Name: multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in callinectes sapidus
Uploaded: 2022-05-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus at JoVE.com

이 연구는 R01DK071801 보조금을 통해 국립 과학 재단 (CHE-1710140 및 CHE-2108223)과 국립 보건원 (NIH)의 지원을 받았습니다. A.P.는 NIH 화학-생물학 인터페이스 교육 보조금(T32 GM008505)에 의해 부분적으로 지원되었다. N.V.Q.는 국립 심장 폐 및 혈액 연구소에서 위스콘신-매디슨 심혈관 연구 센터 (T32 HL007936)에 이르기까지 루스 L. 키르슈타인 국립 연구 서비스 상 (Ruth L. Kirschstein National Research Service Award)에 따라 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 지원을 받았다. L.L.은 NIH 보조금 R56 MH110215, S10RR029531 및 S10OD025084뿐만 아니라 위스콘신 동문 연구 재단 및 위스콘신 - 매디슨 약학부에서 제공하는 자금으로 Vilas Distinguished Achievement Professorship 및 Charles Melbourne Johnson 교수직의 자금 지원을 인정하고자합니다.

설명된 모든 조직 샘플링은 위스콘신-매디슨 대학교 가이드라인에 따라 수행되었다.
1. 신경펩타이드의 LC-ESI-MS 분석
<ol><li>뉴로펩타이드 추출 및 탈염<ol>
<li>조직 획득에 앞서,도 16에 기재된 바와 같이 산성화된 메탄올(acMeOH)(90:9:1 MeOH:물:아세트산)을 준비한다.</li>
		<li>갑각류17 로부터 뇌 조직을 수집하고 포셉을 사용하여 20 ?...

<ol>
	<li>H&#246;kfelt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptides+-+an+overview.">Neuropeptides - an overview.</a> Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).</li><li>Radhakrishnan, V., Henry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+of+neuropeptides+in+the+sensory+spinal+cord.">Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord.</a> Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).</li><li>N&#228;ssel, D. R., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+neuropeptides+by+immunocytochemistry.">Detection of neuropeptides by immunocytochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 72, 71-101 (1997).</li><li>Martins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Neuropeptide+Y+Receptors+Modulates+Retinal+Ganglion+Cell+Physiology+and+Exerts+Neuroprotective+Actions+In+Vitro.">Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro.</a> ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).</li><li>Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuropeptide+Y+and+its+metabolites+by+high-performance+liquid+chromatography-electrospray+ionization+mass+spectrometry+and+integrated+sample+clean-up+with+a+novel+restricted-access+sulphonic+acid+cation+exchanger.">Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger.</a> Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).</li><li>Salisbury, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+MALDI-TOF+mass+spectrometry+workflow+for+Drosophila+melanogaster+differential+neuropeptidomics.">A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics.</a> Molecular Brain. 6, 60 (2013).</li><li>Schmerberg, C. M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function-driven+discovery+of+neuropeptides+with+mass+spectrometry-based+tools.">Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools.</a> Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).</li><li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics:+Mass+Spectrometry-Based+Identification+and+Quantitation+of+Neuropeptides.">Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides.</a> Genomics &amp; Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).</li><li>Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+mass+spectrometry+for+the+quantitative+analysis+of+neuropeptides.">Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides.</a> Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).</li><li>Pratavieira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+Imaging+Analysis+of+Neuropeptides+in+Africanized+Honeybee+(+Apis+mellifera)+Brain:+Effect+of+Aggressiveness.">MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness.</a> Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).</li><li>Buchberger, A. R., Vu, N. 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Q., DeLaney, K., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics:+Improvements+in+Mass+Spectrometry+Imaging+Analysis+and+Recent+Advancements.">Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements.</a> Current Protein &amp; Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).</li><li>Li, L., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptides+in+the+brain:+mass+spectrometry-based+measurement+approaches+and+challenges.">Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Precipitation+and+Delipidation+Enables+Efficient+Enrichment+of+Low-Molecular+Weight+Proteins+and+Peptides+from+Human+Plasma.">Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma.</a> Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAKS+DB:+de+novo+sequencing+assisted+database+search+for+sensitive+and+accurate+peptide+identification.">PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).</li><li>Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+evaluation+of+neuropeptidomic+profiles+upon+heat+stabilization+treatment+of+neuroendocrine+tissues+in+crustaceans.">Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans.</a> Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).</li><li>Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+borealis+stomatogastric+nervous+system+dissection.">Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 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R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Imaging:+A+Review+of+Emerging+Advancements+and+Future+Insights.">Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights.</a> Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).</li><li>Phetsanthad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mass+spectrometry+analysis+of+neuropeptides.">Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides.</a> Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).</li><li>P&#233;rez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. 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I., Ganz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensins:+endogenous+antibiotic+peptides+from+human+leukocytes.">Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes.</a> Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).</li></ol>

