Name: multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in callinectes sapidus
Uploaded: 2022-05-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus at JoVE.com

Это исследование было поддержано Национальным научным фондом (CHE-1710140 и CHE-2108223) и Национальными институтами здравоохранения (NIH) через грант R01DK071801. A.P. был частично поддержан грантом NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. был частично поддержан Национальными институтами здравоохранения в рамках Премии Рут Л. Киршштейн Национальной исследовательской службы от Национального института сердца легких и крови в Центр сердечно-сосудистых исследований Университета Висконсина-Мэдисона (T32 HL007936). L.L. хотел бы отметить гранты NIH R56 MH110215, S10RR029531 и S10OD025084, а также финансовую поддержку от профессора выдающихся достижений Виласа и профессора Чарльза Мельбурна Джонсона с финансированием, предоставленным Исследовательским фондом выпускников Висконсина и Школой фармации Университета Висконсина-Мэдисона.

Весь описанный забор тканей был выполнен в соответствии с руководящими принципами Университета Висконсин-Мэдисон.
1. LC-ESI-MS анализ нейропептидов
<ol><li>Экстракция и обессоливание нейропептидов<ol>
<li>Перед приобретением ткани приготовьте подкисленный метанол (acMeOH...

<ol>
	<li>H&#246;kfelt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptides+-+an+overview.">Neuropeptides - an overview.</a> Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).</li><li>Radhakrishnan, V., Henry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+of+neuropeptides+in+the+sensory+spinal+cord.">Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord.</a> Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).</li><li>N&#228;ssel, D. R., Ekstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+neuropeptides+by+immunocytochemistry.">Detection of neuropeptides by immunocytochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 72, 71-101 (1997).</li><li>Martins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Neuropeptide+Y+Receptors+Modulates+Retinal+Ganglion+Cell+Physiology+and+Exerts+Neuroprotective+Actions+In+Vitro.">Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro.</a> ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).</li><li>Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuropeptide+Y+and+its+metabolites+by+high-performance+liquid+chromatography-electrospray+ionization+mass+spectrometry+and+integrated+sample+clean-up+with+a+novel+restricted-access+sulphonic+acid+cation+exchanger.">Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger.</a> Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).</li><li>Salisbury, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+MALDI-TOF+mass+spectrometry+workflow+for+Drosophila+melanogaster+differential+neuropeptidomics.">A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics.</a> Molecular Brain. 6, 60 (2013).</li><li>Schmerberg, C. M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function-driven+discovery+of+neuropeptides+with+mass+spectrometry-based+tools.">Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools.</a> Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).</li><li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics:+Mass+Spectrometry-Based+Identification+and+Quantitation+of+Neuropeptides.">Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides.</a> Genomics &amp; Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).</li><li>Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+mass+spectrometry+for+the+quantitative+analysis+of+neuropeptides.">Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides.</a> Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).</li><li>Pratavieira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+Imaging+Analysis+of+Neuropeptides+in+Africanized+Honeybee+(+Apis+mellifera)+Brain:+Effect+of+Aggressiveness.">MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness.</a> Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).</li><li>Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Effective+Sample+Preparation+Strategy+for+MALDI-MS+Imaging+of+Neuropeptide+Changes+in+the+Crustacean+Brain+Due+to+Hypoxia+and+Hypercapnia+Stress.">A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).</li><li>Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics:+Improvements+in+Mass+Spectrometry+Imaging+Analysis+and+Recent+Advancements.">Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements.</a> Current Protein &amp; Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).</li><li>Li, L., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptides+in+the+brain:+mass+spectrometry-based+measurement+approaches+and+challenges.">Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Precipitation+and+Delipidation+Enables+Efficient+Enrichment+of+Low-Molecular+Weight+Proteins+and+Peptides+from+Human+Plasma.">Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma.</a> Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAKS+DB:+de+novo+sequencing+assisted+database+search+for+sensitive+and+accurate+peptide+identification.">PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).</li><li>Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+evaluation+of+neuropeptidomic+profiles+upon+heat+stabilization+treatment+of+neuroendocrine+tissues+in+crustaceans.">Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans.</a> Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).</li><li>Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+borealis+stomatogastric+nervous+system+dissection.">Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).</li><li>DeLaney, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRESnovo:+Prescreening+Prior+to+de+novo+Sequencing+to+Improve+Accuracy+and+Sensitivity+of+Neuropeptide+Identification.">PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).</li><li>Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+neuropeptide+modulation+of+premotor+and+motor+neurons+in+the+lobster+cardiac+ganglion.">Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion.</a> Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+in+silico+transcriptome+mining+and+biological+mass+spectrometry+for+neuropeptide+discovery+in+the+Pacific+white+shrimp+Litopenaeus+vannamei.">Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei.</a> Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).</li><li>Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacean+neuropeptides.">Crustacean neuropeptides.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).</li><li>DeLaney, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques,+applications+and+perspectives+in+neuropeptide+research.">New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>Habenstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic,+peptidomic,+and+mass+spectrometry+imaging+analysis+of+the+brain+in+the+ant+Cataglyphis+nodus.">Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus.</a> Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).</li><li>Maes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+sensitivity+of+the+nano+ultra-high+performance+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometric+analysis+of+low-concentrated+neuropeptides+by+reducing+aspecific+adsorption+and+optimizing+the+injection+solvent.">Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent.</a> Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+photochemically+promoted+click+chemistry+for+enhanced+neuropeptide+visualization+and+rapid+protein+labeling.">Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling.</a> Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).</li><li>Corbi&#232;re, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+Identification+of+Bioactive+Neuropeptides+in+Vertebrates.">Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).</li><li>Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+neuropeptides+in+crustacean+hemolymph+via+MALDI+mass+spectrometry.">Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry.</a> Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).</li><li>Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andr&#233;n, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Tissue+Sample+Stabilization+and+Extraction+Strategies+for+Neuropeptidomics.">Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics.</a> Peptidomics: Methods and Strategies. , 41-49 (2018).</li><li>Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Imaging:+A+Review+of+Emerging+Advancements+and+Future+Insights.">Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights.</a> Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).</li><li>Phetsanthad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mass+spectrometry+analysis+of+neuropeptides.">Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides.</a> Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).</li><li>P&#233;rez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSroi:+A+pre-processing+tool+for+mass+spectrometry-based+studies.">MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).</li><li>Christie, A. E., Chi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+the+neuropeptidomes+of+members+of+the+Astacidea+(Crustacea,+Decapoda)+using+publicly+accessible+transcriptome+shotgun+assembly+(TSA)+sequence+data.">Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data.</a> General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).</li><li>Livnat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+d-Amino+Acid-Containing+Neuropeptide+Discovery+Funnel.">A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel.</a> Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).</li><li>Lehrer, R. I., Ganz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensins:+endogenous+antibiotic+peptides+from+human+leukocytes.">Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes.</a> Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).</li></ol>

