Name: multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in callinectes sapidus
Uploaded: 2022-05-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pela National Science Foundation (CHE-1710140 e CHE-2108223) e Institutos Nacionais de Saúde (NIH) através da bolsa R01DK071801. A.P. foi apoiada em parte pela NiH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. foi apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde, sob o Prêmio Nacional de Serviço de Pesquisa Ruth L. Kirschstein do National Heart Lung and Blood Institute para o Centro de Pesquisa Cardiovascular da Universidade de Wisconsin-Madison (T32 HL007936). L.L. gostaria de reconhecer as bolsas NIH R56 MH110215, S10RR029531 e S10OD025084, bem como o apoio de financiamento de um Professor de Conquista Distinto de Vilas e Professor de Charles Melbourne Johnson com financiamento fornecido pela Wisconsin Alumni Research Foundation e pela University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

Todas as amostras de tecido descritas foram realizadas em conformidade com as diretrizes da Universidade de Wisconsin-Madison.
1. Análise LC-ESI-MS de neuropeptídeos
<ol><li>Extração e desalamento de neuropeptídeos<ol>
<li>Antes da aquisição de tecidos, prepare o metanol acidificado (acMeOH) (90:9:1 MeOH:água:ácido acético) como descrito em16.</li>
		<li>Colete tecido cerebral do crustáceo17 e use fórceps para coloc...

<ol>
	<li>H&#246;kfelt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptides+-+an+overview.">Neuropeptides - an overview.</a> Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).</li><li>Radhakrishnan, V., Henry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+of+neuropeptides+in+the+sensory+spinal+cord.">Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord.</a> Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).</li><li>N&#228;ssel, D. R., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+neuropeptides+by+immunocytochemistry.">Detection of neuropeptides by immunocytochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 72, 71-101 (1997).</li><li>Martins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Neuropeptide+Y+Receptors+Modulates+Retinal+Ganglion+Cell+Physiology+and+Exerts+Neuroprotective+Actions+In+Vitro.">Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro.</a> ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).</li><li>Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuropeptide+Y+and+its+metabolites+by+high-performance+liquid+chromatography-electrospray+ionization+mass+spectrometry+and+integrated+sample+clean-up+with+a+novel+restricted-access+sulphonic+acid+cation+exchanger.">Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger.</a> Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).</li><li>Salisbury, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+MALDI-TOF+mass+spectrometry+workflow+for+Drosophila+melanogaster+differential+neuropeptidomics.">A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics.</a> Molecular Brain. 6, 60 (2013).</li><li>Schmerberg, C. M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function-driven+discovery+of+neuropeptides+with+mass+spectrometry-based+tools.">Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools.</a> Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).</li><li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics:+Mass+Spectrometry-Based+Identification+and+Quantitation+of+Neuropeptides.">Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides.</a> Genomics &amp; Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).</li><li>Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+mass+spectrometry+for+the+quantitative+analysis+of+neuropeptides.">Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides.</a> Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).</li><li>Pratavieira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+Imaging+Analysis+of+Neuropeptides+in+Africanized+Honeybee+(+Apis+mellifera)+Brain:+Effect+of+Aggressiveness.">MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness.</a> Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).</li><li>Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Effective+Sample+Preparation+Strategy+for+MALDI-MS+Imaging+of+Neuropeptide+Changes+in+the+Crustacean+Brain+Due+to+Hypoxia+and+Hypercapnia+Stress.">A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).</li><li>Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics:+Improvements+in+Mass+Spectrometry+Imaging+Analysis+and+Recent+Advancements.">Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements.</a> Current Protein &amp; Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).</li><li>Li, L., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptides+in+the+brain:+mass+spectrometry-based+measurement+approaches+and+challenges.">Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Precipitation+and+Delipidation+Enables+Efficient+Enrichment+of+Low-Molecular+Weight+Proteins+and+Peptides+from+Human+Plasma.">Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma.</a> Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAKS+DB:+de+novo+sequencing+assisted+database+search+for+sensitive+and+accurate+peptide+identification.">PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).</li><li>Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+evaluation+of+neuropeptidomic+profiles+upon+heat+stabilization+treatment+of+neuroendocrine+tissues+in+crustaceans.">Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans.</a> Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).</li><li>Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+borealis+stomatogastric+nervous+system+dissection.">Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacean+neuropeptides.">Crustacean neuropeptides.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).</li><li>DeLaney, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques,+applications+and+perspectives+in+neuropeptide+research.">New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>Habenstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic,+peptidomic,+and+mass+spectrometry+imaging+analysis+of+the+brain+in+the+ant+Cataglyphis+nodus.">Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus.</a> Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).</li><li>Maes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+sensitivity+of+the+nano+ultra-high+performance+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometric+analysis+of+low-concentrated+neuropeptides+by+reducing+aspecific+adsorption+and+optimizing+the+injection+solvent.">Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent.</a> Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+photochemically+promoted+click+chemistry+for+enhanced+neuropeptide+visualization+and+rapid+protein+labeling.">Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling.</a> Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).</li><li>Corbi&#232;re, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+Identification+of+Bioactive+Neuropeptides+in+Vertebrates.">Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).</li><li>Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+neuropeptides+in+crustacean+hemolymph+via+MALDI+mass+spectrometry.">Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry.</a> Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).</li><li>Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andr&#233;n, P. 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R., Tauler, R., Jaumot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSroi:+A+pre-processing+tool+for+mass+spectrometry-based+studies.">MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).</li><li>Christie, A. E., Chi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+the+neuropeptidomes+of+members+of+the+Astacidea+(Crustacea,+Decapoda)+using+publicly+accessible+transcriptome+shotgun+assembly+(TSA)+sequence+data.">Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data.</a> General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).</li><li>Livnat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+d-Amino+Acid-Containing+Neuropeptide+Discovery+Funnel.">A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel.</a> Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).</li><li>Lehrer, R. I., Ganz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensins:+endogenous+antibiotic+peptides+from+human+leukocytes.">Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes.</a> Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).</li></ol>

