソフトウェアオプションを制限します。しかし、PEAKS15などの多くのソフトウェアは、de novoシーケンシング機能により、神経ペプチド分析に適しています。抽出法からMSデータ解析までの神経ペプチドの解析には、いくつかの要因を考慮する必要があります。
ここで説明するプロトコルには、LC-ESI-MS、MALDI-MS、およびMALDI-MSIによる神経ペプチドのサンプル調製およびジメチル同位体標識、データ取得、およびデータ分析のための方法が含まれる。いくつかの実験からの代表的な結果を通して、青いカニ、 カリネクテス・サピドゥスからの神経ペプチドを同定、定量、および局在化するこれらの方法の有用性および能力が実証される。神経系をよりよく理解するために、モデル系が一般的に使用される。多くの生物は、完全に配列決定されたゲノムを利用可能にしていないため、ペプチドレベルでの包括的な神経ペプチドの発見を妨げている。この課題を軽減するために、完全なゲノム情報を持たない生物のデータベースを生成するための新規神経ペプチドおよびトランスクリプトームマイニングを同定するためのプロトコルが含まれる。ここで提示されるすべてのプロトコールは、任意の種からの神経ペプチドサンプルに対して最適化することができ、また、任意の内因性ペプチドの分析に適用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Reagents, and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>39319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borane pyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker peptide calibration mix</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary</td>
			<td>Polymicro</td>
			<td>1068150019</td>
			<td>to make nanoflow column (75 &#181;m inner diameter x 360 &#181;m outer diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat cup</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6032</td>
			<td>any cup or mold should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde - D2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>492620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214340</td>
			<td>place in 37 &#176;C water bath to melt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>15553953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies</td>
			<td>CB-90IN-S107</td>
			<td>25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS vials</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TFMSCERT5000-30LVW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol Optima LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Hydrophobic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Indicator strips</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>109450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red phosphorus clusters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>343242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed phase C18 material</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002350</td>
			<td>manually packed into nanoflow column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wite-out pen</td>
			<td>BIC</td>
			<td>150810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Z720070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments and Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic matrix sprayer system- M5</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge - 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-401-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat- HM 550</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>956564A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant</td>
			<td>Drierite</td>
			<td>2088701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI stainless steel target plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>8280781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite XLS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td>200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapifleX MALDI-TOF/TOF</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac - SVC100</td>
			<td>Savant</td>
			<td>SVC-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td>2510R-MTH</td>
			<td>for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB120110</td>
			<td>FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump- Alcatel 2008 A</td>
			<td>Ideal Vacuum Products</td>
			<td>P10976</td>
			<td>ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37C) - Isotemp 110</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-460-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expasy</td>
			<td>https://web.expasy.org/translate/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexAnalysis</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexControl</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEAKS Studio</td>
			<td>Bioinformatics Solutions, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td>https://scils.de/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SignalP 5.0</td>
			<td>https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tBLASTn</td>
			<td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&#38;BLAST_ 
			PROGRAMS=tblastn&#38;PAGE_ 
			TYPE=BlastSearch&#38;SHOW_ 
			DEFAULTS=on&#38;LINK_LOC 
			=blasthome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in callinectes sapidus

神経ペプチドは、発生、生殖、食物摂取、外部ストレッサーへの応答など、ほぼすべての生理学的および行動的プロセスを調節するシグナル伝達分子です。しかし、神経ペプチドの生化学的メカニズムと完全な補完物、およびそれらの機能的役割については、ほとんど理解されていない。これらの内因性ペプチドの特性評価は、このクラスのシグナル伝達分子内の膨大な多様性によって妨げられている。さらに、神経ペプチドは、神経伝達物質の濃度よりも100倍〜1000倍低い濃度で生理活性であり、シナプス放出後に酵素分解を起こしやすい。質量分析(MS)は、 先験的な 包括的な知識がなくても分析物を同定、定量、局在化できる高感度分析ツールです。これは、神経ペプチドをグローバルにプロファイリングし、新規ペプチドの発見を支援するのに適しています。このクラスのペプチドの豊富さと化学的多様性が低いため、いくつかのサンプル調製方法、MS取得パラメータ、およびデータ分析戦略がプロテオミクス技術から適応され、最適な神経ペプチド特性評価が可能になりました。ここでは、液体クロマトグラフィー(LC)-MSおよびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)-MSを使用して、配列特性評価、定量、および局在化のために、複雑な生物学的組織から神経ペプチドを単離するための方法について説明する。青いカニから神経ペプチドデータベースを調製するためのプロトコルには、包括的なゲノム情報を持たない生物であるCallinectes sapidusが含まれている。これらのワークフローは、様々な器具を用いて、異なる種の内因性ペプチドの他のクラスを研究するために適合させることができる。

サンプル調製とMS分析のワークフローを 図1に示します。ニューロン組織の解剖後、均質化、抽出、および脱塩を行い、ニューロペプチドサンプルを精製する。同位体標識ベースの定量が必要な場合は、サンプルを標識し、再度脱塩します。得られたサンプルは、神経ペプチドの同定および定量のためにLC-MS/MSを介して分析されます。
プロテオミク?...