Точная идентификация, количественная оценка и локализация нейропептидов и эндогенных пептидов, обнаруженных в нервной системе, имеют решающее значение для понимания их функции23,24. Масс-спектрометрия является мощным методом, который может позволить дос...

Нервная система сложна и требует сети нейронов для передачи сигналов по всему организму. Нервная система координирует сенсорную информацию и биологическую реакцию. Сложные и запутанные взаимодействия, участвующие в передаче сигнала, требуют множества различных сигнальных молекул, таких как нейротрансмиттеры, стероиды и нейропептиды. Поскольку нейропептиды являются наиболее разнообразными и мощными сигнальными молекулами, которые играют ключевую роль в активации физиологических реакций на стресс и другие раздражители, интересно определить их конкретную роль в этих физиологических процессах. Нейропептидная функция связана с их аминокислотной структурой, которая определяет подвижность, рецепторное взаимодействие и сродство1. Такие методы, как гистохимия, которая важна, потому что нейропептиды могут синтезироваться, храниться и высвобождаться в разных областях ткани, и электрофизиология были использованы для исследования структуры и функции нейропептидов 2,3,4, но эти методы ограничены пропускной способностью и специфичностью для разрешения огромного разнообразия последовательностей нейропептидов.
Масс-спектрометрия (МС) позволяет проводить высокопроизводительный анализ структуры и плотности нейропептидов. Это может быть выполнено с помощью различных методов МС, чаще всего жидкостной хроматографии-электрораспылительной ионизации MS (LC-ESI-MS)5 и матричной лазерной десорбции / ионизации MS (MALDI-MS)6. Используя высокоточные измерения массы и фрагментацию РС, МС обеспечивает возможность присваивать нейропептидам из сложных смесей статус последовательности аминокислот и посттрансляционной модификации (ПТМ) без априорных знаний, чтобы помочь в определении их функции 7,8. В дополнение к качественной информации, MS позволяет получать количественную информацию о нейропептидах с помощью количественного определения без меток (LFQ) или методов на основе этикеток, таких как изотопная или изобарическая маркировка9. Основные преимущества LFQ включают в себя его простоту, низкую стоимость анализа и снижение этапов подготовки образцов, что может минимизировать потери образца. Тем не менее, недостатки LFQ включают в себя увеличение затрат времени прибора, поскольку он требует нескольких технических реплик для устранения количественной ошибки от вариативности от запуска к запуску. Это также приводит к снижению способности точно количественно оценивать небольшие вариации. Методы на основе этикеток подвергаются менее систематическому изменению, поскольку несколько образцов могут быть дифференциально маркированы с использованием различных стабильных изотопов, объединены в один образец и проанализированы с помощью масс-спектрометрии одновременно. Это также увеличивает пропускную способность, хотя изотопные этикетки могут быть трудоемкими и дорогостоящими для синтеза или покупки. Спектральная сложность масс-спектров полного сканирования (MS1) также увеличивается по мере увеличения мультиплексирования, что уменьшает количество уникальных нейропептидов, которые могут быть фрагментированы и, следовательно, идентифицированы. И наоборот, изобарическая маркировка не увеличивает спектральную сложность на уровне MS1, хотя и создает проблемы для аналитов с низким содержанием, таких как нейропептиды. Поскольку изобарическое количественное определение выполняется на уровне масс-спектров фрагментов ионов (MS2), нейропептиды с низким содержанием могут быть не в состоянии быть количественно определены, поскольку для фрагментации могут быть выбраны более обильные компоненты матрицы, а выбранные могут не иметь достаточно высокого содержания для количественной оценки. С помощью изотопной маркировки количественное определение может быть выполнено для каждого идентифицированного пептида.
В дополнение к идентификации и количественной оценке, информация о локализации может быть получена РС с помощью визуализации MALDI-MS (MALDI-MSI)10. Растрируя лазер по поверхности образца, ms-спектры могут быть скомпилированы в изображение тепловой карты для каждого значения m/z . Картирование интенсивности переходного нейропептидного сигнала в различных регионах в разных условиях может предоставить ценную информацию для определения функции11. Локализация нейропептидов особенно важна, поскольку функция нейропептидов может отличаться в зависимости от местоположения12.
Нейропептиды встречаются в меньшем количестве in vivo, чем другие сигнальные молекулы, такие как нейротрансмиттеры, и, таким образом, требуют чувствительных методов для обнаружения13. Это может быть достигнуто путем удаления компонентов матрицы с более высоким содержанием, таких как липиды11,14. Дополнительные соображения для анализа нейропептидов должны быть сделаны по сравнению с обычными рабочими процессами протеомики, главным образом потому, что большинство нейропептидомных анализов опускают ферментативное пищеварение. Это ограничивает программные возможности для анализа данных нейропептидов, поскольку большинство из них были построены с помощью алгоритмов, основанных на данных протеомики и совпадениях белков, основанных на обнаружении пептидов. Тем не менее, многие программы, такие как PEAKS15, больше подходят для анализа нейропептидов из-за их возможностей секвенирования de novo. Для анализа нейропептидов необходимо учитывать несколько факторов, начиная от метода экстракции до анализа данных РС.
Протоколы, описанные здесь, включают методы пробоподготовки и диметилизотопной маркировки, сбора данных и анализа данных нейропептидов LC-ESI-MS, MALDI-MS и MALDI-MSI. С помощью репрезентативных результатов нескольких экспериментов демонстрируется полезность и способность этих методов идентифицировать, количественно оценивать и локализовать нейропептиды синих крабов, Callinectes sapidus. Чтобы лучше понять нервную систему, обычно используются модельные системы. Многие организмы не имеют полностью секвенированного генома, что препятствует всестороннему открытию нейропептидов на пептидном уровне. Чтобы смягчить эту проблему, включен протокол для идентификации новых нейропептидов и анализа транскриптомов для создания баз данных для организмов без полной информации о геноме. Все представленные здесь протоколы могут быть оптимизированы для нейропептидных образцов из любых видов, а также применены для анализа любых эндогенных пептидов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Reagents, and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>39319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borane pyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker peptide calibration mix</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary</td>
			<td>Polymicro</td>
			<td>1068150019</td>
			<td>to make nanoflow column (75 &#181;m inner diameter x 360 &#181;m outer diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat cup</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6032</td>
			<td>any cup or mold should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde - D2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>492620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214340</td>
			<td>place in 37 &#176;C water bath to melt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>15553953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies</td>
			<td>CB-90IN-S107</td>
			<td>25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS vials</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TFMSCERT5000-30LVW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol Optima LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Hydrophobic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-Indicator strips</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>109450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red phosphorus clusters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>343242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed phase C18 material</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002350</td>
			<td>manually packed into nanoflow column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wite-out pen</td>
			<td>BIC</td>
			<td>150810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Z720070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments and Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic matrix sprayer system- M5</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge - 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-401-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat- HM 550</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>956564A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant</td>
			<td>Drierite</td>
			<td>2088701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI stainless steel target plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>8280781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite XLS</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td>200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapifleX MALDI-TOF/TOF</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac - SVC100</td>
			<td>Savant</td>
			<td>SVC-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td>2510R-MTH</td>
			<td>for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB120110</td>
			<td>FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump- Alcatel 2008 A</td>
			<td>Ideal Vacuum Products</td>
			<td>P10976</td>
			<td>ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37C) - Isotemp 110</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-460-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expasy</td>
			<td>https://web.expasy.org/translate/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexAnalysis</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexControl</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEAKS Studio</td>
			<td>Bioinformatics Solutions, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td>https://scils.de/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SignalP 5.0</td>
			<td>https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tBLASTn</td>
			<td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&#38;BLAST_ 
			PROGRAMS=tblastn&#38;PAGE_ 
			TYPE=BlastSearch&#38;SHOW_ 
			DEFAULTS=on&#38;LINK_LOC 
			=blasthome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in callinectes sapidus