신경계에서 발견되는 신경 펩티드 및 내인성 펩티드의 정확한 식별, 정량화 및 국소화는 그들의 기능을 이해하는 데 결정적이다23,24. 질량 분광법은 완전히 서열화 된 게놈이없는 유기체에서조차도이 모든 것을 달성 할 수있는 강력한 기술입니다. LC-ESI- 및 MALDI-MS의 조합을 통해 C. sapidus로부터 수집된 조직으로부터 신경펩티드를 검출, 정량화 및 ...

신경계는 복잡하며 유기체 전체에 신호를 전달하기 위해 뉴런 네트워크가 필요합니다. 신경계는 감각 정보와 생물학적 반응을 조정합니다. 신호 전달과 관련된 복잡하고 복잡한 상호 작용에는 신경 전달 물질, 스테로이드 및 신경 펩티드와 같은 많은 다른 신호 분자가 필요합니다. 뉴로펩타이드는 스트레스 및 기타 자극에 대한 생리적 반응을 활성화시키는 데 중요한 역할을 하는 가장 다양하고 강력한 신호전달 분자이기 때문에, 이러한 생리적 과정에서 이들의 특정 역할을 결정하는 것이 관심의 대상이다. 뉴로펩타이드 기능은 이동성, 수용체 상호작용 및 친화도를 결정하는 아미노산 구조와 관련이 있다1. 신경 펩티드가 조직의 다른 영역에서 합성, 저장 및 방출 될 수 있기 때문에 중요한 조직 화학과 같은 기술 및 전기 생리학은 신경 펩티드 구조 및 기능 2,3,4를 조사하기 위해 사용되었지만 이러한 방법은 신경 펩티드의 광대 한 서열 다양성을 해결하기위한 처리량 및 특이성에 의해 제한됩니다.
질량 분광법 (MS)은 신경 펩티드 구조 및 풍부도의 높은 처리량 분석을 가능하게합니다. 이것은 상이한 MS 기술, 가장 일반적으로 액체 크로마토그래피-전기 분무 이온화 MS (LC-ESI-MS)5 및 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 MS (MALDI-MS)6를 통해 수행될 수 있다. 고정밀 질량 측정 및 MS 단편화를 활용하여, MS는 그들의 기능 7,8을 확인하는 것을 돕기 위해 선험적 지식 없이 복잡한 혼합물로부터 뉴로펩티드에 아미노산 서열 및 번역 후 변형(PTM) 상태를 할당하는 능력을 제공한다. 정성적 정보 이외에, MS는 무표지 정량(LFQ) 또는 동위원소 또는 등압 표지9와 같은 표지 기반 방법을 통해 신경펩티드의 정량적 정보를 가능하게 한다. LFQ의 주요 장점은 단순성, 낮은 분석 비용 및 샘플 손실을 최소화 할 수있는 샘플 준비 단계 감소입니다. 그러나 LFQ의 단점은 실행 간 변동성으로 인한 정량적 오류를 해결하기 위해 여러 기술 반복실험이 필요하기 때문에 계측기 시간 비용이 증가한다는 것입니다. 이것은 또한 작은 변화를 정확하게 정량화하는 능력을 감소시킵니다. 라벨 기반 방법은 여러 샘플이 다양한 안정한 동위원소를 사용하여 차등적으로 표지되고, 하나의 샘플로 결합되고, 질량 분광법을 통해 동시에 분석 될 수 있기 때문에 덜 체계적인 변형을 겪습니다. 이것은 또한 처리량을 증가시키지만, 동위원소 라벨은 합성하거나 구매하는 데 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들 수 있습니다. 전체 스캔 질량 스펙트럼(MS1) 스펙트럼 복잡성 또한 멀티플렉싱이 증가함에 따라 증가하며, 이는 단편화될 수 있는 독특한 뉴로펩티드의 수를 감소시키고, 따라서 식별된다. 반대로, 등압 표지는 MS1 수준에서 스펙트럼 복잡성을 증가시키지 않지만, 뉴로펩타이드와 같은 낮은 풍부 분석물에 대한 도전을 도입한다. 등압 정량이 단편 이온 질량 스펙트럼(MS2) 수준에서 수행됨에 따라, 저풍부 뉴로펩티드는 단편화를 위해 더 풍부한 매트릭스 성분이 선택될 수 있고 선택된 것들은 정량화되기에 충분한 풍부도를 갖지 않을 수 있기 때문에 정량화될 수 없을 수 있다. 동위원소 표지를 사용하면 확인된 모든 펩티드에 대해 정량을 수행할 수 있습니다.
식별 및 정량화 이외에도, 국소화 정보는 MALDI-MS 이미징(MALDI-MSI)10을 통해 MS에 의해 획득될 수 있다. 샘플 표면을 가로질러 레이저를 래스터링함으로써, MS 스펙트럼은 각 m/z 값에 대한 히트 맵 이미지로 컴파일될 수 있다. 조건에 걸쳐 상이한 영역에서의 일시적 뉴로펩타이드 신호 세기를 매핑하는 것은 기능 결정(11)에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있다. 뉴로펩티드의 국소화는 뉴로펩티드 기능이 위치12에 따라 다를 수 있기 때문에 특히 중요하다.
뉴로펩티드는 신경전달물질과 같은 다른 신호전달 분자들보다 낮은 풍부도의 생체내에서 발견되며, 따라서 검출을 위한 민감한 방법들(13)을 필요로 한다. 이는 지질11,14와 같은 더 높은 풍부 매트릭스 성분의 제거를 통해 달성될 수 있다. 신경 펩티드의 분석을위한 추가적인 고려 사항은 일반적인 프로테오믹스 워크 플로우와 비교할 때 이루어져야하며, 주로 대부분의 neuropeptidomic 분석이 효소 소화를 생략하기 때문입니다. 이것은 뉴로펩타이드 데이터 분석을 위한 소프트웨어 옵션을 제한하는데, 이는 대부분 프로테오믹스 데이터와 펩티드 검출에 의해 정보화된 단백질 일치를 기반으로 하는 알고리즘으로 구축되었기 때문이다. 그러나, PEAKS15와 같은 많은 소프트웨어는 그들의 de novo 시퀀싱 능력으로 인해 뉴로펩타이드 분석에 더 적합하다. 추출 방법에서 MS 데이터 분석에 이르기까지 신경 펩티드의 분석을 위해 몇 가지 요인을 고려해야합니다.
여기에 기술된 프로토콜은 LC-ESI-MS, MALDI-MS 및 MALDI-MSI에 의한 뉴로펩티드의 샘플 제조 및 디메틸 동위원소 표지, 데이터 수집 및 데이터 분석을 위한 방법을 포함한다. 여러 실험의 대표적인 결과를 통해 푸른 게, Callinectes sapidus에서 신경 펩티드를 식별, 정량화 및 국소화하는 이러한 방법의 유용성과 능력이 입증됩니다. 신경계를 더 잘 이해하기 위해 모델 시스템이 일반적으로 사용됩니다. 많은 유기체는 완전히 서열화된 게놈을 이용할 수 없으며, 이는 펩티드 수준에서 포괄적인 뉴로펩티드 발견을 방지한다. 이러한 도전을 완화하기 위해, 완전한 게놈 정보 없이 유기체에 대한 데이터베이스를 생성하기 위해 신규한 뉴로펩티드 및 전사체 마이닝을 확인하기 위한 프로토콜이 포함된다. 여기에 제시된 모든 프로토콜은 모든 종의 뉴로펩타이드 샘플에 최적화될 수 있을 뿐만 아니라 임의의 내인성 펩티드의 분석에도 적용될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Reagents, and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>39319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borane pyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker peptide calibration mix</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary</td>
			<td>Polymicro</td>
			<td>1068150019</td>
