Langsgående intravital mikroskopi ved hjælp af et brystbilledvindue med udskifteligt låg

Brystkirtlen er meget dynamisk og gennemgår flere runder af ombygning gennem hele livet. Vores protokol gør det muligt at fange den cellulære dynamik, der driver vævsomlejringer i den sunde og syge brystkirtel. Vores brystbilleddannelsesvindue med et udskifteligt låg gør det muligt at udføre langsgående intravital billeddannelse af brystkirtlen over lange tidsperioder, op til flere uger.

Det udskiftelige låg på brystdannelsesvinduet sikrer optimale billeddannelsesforhold til enhver tid og tillader vævsmanipulation eller lægemiddeladministration mellem billeddannelsessessioner. Vores metode giver ikke kun indsigt i sund brystkirtelbiologi, men giver os også mulighed for at studere brysttumorinitiering og progression på enkeltcelleniveau. Begynd med at placere låget på brystbilledvinduet på en steril overflade og påfør cyanoacrylatklæbende lim omkring hele kantlågets omkreds.

Placer forsigtigt et 10 millimeter rundt glasdæksel oven på låget. Brug en steril træpind til at placere glasdækslet, og påfør en vis kraft for at skubbe det ned for at sikre en lufttæt tætning mellem glasdækslet og lågets ramme. Sørg for, at glasset ikke dækker hullerne i lågets arme.

Desinficer lågene og brystkassen ved at nedsænke dem i 80% ethanol i mindst 30 minutter i en lukket petriskål. Brug en bomuldsspids gennemblødt i acetone til at fjerne den overskydende cyanoacrylatklæbende lim på glasdækslet. For at forberede musen til operation skal du barbere området omkring den fjerde brystkirtel ved hjælp af et barberblad.

Brug den fjerde brystvorte som et vartegn og fjern de løse hår ved hjælp af klæbebånd. Udfør en pote tilbagetrækningstest for at kontrollere, om dyret er tilstrækkeligt bedøvet. Løft forsigtigt huden ved hjælp af fine Graefe-tang og brug en lille fjedersaks til at lave et 10-15 millimeter diagonalt snit i huden oven på den fjerde brystfedtpude Brug den fjerde brystvorte som et orienteringspunkt, og sørg for ikke at skære eller beskadige peritoneum eller brystkirtlen.

Adskil huden fra brystfedtpuden og underliggende vævslag ved hjælp af stump dissektion på op til fem til otte millimeter rundt om snitlinjen for at skabe en lomme, der passer til brystdannelsesvinduerammen. Definer interesseområdet eller ROI baseret på brystvævets makroskopiske egenskaber, herunder placeringen af lymfeknudepunktet eller en tumorlæsion. Prøv at holde ROI centralt med hensyn til snittet.

Tag brystdannelsesvinduet op ved hjælp af sterile pincet og test, om snittet er stort nok til at indsætte vinduet. Hvis det er nødvendigt, skal du forstørre snittet lidt, indtil brystbilleddannelsesvinduet passer ind. Fjern vinduet og brug en 5-0 silke sutur til at placere en pung snor sutur en til to millimeter væk fra kanten af snittet startende fra den kaudale ende og udefra til indersiden af huden.

Flyt cirka fem millimeter op langs snittet og før suturtråden gennem huden indefra og udefra. Gentag denne procedure langs kanten af snittet, hvorved der skabes en cirkulær sutur bestående af fem til seks sløjfer. Den endelige udgang af suturtråden skal placeres cirka to til fem millimeter væk fra den første indgang.

Sæt brystbilledet inde i snittet, og brug Graefe-pincetten til forsigtigt at placere huden i vinduets rille. Sørg for at lade suturens løkker stå udenfor. Træk i løkkerne på pungstrengssuturen, og træk forsigtigt i begge ender af suturen for at stramme den i rillen i brystdannelsesvinduet.