A identificação precisa, quantificação e localização de neuropeptídeos e peptídeos endógenos encontrados no sistema nervoso são cruciais para entender sua função23,24. A espectrometria de massa é uma técnica poderosa que pode permitir que tudo isso seja realizado, mesmo em organismos sem um genoma totalmente sequenciado. A capacidade deste protocolo de detectar, quantificar e localizar neuropeptídeos a partir de tecido coletado de C. sapidus</e...

O sistema nervoso é complexo e requer uma rede de neurônios para transmitir sinais através de um organismo. O sistema nervoso coordena informações sensoriais e resposta biológica. As interações complexas e complicadas envolvidas na transmissão de sinais requerem muitas moléculas de sinalização diferentes, como neurotransmissores, esteroides e neuropeptídeos. Como os neuropeptídeos são as mais diversas e potentes moléculas de sinalização que desempenham papéis-chave na ativação de respostas fisiológicas ao estresse e outros estímulos, é de interesse determinar seu papel específico nesses processos fisiológicos. A função neuropeptídeo está relacionada à sua estrutura de aminoácidos, que determina mobilidade, interação receptora e afinidade1. Técnicas como a histoquímica, importante porque os neuropeptídeos podem ser sintetizados, armazenados e liberados em diferentes regiões do tecido, e a eletrofisiologia têm sido empregadas para investigar a estrutura e função do neuropeptídeo 2,3,4, mas esses métodos são limitados pelo throughput e especificidade para resolver a vasta diversidade sequencial de neuropeptídeos.
A espectrometria de massa (MS) permite a análise de alto rendimento da estrutura e abundância do neuropeptídeo. Isso pode ser realizado através de diferentes técnicas de EM, mais comumente cromatografia-eletrospraização líquida MS (LC-ESI-MS)5 e desorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-MS)6. Utilizando medidas de massa de alta precisão e fragmentação de MS, a MS fornece a capacidade de atribuir sequência de aminoácidos e status de modificação pós-translacional (PTM) a neuropeptídeos de misturas complexas sem conhecimento a priori para ajudar na verificação de sua função 7,8. Além das informações qualitativas, a MS permite informações quantitativas de neuropeptídeos por meio de quantitação sem rótulos (LFQ) ou métodos baseados em rótulos, como rotulagem isotópica ou isobárica9. As principais vantagens do LFQ incluem sua simplicidade, baixo custo de análise e diminuição das etapas de preparação da amostra que podem minimizar a perda de amostras. No entanto, as desvantagens do LFQ incluem o aumento dos custos de tempo do instrumento, pois requer múltiplas réplicas técnicas para lidar com o erro quantitativo da variabilidade run-to-run. Isso também leva a uma diminuição da capacidade de quantificar com precisão pequenas variações. Os métodos baseados em rótulos são submetidos a uma variação menos sistemática, pois várias amostras podem ser rotuladas diferencialmente usando uma variedade de isótopos estáveis, combinados em uma amostra, e analisados através de espectrometria de massa simultaneamente. Isso também aumenta o rendimento, embora rótulos isotópicos possam ser demorados e caros para sintetizar ou comprar. A complexidade espectral do espectro de massa de varredura completa (MS1) também aumenta à medida que o multiplexing aumenta, o que diminui o número de neuropeptídeos únicos capazes de ser fragmentados e, portanto, identificados. Por outro lado, a rotulagem isobárica não aumenta a complexidade espectral no nível MS1, embora introduza desafios para analitos de baixa abundância, como neuropeptídeos. Como a quantitação isobárica é realizada no nível de espectro de massa de íons de fragmento (MS2), neuropeptídeos de baixa abundância podem ser incapazes de ser quantificados, pois componentes matriciais mais abundantes podem ser selecionados para fragmentação e aqueles selecionados podem não ter abundância alta o suficiente para serem quantificados. Com rotulagem isotópica, a quantitação pode ser realizada em todos os peptídeos identificados.
Além da identificação e quantificação, as informações de localização podem ser obtidas pela MS através de imagens MALDI-MS (MALDI-MSI)10. Ao rasterar um laser através de uma superfície de amostra, os espectros ms podem ser compilados em uma imagem de mapa de calor para cada valor m/z . Mapear a intensidade do sinal de neuropeptídeo transitório em diferentes regiões em condições pode fornecer informações valiosas para a determinação da função11. A localização de neuropeptídeos é especialmente importante porque a função neuropeptídeo pode diferir dependendo do local12.
Neuropeptídeos são encontrados em menor abundância in vivo do que outras moléculas de sinalização, como neurotransmissores, e assim requerem métodos sensíveis para detecção13. Isso pode ser alcançado através da remoção de componentes de matriz de maior abundância, como lipídios11,14. Considerações adicionais para a análise de neuropeptídeos precisam ser feitas quando comparadas aos fluxos de trabalho proteômicos comuns, principalmente porque a maioria das análises neuropeptidômicas omitem a digestão enzimática. Isso limita as opções de software para análise de dados de neuropeptídeos, pois a maioria foi construída com algoritmos baseados em dados de proteômica e correspondências de proteínas informadas pela detecção de peptídeos. No entanto, muitos softwares como o PEAKS15 são mais adequados à análise de neuropeptídeos devido às suas capacidades de sequenciamento de novo. Vários fatores precisam ser considerados para a análise de neuropeptídeos a partir do método de extração à análise de dados em MS.