			<td>to make nanoflow column (75 &#181;m inner diameter x 360 &#181;m outer diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat cup</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6032</td>
			<td>any cup or mold should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde - D2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>492620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214340</td>
			<td>place in 37 &#176;C water bath to melt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>15553953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies</td>
			<td>CB-90IN-S107</td>
			<td>25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS vials</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TFMSCERT5000-30LVW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol Optima LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Hydrophobic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Indicator strips</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>109450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red phosphorus clusters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>343242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed phase C18 material</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002350</td>
			<td>manually packed into nanoflow column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wite-out pen</td>
			<td>BIC</td>
			<td>150810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Z720070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments and Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic matrix sprayer system- M5</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge - 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-401-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat- HM 550</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>956564A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant</td>
			<td>Drierite</td>
			<td>2088701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI stainless steel target plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>8280781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite XLS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td>200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapifleX MALDI-TOF/TOF</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac - SVC100</td>
			<td>Savant</td>
			<td>SVC-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td>2510R-MTH</td>
			<td>for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB120110</td>
			<td>FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump- Alcatel 2008 A</td>
			<td>Ideal Vacuum Products</td>
			<td>P10976</td>
			<td>ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37C) - Isotemp 110</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-460-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expasy</td>
			<td>https://web.expasy.org/translate/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexAnalysis</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexControl</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEAKS Studio</td>
			<td>Bioinformatics Solutions, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td>https://scils.de/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SignalP 5.0</td>
			<td>https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tBLASTn</td>
			<td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&#38;BLAST_ 
			PROGRAMS=tblastn&#38;PAGE_ 
			TYPE=BlastSearch&#38;SHOW_ 
			DEFAULTS=on&#38;LINK_LOC 
			=blasthome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in callinectes sapidus