Нейропептиды являются сигнальными молекулами, которые регулируют почти все физиологические и поведенческие процессы, такие как развитие, размножение, потребление пищи и реакция на внешние стрессоры. Тем не менее, биохимические механизмы и полный набор нейропептидов и их функциональные роли остаются плохо изученными. Характеристика этих эндогенных пептидов затруднена огромным разнообразием в этом классе сигнальных молекул. Кроме того, нейропептиды биологически активны в концентрациях 100x - 1000x ниже, чем у нейротрансмиттеров, и склонны к ферментативной деградации после синаптического высвобождения. Масс-спектрометрия (MS) является высокочувствительным аналитическим инструментом, который может идентифицировать, количественно оценивать и локализовать аналиты без всесторонних априорных знаний . Он хорошо подходит для глобального профилирования нейропептидов и помогает в открытии новых пептидов. Из-за низкой численности и высокого химического разнообразия этого класса пептидов несколько методов пробоподготовки, параметров получения РС и стратегий анализа данных были адаптированы из методов протеомики, чтобы обеспечить оптимальную характеристику нейропептидов. Здесь описаны способы выделения нейропептидов из сложных биологических тканей для характеризации последовательностей, квантования и локализации с использованием жидкостной хроматографии (LC)-MS и матричной лазерной десорбции/ионизации (MALDI)-MS. Включен протокол подготовки базы данных нейропептидов синего краба Callinectes sapidus, организма без исчерпывающей геномной информации. Эти рабочие процессы могут быть адаптированы для изучения других классов эндогенных пептидов у разных видов с использованием различных инструментов.

Рабочий процесс подготовки образцов и анализа MS показан на рисунке 1. После рассечения нейрональной ткани проводят гомогенизацию, экстракцию и обессоливание для очистки нейропептидных образцов. Если требуется количественная оценка на основе изотопных этикеток, образ?...

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus at JoVE.com

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Масс-спектрометрическая характеристика нейропептидов обеспечивает информацию о последовательности, количестве и локализации. Этот оптимизированный рабочий процесс полезен не только для исследований нейропептидов, но и других эндогенных пептидов. Представленные здесь протоколы описывают подготовку образцов, сбор РС, анализ РС и генерацию базы данных нейропептидов с использованием LC-ESI-MS, MALDI-MS и визуализации MALDI-MS.

Многогранное масс-спектрометрическое исследование нейропептидов в Callinectes sapidus

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...