Os protocolos descritos aqui incluem métodos para preparação de amostras e rotulagem isotópica de dimetila, aquisição de dados e análise de dados de neuropeptídeos por LC-ESI-MS, MALDI-MS e MALDI-MS. Através de resultados representativos de vários experimentos, demonstra-se a utilidade e a capacidade desses métodos de identificar, quantificar e localizar neuropeptídeos de caranguejos azuis, Callinectes sapidus. Para entender melhor o sistema nervoso, os sistemas de modelos são comumente usados. Muitos organismos não têm um genoma totalmente sequenciado disponível, o que impede a descoberta abrangente de neuropeptídeos no nível do peptídeo. Para mitigar esse desafio, está incluído um protocolo de identificação de novos neuropeptídeos e mineração de transcriptome para gerar bancos de dados para organismos sem informações completas do genoma. Todos os protocolos aqui apresentados podem ser otimizados para amostras de neuropeptídeos de qualquer espécie, bem como aplicados para a análise de quaisquer peptídeos endógenos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Reagents, and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>39319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borane pyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker peptide calibration mix</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary</td>
			<td>Polymicro</td>
			<td>1068150019</td>
			<td>to make nanoflow column (75 &#181;m inner diameter x 360 &#181;m outer diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat cup</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6032</td>
			<td>any cup or mold should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde - D2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>492620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214340</td>
			<td>place in 37 &#176;C water bath to melt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>15553953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies</td>
			<td>CB-90IN-S107</td>
			<td>25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS vials</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TFMSCERT5000-30LVW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol Optima LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Hydrophobic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Indicator strips</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>109450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red phosphorus clusters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>343242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed phase C18 material</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002350</td>
			<td>manually packed into nanoflow column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wite-out pen</td>
			<td>BIC</td>
			<td>150810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Z720070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments and Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic matrix sprayer system- M5</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge - 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-401-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat- HM 550</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>956564A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant</td>
			<td>Drierite</td>
			<td>2088701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI stainless steel target plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>8280781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite XLS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td>200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapifleX MALDI-TOF/TOF</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac - SVC100</td>
			<td>Savant</td>
			<td>SVC-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td>2510R-MTH</td>
			<td>for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB120110</td>
			<td>FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump- Alcatel 2008 A</td>
			<td>Ideal Vacuum Products</td>
			<td>P10976</td>
			<td>ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37C) - Isotemp 110</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-460-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expasy</td>
			<td>https://web.expasy.org/translate/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexAnalysis</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexControl</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEAKS Studio</td>
			<td>Bioinformatics Solutions, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td>https://scils.de/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SignalP 5.0</td>
			<td>https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tBLASTn</td>
			<td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&#38;BLAST_ 
			PROGRAMS=tblastn&#38;PAGE_ 
			TYPE=BlastSearch&#38;SHOW_ 
			DEFAULTS=on&#38;LINK_LOC 
			=blasthome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in callinectes sapidus