뉴로펩타이드는 발달, 번식, 음식 섭취, 외부 스트레스 요인에 대한 반응과 같은 거의 모든 생리적 및 행동 과정을 조절하는 신호 전달 분자입니다. 그러나 생화학 적 메커니즘과 신경 펩티드의 완전한 보완 및 그 기능적 역할은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다. 이들 내인성 펩티드의 특성화는 신호전달 분자의 이러한 부류 내의 엄청난 다양성에 의해 방해된다. 또한, 뉴로펩타이드는 신경전달물질보다 100x - 1000배 낮은 농도에서 생리활성이며 시냅스 방출 후 효소적 분해가 발생하기 쉽다. 질량 분광법 (MS)은 포괄적 인 선험적 지식없이 분석물을 식별, 정량화 및 현지화 할 수있는 매우 민감한 분석 도구입니다. 전 세계적으로 뉴로펩타이드를 프로파일링하고 새로운 펩타이드의 발견을 돕는 데 매우 적합합니다. 이러한 부류의 펩티드의 낮은 풍부도와 높은 화학적 다양성으로 인해, 몇몇 샘플 준비 방법, MS 획득 파라미터 및 데이터 분석 전략은 최적의 뉴로펩타이드 특성화를 허용하기 위해 프로테오믹스 기술로부터 적응되었다. 여기에서는 액체 크로마토그래피 (LC)-MS 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI)-MS를 사용하여 서열 특성화, 정량 및 국소화를 위해 복잡한 생물학적 조직으로부터 신경 펩티드를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. 블루 크랩으로부터 뉴로펩타이드 데이터베이스를 제조하기 위한 프로토콜로, 포괄적인 게놈 정보가 없는 유기체인 Callinectes sapidus가 포함된다. 이러한 워크플로우는 다양한 장비를 사용하여 다른 종의 내인성 펩타이드의 다른 클래스를 연구하도록 조정할 수 있습니다.