Анализ эндогенных пептидов, которые меньше, чем большинство белков, но больше, чем многие переваренные пептиды, является исследуемой областью. Этот протокол обращается к scap в рабочих процессах на основе масс-спектрометрии. Масс-спектрометрия очень чувствительна и может быть использована для нацеливания на конкретные нейропептиды, представляющие интерес, или может захватывать и обнаруживать ряд нейропептидов в образце.Количественное определение и локализация экспрессии нейропептидов масс-спектрометрией может привести к разработке пептидной терапии и открытию нейропептидных биомаркеров для различных заболеваний. Чтобы начать экстракцию нейропептидов, соберите мозговую ткань у ракообразного и с помощью щипцов немедленно поместите по одной ткани в трубку объемом 0,6 миллилитра, содержащую 20 микролитров подкисленного метанола. Добавьте в образец 150 микролитров подкисленного метанола.Установите общее время пациента Sonic на 24 секунды, время пульса на восемь секунд. Время паузы до 15 секунд амплитуды до 50% на ультразвуковом гомогенизаторе и гомогенизация образцов на льду. Центрифугируйте образец при четырех градусах Цельсия при 20 000 GS в течение 20 минут.С помощью пипетки переносят супернатант в трубку и сушат его в вакуумном концентраторе примерно при 35 градусах Цельсия. Для обессоливания восстанавливают извлеченный образец ткани в 20 микролитрах 0,1% муравьиной кислоты. Вихрьте раствор и обработайте ультразвуком на водяной бане комнатной температуры в течение одной минуты.Нанесите 0,5 микролитра образца на полоску pH, чтобы подтвердить, что pH меньше четырех. Центрифуга при четырех градусах Цельсия и 20 000 GS в течение 30 секунд. Подготовьте смачивающую уравновешивающую промывку в иллюзионных растворах.Получите 10-микролитровый обессоливающий наконечник со смолой C18. Поместите обессоливающий наконечник на 20-микролитровую пипетку, установленную на 15 микролитров. Аспирируйте наконечник три раза смачивающим раствором и три раза решением для совместной работы.Аспирировать в образце 10 раз с последующей промывкой три раза в моющем растворе, отбрасывая каждую промывку. Элюировать путем аспирации по 10 раз в каждом из иллюзионных растворов в порядке увеличения ацетонитрила. Высушите упомянутые нейропептиды в вакуумном концентраторе.Восстанавливают высушенные обессоленные нейропептиды в пяти микролитрах 0,1% муравьиной кислоты. Вихрьте раствор и обработайте его ультразвуком на водяной бане комнатной температуры в течение одной минуты. Кратко центрифуга при 2000 GS. Для обнаружения нейропептидов и тканей земной коры пипеткой на гидрофобную пленку наносится трехмикролитровая капля образца.Пипетка три микролитра матрицы DHB непосредственно на капле образца. Перемешайте растворы путем пипетки вверх и вниз. Пипетка одного микролитра смеси образца и матрицы в скважину из целевой пластины из нержавеющей стали MALDI и использование наконечника пипетки для распределения каждой смеси по краям пробной скважины.Нанесите один микролитр калибра один к одному и матричную смесь в скважину рядом с образцом. Вставьте целевую пластину, содержащую высушенные пятна для образцов, в тандемный прибор MALDI для определения времени пролета. С матрицей DHB, устанавливающей мощность лазера на 95%, выберите автоматический оптимальный коэффициент усиления детектора и интеллектуальный режим перемещения полного носителя образца образца.Получите MS Spectra в диапазоне от 200 до 3 200 М над Z и добавьте несколько спектров из каждой точки вместе, чтобы увеличить отношение нейропептидного сигнала к шуму. Наполните половину чашки криостата желатином и дайте ей затвердеть при комнатной температуре. Держите оставшийся жидкий желатин теплым на водяной бане 37 градусов по Цельсию.Соберите желаемую нейрональную ткань у животного и используйте щипцы, чтобы немедленно окунуть ткань в 0,6 миллилитровую трубку, содержащую деионизированную воду на одну секунду. Поместите ткань поверх твердого желатина и заполните остальную часть чашки криостата жидким желатином. Используйте щипцы для позиционирования ткани.Поместите чашку криостата на ровную поверхность и заморозьте сухим льдом. Для подготовки к разделению отделите желатиновый встроенный образец от криостатной формы, отрезав форму. Установите внедренную ткань на криостатный патрон, пипетируя одну миллилитровую каплю деионизированной воды на патрон и немедленно надавливая на внедренную ткань на каплю.