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Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

神経ペプチドの質量分析特性評価は、配列、定量、および局在化情報を提供します。この最適化されたワークフローは、神経ペプチド研究だけでなく、他の内因性ペプチドにも有用です。ここで提供されるプロトコルは、LC-ESI-MS、MALDI-MS スポッティング、および MALDI-MS イメージングを使用した神経ペプチドのサンプル調製、MS 取得、MS 分析、およびデータベース生成について説明しています。

カリネクテス・サピドゥスにおける神経ペプチドの多面的質量分析調査

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...

ほとんどのタンパク質よりも小さいが、多くの消化ペプチドよりも大きい内因性ペプチドの分析は、未検討の分野である。このプロトコルは、質量分析ベースのワークフローにおけるscapに対処します。質量分析は非常に高感度であり、目的の特定の神経ペプチドを標的にするために使用したり、サンプル内の神経ペプチドの範囲を捕捉して検出することができます。質量分析による神経ペプチド発現の定量および局在化は、ペプチド治療薬の開発および様々な疾患に対する神経ペプチドバイオマーカーの発見につながる可能性がある。神経ペプチド抽出を開始するには、甲殻類から脳組織を収集し、鉗子を使用して直ちに1つの組織を20マイクロリットルの酸性化メタノールを含む0.6ミリリットルのチューブに入れる。150マイクロリットルの酸性化メタノールをサンプルに加える。ソニック患者の合計時間を24秒、パルス時間を8秒に設定します。超音波ホモジナイザーで振幅を50%に15秒に一時停止し、氷上でサンプルを均質化します。サンプルを摂氏 4 度で 20, 000 GS で 20 分間遠心分離します。ピペットで上清をチューブに移し、約35°Cの真空濃縮器で乾燥させた。脱塩のために、抽出した組織試料を20マイクロリットルの0.1%ギ酸で再構成する。溶液を渦巻き、室温の水浴中で1分間超音波処理する。0.5マイクロリットルのサンプルをpHストリップに塗布して、pHが4未満であることを確認します。摂氏 4 度と 20, 000 GS で 30 秒間遠心分離します。錯覚溶液中で濡れ平衡洗浄を準備する。10マイクロリットルの脱塩チップをC18樹脂で得た。脱塩チップを、15 マイクロリットルに設定された 20 マイクロリットルのピペットの上に置きます。先端を濡れ溶液で3回、等コラボレーション溶液で3回吸引します。試料を10回吸引し、続いて各洗浄液を捨てて洗浄液で3回洗浄した。アセトニトリルを増加させる順にそれぞれの錯覚溶液で10回吸引して溶出する。ほのめかした神経ペプチドを真空濃縮器で乾燥させる。乾燥脱塩した神経ペプチドを5マイクロリットルの0.1%ギ酸で再構成する。溶液を渦巻き、室温の水浴中で1分間超音波処理する。2000 GSで短時間遠心分離機。神経ペプチドおよびクラスタ組織のスポッティングのために、疎水性フィルム上に3マイクロリットルのサンプル液滴をピペットで留める。3マイクロリットルのDHBマトリックスをサンプル液滴上に直接ピペットする。上下にピペッティングして溶液を混ぜる。サンプルおよびマトリックス混合物の1マイクロリットルをMALDIステンレス鋼ターゲットプレートのウェルにピペットし、ピペットチップを使用して各混合物をサンプルウェルの縁に広げる。1マイクロリットルの1対1口径とマトリックス混合物をサンプルの近くのウェルにスポットします。乾燥したサンプルスポットを含むターゲットプレートをMALDIタンデム飛行時間計器に挿入します。DHBマトリックスを使用すると、レーザー出力を95%に設定し、自動最適検出器ゲインとスマートな完全なサンプルサンプルキャリア移動モードを選択します。Zに対して200~3、200 Mの範囲のMSスペクトルを取得し、各スポットから複数のスペクトルを一緒に追加して、神経ペプチドのシグナル対ノイズ比を高めます。クライオスタットカップの半分にゼラチンを入れ、室温で固化させます。残った液体ゼラチンを摂氏37度の水浴中で温かく保ちます。動物から所望のニューロン組織を収集し、鉗子を使用して、脱イオン水を含む0.6ミリリットルのチューブに直ちに組織を1秒間浸漬する。固体ゼラチンの上に組織を置き、クライオスタットカップの残りの部分を液体ゼラチンで満たします。鉗子を使用して組織を配置します。クライオスタット カップを平らな面に置き、ドライアイスで凍らせます。切片化調製のために、ゼラチン包埋サンプルを金型を切断することによってクライオスタットモールドから分離する。1ミリリットルの脱イオン水の液滴をチャックにピペッティングし、直ちに埋め込み組織を液滴に押し付けることによって、埋め込み組織をクライオスタットチャックに取り付ける。一旦ピペットを凍結したら、組織周辺の脱イオン水をさらに多くし、さらにチャックに固定する。1つの細胞のおおよその厚さで組織を切開する。スライドの片側をセクションの近くに置き、スライドの反対側に指を置いてガラスをゆっくりと温め、セクションをスライドに貼り付けることで、各セクションをインジウムスズ酸化物コーティングされたスライドガラスに親指で取り付けます。デノボのみのペプチドを輸出する。平均ローカル信頼度スコアが 75 以上のピークからの CSV。特定の神経ペプチドファミリーに属する神経ペプチドを示す既知の配列モチーフについてペプチドリストを検索する。目的の既知のプレプロホルモンアミノ酸配列を選択し、TB blast Nを使用して、データベースに対してクエリプレプロホルモン配列を検索します。ターゲット オーガニゼーションを選択し、期待しきい値アルゴリズム パラメーターを 1000 に変更して、低スコアのアラインメントを含めます。blast プログラムを実行し、クエリ配列と被験者配列の間で高い相同性スコアがないか結果をチェックし、有意なアライメントを生成します。塩基配列を含むFASTAファイルを保存します。Expasy翻訳ツールを使用して、プレプロホルモンのヌクレオチド配列をプレプロホルモンペプチド配列に翻訳します。カリネクテス・サピドゥスの場合、遺伝暗号のために無脊椎動物のミトコンドリアを選択し、ツールを実行します。シグナルP.Thisを使用してペプチド配列中のシグナルペプチド配列およびプロホルモン切断部位をチェックするこれは、0.02ダルトンの最大限界を有する低フラグメント質量誤差で100%配列カバレッジで同定された神経ペプチドの断片化スペクトルである。ここには、100%の配列カバレッジで同定されたニューロペプチドのスペクトルがあるが、断片イオンの数が少ないため、同定の信頼性は低い。これらは、2つの別々の連続した実行で同定された単一の神経ペプチドについて抽出されたイオンクロマトグラムである。保持時間はわずかに異なりますが、時間シフトは1分未満であるため、これはラベルフリー定量に使用できます。これは、ジメチル標識されたニューロペプチドを含むフルスキャンマススペクトルの例であり、その結果、ニューロペプチドの軽質型と重型の間に4.025ダルトンの質量シフトが生じる。De Novo配列決定ペプチドのフラグメントイオンマススペクトルは、良好なフラグメント化カバレッジを示し、BおよびまたはYフラグメントイオンは、0.02ダルトンの低い質量誤差で各アミノ酸について観察された。このことは、甲殻類RYMI神経ペプチドファミリーに属する内因性ペプチドが観察されたことを示している。井戸彫刻のすべての端に触れる良い斑点の例を左側に示します。そして、悪い点の例を右側に示します。カリネクテス・サピダス組織由来の神経ペプチドのMALDIMSイメージング後、異なる神経ペプチドに対応する様々なMーZ値のイオン分布画像が得られた。特定の分析タイプに対する抽出溶媒の最適化は非常に重要です。また、完全な均質化が行われることを確認し、必要に応じて方法を調整します。抽出されていない場合、下流では何も検出されません。この技術は、潜在的なバイオマーカーとしてさらに調査することができる重要な神経ペプチドの基礎リストを提供するだけでなく、抗体を必要とせずに非標的局在化情報を提供することができる。