Neuropeptídeos são moléculas de sinalização que regulam quase todos os processos fisiológicos e comportamentais, como desenvolvimento, reprodução, ingestão de alimentos e resposta a estressores externos. No entanto, os mecanismos bioquímicos e o complemento completo dos neuropeptídeos e seus papéis funcionais permanecem mal compreendidos. A caracterização desses peptídeos endógenos é dificultada pela imensa diversidade dentro dessa classe de moléculas sinalizadoras. Além disso, neuropeptídeos são bioativos em concentrações 100x - 1000x inferiores aos neurotransmissores e são propensos à degradação enzimática após a liberação sináptica. A espectrometria de massa (MS) é uma ferramenta analítica altamente sensível que pode identificar, quantificar e localizar analitos sem conhecimento a priori abrangente. É adequado para traçar neuropeptídeos globalmente e ajudar na descoberta de novos peptídeos. Devido à baixa abundância e alta diversidade química desta classe de peptídeos, vários métodos de preparação de amostras, parâmetros de aquisição de EM e estratégias de análise de dados foram adaptados a partir de técnicas de proteômica para permitir a caracterização ideal do neuropeptídeo. Aqui, são descritos métodos para isolar neuropeptídeos de tecidos biológicos complexos para caracterização, quantitação e localização de sequências usando cromatografia líquida (LC)-MS e desorpção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI)-MS. Um protocolo para preparar um banco de dados de neuropeptídeo do caranguejo azul, Callinectes sapidus, um organismo sem informações genômicas abrangentes, está incluído. Esses fluxos de trabalho podem ser adaptados para estudar outras classes de peptídeos endógenos em diferentes espécies usando uma variedade de instrumentos.

O fluxo de trabalho para preparação da amostra e análise de MS é retratado na Figura 1. Após a dissecção do tecido neuronal, a homogeneização, extração e dessacração são realizadas para purificar amostras de neuropeptídeos. Se a quantificação isotópica à base de rótulo for desejada, as amostras ão então rotuladas e desálvadas mais uma vez. A amostra resultante é analisada através de LC-MS/MS para identificação e quantificação de neuropeptídeos.
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Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

A caracterização espectrométrica em massa dos neuropeptídeos fornece informações de sequência, quantitação e localização. Este fluxo de trabalho otimizado não é apenas útil para estudos de neuropeptídeos, mas também para outros peptídeos endógenos. Os protocolos aqui fornecidos descrevem a preparação da amostra, aquisição de MS, análise de MS e geração de neuropeptídeos de banco de dados usando LC-ESI-MS, spotting MALDI-MS e imagens MALDI-MS.

Investigação espectrométrica de massa multifacetada de neuropeptídeos em Callinectes sapidus

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...