После замораживания пипетки, больше деионизированной воды вокруг ткани, чтобы дополнительно закрепить ее на патроне. Срез ткани приблизительной толщины одной клетки. Большой палец установит каждую секцию на стеклянную заставку с оксидом индия, поместив одну сторону слайда рядом с секцией и поместив палец на другую сторону слайда, чтобы медленно согреть стекло и позволить секции прилипнуть к слайду.Экспорт De Novo только пептиды. CSV от пиков со средним локальным показателем достоверности более или равным 75. Поиск в списке пептидов для известных мотивов последовательности, указывающих на нейропептиды, принадлежащие к конкретным семействам нейропептидов.Выберите известную последовательность аминокислот пре-про гормона, представляющую интерес, и используйте TB blast N для поиска по запросу пре-про гормональной последовательности по базе данных. Выберите целевой организм и измените пороговые параметры алгоритма ожидания на 1000, чтобы включить выравнивание низких баллов. Запустите программу blast, а затем проверьте результаты на наличие высоких оценок гомологии между последовательностями запросов и субъектов, что приводит к значительным выравниваниям.Сохраните файл FASTA, содержащий нуклеотидную последовательность. Переведите пре-про гормональную нуклеотидную последовательность в пре-про гормональные пептидные последовательности с помощью инструмента Expasy translate. Для callinectes sapidus выберите митохондриальные беспозвоночные для генетического кода и запустите инструмент.Проверьте наличие сигнальных пептидных последовательностей и участков расщепления про-гормона в пептидных последовательностях с помощью сигнала P. Это спектр фрагментации нейропептида, идентифицированный со 100%-ным покрытием последовательности при низкой погрешности массы фрагмента с максимальным пределом 0,02 Дальтона. Вот спектр нейропептида, также идентифицированный со 100% охватом последовательности, но с низким количеством фрагментов ионов, поэтому достоверность идентификации низкая. Это извлеченные ионные хроматограммы для одного нейропептида, который был идентифицирован в двух отдельных и последовательных прогонах.Несмотря на то, что время удержания немного отличается, его все равно можно использовать для количественной оценки без меток, поскольку сдвиг времени составляет менее одной минуты. Это пример полного спектра сканирования, содержащего нейропептид, который был помечен диметилом, что привело к смещению массы 4,025 Дальтона между легкой и тяжелой формами нейропептида. Массовый спектр фрагментов ионов секвенированного пептида De Novo демонстрирует хорошее покрытие фрагментации, где для каждой аминокислоты наблюдался ион фрагмента B и/или Y с погрешностью низкой массы 0,02 Дальтона.Это свидетельствует о том, что наблюдался эндогенный пептид, относящийся к семейству нейропептидов ракообразных RYMI. Примеры хороших пятен, которые касаются всех краев гравировки скважины, показаны слева. А примеры плохих пятен показаны справа.После визуализации MALDI MS нейропептидов из тканей callinectes sapidus были получены изображения распределения ионов различных значений M над Z, соответствующие различным нейропептидам. Оптимизация экстракционного растворителя для конкретного типа анализируемого вещества имеет решающее значение. Также обеспечьте полную гомогенизацию и настройте метод по мере необходимости.Ничто не будет обнаружено в потоке, если оно не будет извлечено. Этот метод может предоставить основополагающий список важных нейропептидов, которые могут быть дополнительно исследованы в качестве потенциальных биомаркеров, а также предоставить информацию о нецелевой локализации без необходимости в антителах.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Нецелевые Метаболомики из биологических источников Использование UltraPerformance жидкостной хроматографии высокого разрешения масс-спектрометрии (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Матрица-лазерной десорбцией / ионизацией Время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрический анализ интактных белков Больше, чем 100 кДа