샘플 준비 및 MS 분석을 위한 워크플로우는 그림 1에 설명되어 있습니다. 신경 조직의 해부 후, 균질화, 추출 및 탈염이 수행되어 뉴로펩타이드 샘플을 정제한다. 동위원소 라벨-기반 정량화가 필요하다면, 샘플은 라벨링되고 다시 한번 탈염된다. 생성 된 샘플은 신경 펩티드 확인 및 정량을 위해 LC-MS / MS를 통해 분석됩니다.
프로테오믹스 소프트웨어를 ?...

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Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

뉴로펩타이드의 질량 분광학적 특성화는 서열, 정량 및 국소화 정보를 제공한다. 이 최적화 된 워크 플로는 신경 펩티드 연구뿐만 아니라 다른 내인성 펩타이드에도 유용합니다. 여기에 제공된 프로토콜은 LC-ESI-MS, MALDI-MS 스포팅 및 MALDI-MS 이미징을 사용하는 뉴로펩타이드의 샘플 준비, MS 획득, MS 분석 및 데이터베이스 생성을 기술한다.

Callinectes sapidus의 신경 펩티드에 대한 다각적 질량 분광 조사

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...

대부분의 단백질보다 작지만 많은 소화 된 펩티드보다 큰 내인성 펩티드의 분석은 조사중인 분야입니다. 이 프로토콜은 질량 분광법 기반 워크플로의 스캡을 해결합니다. 질량 분광법은 매우 민감하며 관심있는 특정 신경 펩티드를 표적으로 삼거나 샘플 내에서 다양한 신경 펩티드를 포획하고 검출 할 수 있습니다.질량 분광법에 의한 뉴로펩타이드 발현의 정량화 및 국소화는 펩타이드 치료제의 개발과 다양한 질병에 대한 뉴로펩타이드 바이오마커의 발견으로 이어질 수 있다. 신경 펩티드 추출을 시작하기 위해 갑각류로부터 뇌 조직을 수집하고 포셉을 사용하여 즉시 하나의 조직을 20 마이크로리터의 산성화 메탄올이 들어있는 0.6 밀리리터 튜브에 넣는다. 150 마이크로리터의 산성화된 메탄올을 샘플에 첨가한다.총 소닉 환자 시간을 24초로, 펄스 시간을 8초로 설정합니다. 초음파 균질 기에서 진폭을 50 %로 15 초까지 일시 중지하고 얼음 위에서 샘플을 균질화하십시오. 샘플을 섭씨 4도에서 20, 000 GS에서 20분 동안 원심분리한다.피펫으로 상층액을 튜브로 옮기고 약 섭씨 35도의 진공 농축기에서 건조시킵니다. 탈염을 위해 추출된 조직 샘플을 0.1%포름산의 20 마이크로리터로 재구성한다. 용액을 소용돌이 치며 실온 수조에서 잠시 동안 초음파 처리하십시오.pH가 네 개 미만인지 확인하기 위해 pH 스트립에 0.5 마이크로리터의 샘플을 적용하십시오. 섭씨 4도 및 20, 000 GS에서 30초 동안 원심분리한다. 환상 용액으로 습윤 평형 세척을 준비하십시오.C18 수지로 10 마이크로리터 탈염 팁을 얻었다. 탈염 팁을 15 마이크로리터로 설정된 20 마이크로리터 피펫에 놓습니다. 젖은 용액으로 팁을 세 번, 동등한 협업 솔루션으로 세 번 흡인하십시오.시료를 10회 흡인한 다음, 세척액으로 세 번 세척하여 각 세척액을 버리고 버린다. 아세토니트릴을 증가시키기 위해 각각의 환상 해결책에서 10 번 흡인하여 황홀하게하십시오. 암시된 뉴로펩티드를 진공 농축기에서 건조시킨다.건조된 탈염된 뉴로펩티드를 0.1%포름산의 다섯 마이크로리터로 재구성한다. 용액을 소용돌이 치며 실온에서 일분 동안 초음파 처리하십시오. 2000 GS에서 간단히 원심분리. 신경 펩티드 및 갑각류 조직의 스포팅을 위해, 세 마이크로리터의 샘플 방울을 소수성 필름 상에 피펫팅한다.DHB 매트릭스의 세 마이크로리터를 샘플 액적 상에 직접 피펫한다. 위아래로 피펫팅하여 솔루션을 혼합하십시오. 샘플 및 매트릭스 혼합물의 한 마이크로리터를 MALDI 스테인리스강 타겟판의 웰에 넣고 피펫 팁을 사용하여 각 혼합물을 샘플의 가장자리로 잘 퍼뜨린다.일대일 구경 및 매트릭스 혼합물의 한 마이크로리터를 샘플 근처의 웰로 스팟하십시오. 건조된 샘플 스폿이 포함된 표적 플레이트를 MALDI 탠덤 비행 시간 장비에 삽입합니다. DHB 매트릭스가 레이저 파워를 95%로 설정하여 자동 최적 검출기 게인과 스마트 전체 샘플 캐리어 이동 모드를 선택합니다.Z를 통해 200 ~ 3, 200 M의 범위에서 MS 스펙트럼을 획득하고 각 스팟에서 여러 스펙트럼을 함께 추가하여 신경 펩티드 신호 대 잡음비를 증가시킵니다. 