A análise de peptídeos endógenos, que são menores que a maioria das proteínas, mas maiores do que muitos peptídeos digeridos é um campo sob análise. Este protocolo aborda a scap em fluxos de trabalho baseados em espectrometria de massa. A espectrometria de massa é altamente sensível e pode ser usada para atingir neuropeptídeos específicos de interesse ou pode capturar e detectar uma gama de neuropeptídeos dentro de uma amostra.A quantitação e localização da expressão de neuropeptídeo por espectrometria de massa pode levar ao desenvolvimento de terapêutica de peptídeos e à descoberta de biomarcadores de neuropeptídeos para várias doenças. Para começar, a extração de neuropeptídeos coleta tecido cerebral do crustáceo e usando fórceps imediatamente coloque um tecido cada um em um tubo de 0,6 mililitro contendo 20 microliters de metanol acidificado. Adicione 150 microliters de metanol acidificado à amostra.Defina o tempo total do paciente Sonic para 24 segundos, tempo de pulso para oito segundos. Pausar o tempo para 15 segundos uma amplitude de 50% em um homogeneizador ultrassônico e homogeneizar as amostras no gelo. Centrifugar a amostra a quatro graus Celsius a 20.000 GS por 20 minutos.Com uma pipeta transferiu o supernasal para um tubo e secou-o em um concentrador de vácuo a aproximadamente 35 graus Celsius. Para desalar reconstituir a amostra de tecido extraído em 20 microlitres de ácido fórmico de 0,1%. Vórtice a solução e sonicate em um banho de água de temperatura ambiente por um minuto.Aplique 0,5 microliters de amostra em uma tira de pH para confirmar que o pH é menor que quatro. Centrífuga a 4 graus Celsius e 20.000 GS por 30 segundos. Prepare a lavagem de equilíbrio de molhar em soluções de ilusão.Obtenha uma ponta de desalar 10 microliter com resina C18. Coloque a ponta de desalado em uma pipeta de 20 microliteres que está definida para 15 microliters. Aspire a ponta três vezes com solução de molhar e três vezes com solução de colaboração equi.Aspirar na amostra 10 vezes seguido de lavar três vezes na solução de lavagem descartando cada lavagem. Elute aspirando 10 vezes em cada uma das soluções de ilusão para aumentar a Acetonitrila. Seque os neuropeptídeos aludidos em um concentrador de vácuo.Reconstitua os neuropeptídeos dessacados secos em cinco microlitres de ácido fórmico de 0,1%. Vórtice a solução e sonicate-lo em um banho de água de temperatura ambiente por um minuto. Centrífuga breve a 2000 GS. Para detectar neuropeptídeos e tecidos de crusta, pipeta uma gota de três microliter de amostra em um filme hidrofóbico.Pipeta três microliters de matriz DHB diretamente na gotícula amostral. Misture as soluções com tubulação para cima e para baixo. Pipeta um microliter da mistura de amostra e matriz em um poço da placa de aço inoxidável MALDI e use a ponta pipeta para espalhar cada mistura para as bordas da amostra bem.Localmente um microliter de calibre um para um e mistura de matriz em um poço perto da amostra. Insira a placa-alvo contendo manchas de amostra seca no instrumento de tempo de voo MALDI tandem. Com a matriz DHB definida a potência laser para 95%Selecione o ganho automático do detector ideal e o modo de movimento inteligente do portador da amostra completa.Adquira o MS Spectra na faixa de 200 a 3.200 M sobre Z e adicione vários espectros de cada ponto juntos para aumentar o sinal de neuropeptídeo para a relação ruído. Encha meio copo criostat com gelatina e deixe-o solidificar à temperatura ambiente. Mantenha a gelatina líquida restante quente em um banho de água de 37 graus Celsius.Colete tecido neuronal desejado do animal e use fórceps para mergulhar imediatamente o tecido em um tubo de 0,6 mililitro contendo água deionizada por um segundo. Coloque o tecido em cima da gelatina sólida e encha o resto do copo criostat com gelatina líquida. Use fórceps para posicionar o tecido.Coloque o copo criostat em uma superfície plana e congele com gelo seco. Para a preparação da secção, separe a amostra embutida de gelatina do molde criostat, cortando o molde. Monte o tecido incorporado em um mandril criostat, canalizado uma gota de um mililitro de água desionizada no mandril e pressione imediatamente o tecido incorporado na gotícula.Uma vez congelada, mais água deionizada ao redor do tecido para fixá-la ainda mais no mandril. Selado o tecido com uma espessura aproximada de uma célula. O polegar monta cada seção em um slide de vidro revestido de óxido de lata de índio colocando um lado do slide perto da seção e colocando um dedo do outro lado do slide para aquecer lentamente o vidro e permitir que a seção grude no slide.Exportar de Novo apenas peptídeos. CSV de picos com pontuação média de confiança local maior ou igual a 75. Pesquise na lista de peptídeos por motivos de sequência conhecidos indicativos de neuropeptídeos pertencentes a famílias específicas de neuropeptídeos.Escolha uma sequência de aminoácidos hormonais pré-pro conhecidos e use a explosão de TB N para pesquisar a sequência hormonal pré-pro de consulta contra um banco de dados. Selecione o organismo alvo e altere os parâmetros do algoritmo limiar até 1000 para incluir alinhamentos de pontuação baixa. Execute o programa de explosão e, em seguida, verifique os resultados para obter altos escores de escoologia entre consultas e sequências de assunto produzindo alinhamentos significativos.Salve o arquivo FASTA contendo sequência de nucleotídeos. Traduza a sequência de nucleotídeos hormonais pré-pro em sequências de peptídeos hormonais pré-pro usando a ferramenta de tradução expasy. Para chamadas sapidus selecione mitocondrial invertebrado para código genético e execute a ferramenta.Verifique se há sequência de peptídeos de sinal e locais de decote pro hormonal nas sequências de peptídeos usando sinal P.Este é um espectro de fragmentação de um neuropeptídeo identificado com cobertura de sequência de 100% em um erro de massa de fragmento baixo com um limite máximo de 0,02 Dalton. Aqui está um espectro de um neuropeptídeo também identificado com cobertura de 100%, mas com um baixo número de íons fragmentários, portanto a confiança da identificação é baixa. Estes são os cromatógrafos de íons extraídos para um único neuropeptídeo que foi identificado em duas corridas separadas e consecutivas.Embora o tempo de retenção difere ligeiramente, isso ainda pode ser usado para quantificação sem rótulo, porque a mudança de tempo é inferior a um minuto. Este é um exemplo de um espectro de massa de varredura completa contendo um neuropeptídeo que foi rotulado dimetil resultando em uma mudança de massa dalton 4.025 entre as formas leves e pesadas do neuropeptídeo. O espectro de massa de íons fragmentos de um peptídeo sequenciado de De Novo demonstra boa cobertura de fragmentação, onde íon de fragmento B e ou Y foi observado para cada aminoácido com um erro de massa baixo de 0,02 Dalton.Isso indica que foi observado um peptídeo endógeno pertencente à família de neuropeptídeos RYMI crustáceos. Exemplos de bons pontos que tocam todas as bordas da gravação do poço são mostrados à esquerda. E exemplos de pontos ruins são mostrados à direita.Após a imagem MALDI MS de neuropeptídeos de tecidos de callinectes sapidus, foram obtidas imagens de distribuição de íons de vários valores M sobre Z correspondentes a diferentes neuropeptídeos. A otimização do solvente de extração para um determinado tipo analy é crucial. Também garantir a homogeneização completa e ajustar o método conforme necessário.Nada será detectado rio abaixo se não for extraído. Esta técnica pode fornecer uma lista fundamental de neuropeptídeos importantes que podem ser ainda mais investigados como potenciais biomarcadores, bem como fornecer informações de localização não-marcadas sem a necessidade de anticorpos.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Metabolomics irrelevantes de fontes biológicas Usando UltraPerformance cromatografia líquida de alta resolução Espectrometria de Massa (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Química