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Масс-спектрометрический подходы к изучению структуры белка и взаимодействия в лиофилизированных порошков

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Секвенирование растений стены Heteroxylans Использование ферментативной, химической (метилирование) и физический (масс-спектрометрия, ядерный магнитный резонанс) Методики

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

HKUST-1 as a Heterogeneous Catalyst for the Synthesis of Vanillin

HKUST-1 в качестве гетерогенного катализатора для синтеза ванилина

Vanillin (4-hydoxy-3-methoxybenzaldehyde) is the main component of the extract of vanilla bean. The natural vanilla scent is a mixture of approximately ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Анализ реального времени дыхание с помощью вторичных Nanoelectrospray ионизации в сочетании с масс-спектрометрии высокого разрешения

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Синтез и анализ масс-спектрометрии Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

Двухступенчатый пиролиза-газ хроматографии метод с масс спектрометрическое обнаружение для идентификации татуировки чернила ингредиенты и контрафактной продукции

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework

In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework

На месте FTIR Spectroscopy как инструмент для исследования газа / твердого взаимодействия: Водно-улучшенная CO2 Адсорбция в UiO-66 Металл-органические рамки

In situ infrared spectroscopy is an inexpensive, highly sensitive, and selective valuable tool to investigate the interaction of polycrystalline solids ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Протеомика масс-спектрометрии под контролем клеточных линий у развивающегося эмбриона (лягушки)

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...