Research

JoVE Journal

Chemistry

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

フライトのマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間（MALDI-TOF）100kDaのより大きなインタクトタンパク質の質量分析

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

質量分析は、凍結乾燥粉末中のタンパク質の構造と相互作用を研究するためのアプローチ

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

HKUST-1 as a Heterogeneous Catalyst for the Synthesis of Vanillin

HKUST-1バニリンの合成のための不均一触媒として、

Vanillin (4-hydoxy-3-methoxybenzaldehyde) is the main component of the extract of vanilla bean. The natural vanilla scent is a mixture of approximately ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

高分解能質量分析に結合された二次 Nanoelectrospray イオン化を用いたリアルタイム呼吸解析

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

合成とオリゴ ペプチドの質量分析

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

タトゥーインク成分および偽造製品の同定のための質量分光検出を用いた2段階熱分解-ガスクロマトグラフィー法

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework

In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework

イン・シチュガス・固体相互作用の調査ツールとしてのFTIR分光法:UiO-66金属有機フレームワークにおける水強化CO2吸着

In situ infrared spectroscopy is an inexpensive, highly sensitive, and selective valuable tool to investigate the interaction of polycrystalline solids ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

発生中の(カエル)胚における細胞系譜ガイド質量分析プロテオミクス

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...