냉동 컵 절반을 젤라틴으로 채우고 실온에서 응고되도록하십시오. 남은 액체 젤라틴을 섭씨 37도 수조에서 따뜻하게 유지하십시오.동물로부터 원하는 신경 조직을 수집하고 포셉을 사용하여 조직을 즉시 탈이온수가 들어있는 0.6 밀리리터 튜브에 담그십시오. 조직을 고체 젤라틴 위에 놓고 나머지 냉동 컵을 액체 젤라틴으로 채 웁니다. 포셉을 사용하여 조직을 배치하십시오.cryostat 컵을 평평한 표면에 놓고 드라이 아이스로 얼립니다. 단면화 준비를 위해 젤라틴 매립 샘플을 금형을 절단하여 냉동 주형으로부터 분리하십시오. 매립된 조직을 척에 탈이온수 한 밀리리터 방울을 피펫팅하고 즉시 매립된 조직을 액적 위로 밀어 넣음으로써 냉동 척 상에 장착한다.일단 피펫을 동결시키면, 조직 주위에 더 많은 탈이온수를 제거하여 척에 더 고정시킨다. 조직을 한 세포의 대략적인 두께로 단면화하십시오. 엄지 손가락으로 슬라이드의 한쪽을 섹션 근처에 놓고 슬라이드의 다른 쪽에 손가락을 올려 놓아 각 섹션을 인듐 주석 산화물 코팅 유리 슬라이드에 장착하여 천천히 유리를 따뜻하게하고 섹션이 슬라이드에 달라 붙게합니다.De Novo 펩타이드 만 내보내기. 평균 지역 신뢰도 점수가 75보다 크거나 같은 피크에서 CSV입니다. 특정 뉴로펩티드 패밀리에 속하는 뉴로펩티드를 나타내는 공지된 서열 모티프에 대해 펩티드 리스트를 검색한다.관심있는 알려진 사전 프로 호르몬 아미노산 서열을 선택하고 TB blast N을 사용하여 데이터베이스에 대해 사전 프로 호르몬 서열을 검색하십시오. 표적 유기체를 선택하고 기대 역치 알고리즘 파라미터를 1000으로 변경하여 낮은 점수 정렬을 포함한다. 블래스트 프로그램을 실행한 다음, 상당한 정렬을 생성하는 질의와 피험자 서열 사이의 높은 상동성 스코어에 대한 결과를 확인한다.뉴클레오티드 서열이 포함된 FASTA 파일을 저장합니다. Expasy 번역 도구를 사용하여 pre-pro 호르몬 뉴클레오티드 서열을 pre-pro 호르몬 펩티드 서열로 번역하십시오. callinectes의 경우 sapidus는 유전 암호에 대한 무척추 동물 미토콘드리아를 선택하고 도구를 실행합니다.신호 P를 사용하여 펩티드 서열에서 신호 펩티드 서열 및 프로호르몬 절단 부위를 확인한다.이것은 최대 한계 0.02 달톤의 낮은 단편 질량 오차에서 100% 서열 커버리지로 확인된 뉴로펩티드의 단편화 스펙트럼이다. 여기에 100 % 서열 커버리지로 확인 된 신경 펩티드의 스펙트럼이 있지만 단편 이온의 수가 적기 때문에 확인의 신뢰도가 낮습니다. 이들은 단일 뉴로펩티드에 대한 추출된 이온 크로마토그램이며, 이는 두 개의 분리되고 연속적인 실행에서 확인되었다.보존 시간이 약간 다르더라도 시간 이동이 1분 미만이기 때문에 레이블이 없는 정량화에 계속 사용할 수 있습니다. 이는 디메틸 표지된 뉴로펩티드를 함유하는 전체 주사 질량 스펙트럼의 예이며, 이는 경쇄 및 무거운 형태의 뉴로펩티드 사이의 4.025 달톤 질량 이동을 초래한다. De Novo 서열화된 펩티드의 단편 이온 질량 스펙트럼은 양호한 단편화 커버리지를 입증하며, 여기서 B 및 또는 Y 단편 이온은 0.02 달톤의 낮은 질량 오차를 갖는 각 아미노산에 대해 관찰되었다.이는 갑각류 RYMI 뉴로펩타이드 패밀리에 속하는 내인성 펩티드가 관찰되었음을 나타낸다. 우물 조각의 모든 가장자리에 닿는 좋은 반점의 예가 왼쪽에 표시됩니다. 그리고 나쁜 반점의 예가 오른쪽에 표시됩니다.캘리넥테스 사피두스 조직으로부터 뉴로펩티드의 MALDI MS 이미징 후, Z 값 이상의 다양한 M의 이온 분포 이미지가 상이한 뉴로펩티드에 상응하는 수득되었다. 특정 분석 유형에 대한 추출 용매 최적화가 중요합니다. 또한 완전한 균질화가 발생하는지 확인하고 필요에 따라 방법을 조정하십시오.추출되지 않으면 다운스트림에서 아무 것도 감지되지 않습니다. 이 기술은 잠재적 바이오마커로서 추가로 조사될 수 있는 중요한 뉴로펩티드의 기초 목록을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 항체에 대한 필요 없이 표적화되지 않은 국소화 정보를 제공할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