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Matrix-assisted laser dessorção / ionização Time of Flight (MALDI-TOF) espectrometria de massa Análise de proteínas intactas maior que 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Mass Spectrometric Abordagens para estudar a estrutura das proteínas e interacções em liofilizados Pós

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sequenciamento de parede planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilação) e físico (espectrometria de massa, ressonância magnética nuclear) Técnicas

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

HKUST-1 as a Heterogeneous Catalyst for the Synthesis of Vanillin

HKUST-1 como um catalisador heterogéneo para a Síntese de vanilina

Vanillin (4-hydoxy-3-methoxybenzaldehyde) is the main component of the extract of vanilla bean. The natural vanilla scent is a mixture of approximately ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Análise de respiração em tempo real usando o Nanoelectrospray secundário ionização acoplada a espectrometria de massa de alta resolução

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Síntese e análise de espectrometria de massa de Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

Um método de cromatografia de gás de Pyrolysis de duas etapas com detecção espectrométrica de massa para identificação de ingredientes de tinta de tatuagem e produtos falsificados

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework

In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework

In situ Espectroscopia FTIR como ferramenta de investigação de gás/interação sólida: Adsorpção CO2 aprimorada em água na estrutura metal-orgânica UiO-66

In situ infrared spectroscopy is an inexpensive, highly sensitive, and selective valuable tool to investigate the interaction of polycrystalline solids ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Proteômica por Espectrometria de Massas Guiada por Linhagem Celular no Embrião em Desenvolvimento (Rã)

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...