연구

화학

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

비행의 레이저 탈착 / 이온화 시간 본래대로 단백질의 (MALDI-TOF) 질량 분광 분석 매트릭스를 이용한 큰 100 kDa의

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

질량 분석은 동결 건조 분말에서 단백질의 구조와 상호 작용을 연구하는 접근

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

HKUST-1 as a Heterogeneous Catalyst for the Synthesis of Vanillin

HKUST 바닐린-1의 합성에 대해 불균일 촉매로서

Vanillin (4-hydoxy-3-methoxybenzaldehyde) is the main component of the extract of vanilla bean. The natural vanilla scent is a mixture of approximately ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

고 분해능 질량 분석을 결합 하는 보조 Nanoelectrospray 이온화를 사용 하 여 실시간 호흡 분석

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

합성 및 올리고 peptoids의 질량 분석 분석

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

문신 잉크 성분 및 위조 제품의 식별을 위한 질량 분 광 탐지를 가진 2 단계 열 분해-가스 크로마토그래피 방법

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework

In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework

인 시투 가스/고체 상호 작용 의 조사를위한 도구로 FTIR 분광법 : UiO-66 금속 - 유기 프레임 워크에서 수성CO2 흡착

In situ infrared spectroscopy is an inexpensive, highly sensitive, and selective valuable tool to investigate the interaction of polycrystalline solids ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

발달 중인 (개구리) 배아의 세포 계통 유도 질량 분석법 단백질체학

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...