Bind af med kirurgiske knuder og skær overskydende tråd væk. Brug et tandstikker til at påføre vaselin på vinduets indre kant og undgå det underliggende væv. Skub forsigtigt vinduesrammen nedad med sterile pincet og placer låget i vinduesrammen.

Dette vil undgå et volumen luft mellem brystkirtelvævet og brystdannelsens vindueslåg. Placer spidserne af de tynde tang gennem hullerne i lågets arme og stram låget ved at dreje det med uret. Hvis der er noget luft tilbage efter stramning af låget, skal du indføre en steril insulinnål gennem huden i hulrummet mellem brystvævet og låget og langsomt trække stemplet ud og derved skabe et vakuum mellem brystkirtelvævet og brystdannelsesvinduets låg.

Nu kan lymfeknuden let observeres efter denne procedure. Undersøg tilstanden af brystdannelsesvinduesrammen og låget, herunder suturernes stabilitet eller enhver potentiel skade på låget. Placer musen på indlægget på en sådan måde, at brystbilleddannelsesvinduet falder i hullet i billedboksindlægget.

Påfør halvgennemsigtig og papirtape over bagsiden af musen for at stabilisere musen og reducere vævsbevægelse på grund af åndedræt. Til billeddannelsessessioner, der er større end tre timer, skal du placere en fleksibel nål subkutant i musens hals og fastgøre den med papirtape. Fastgør en 10 millimeter sprøjte med en næringsblanding til et fleksibelt silikonerør og skub næringsblandingen, indtil den når enden af røret.

Tilslut silikonerøret til den fleksible nål, og injicer 50 mikroliter af den infunderede opløsning hvert 30. minut. Placer låget over billedkassen for at lukke det. Fastgør derefter billeddannelsesboksen i mikroskopets fase.

Kontroller, at musen er stabil inde i billeddannelsesboksen. Definer interesseområdet ved hjælp af mikroskopets epifluorescensmodus og anvend mikroskopindstillingerne. Brug spiralfunktionen i billedbehandlingssoftwarens navigatortilstand til at generere en stor oversigtsfeltscanning og oprette et referencekort over vævet.

Definer interesseområdet i spiraloversigten, og definer derefter de øvre og nederste Z-planer for at bestemme Z-stakken. Tryk på Start for at få de detaljerede tredimensionelle eller firedimensionelle Z-stakke af vævet. Placer spidserne af den tynde tang gennem brystdannelsesvindueshullerne i lågets arme og løsn låget ved at dreje mod uret.

Alternativt kan vævet manipuleres eller omplaceres ved hjælp af sterile stumpe tang for at optimere billeddannelsesbetingelserne for den specifikke interesseregion. Påfør vaselin på den indre kant af brystbilleddannelsesvinduet, undgå det underliggende væv. Skub forsigtigt vinduesrammen nedad med sterile pincet og placer låget i vinduesrammen.

Til sidst placeres spidserne af de tynde tang gennem hullerne i lågets arme og lys låget ved at dreje det med uret. Pubertal Rosa26 Cre/ERT2 Rosa26-membran tomat-membran GFP mus blev injiceret med en lav dosis tamoxifen, hvilket førte til Cre-medieret rekombination af Rosa26-membrane tomat-membran GFP allelen. Musene blev afbildet på dag et, tre og fem for at følge de dynamiske ændringer i den udviklende brystkirtel.

De repræsentative billeder viser 3D-gengivelsen af en langstrakt og forgrenet brystkanal over flere dage afbildet gennem et brystbilledvindue. Enkelt Z-plan billeder af forgreningsspidsen og den aflange gren er vist her. Enkeltceller i stroma er fremhævet med hvide stjerner.

De repræsentative billeder viser musens inguinale lymfeknude afbildet gennem et brystbilledvindue. Den anden harmoniske generation er afbildet i grønt. 3D-gengivne billeder af en brystkanalstruktur af en voksen kvindelig E-cadherin-membran CFP-mus over flere på hinanden følgende dage vises her.

Kollagen I-mønsteret blev brugt til at spore det samme INVESTERINGSAFKAST, og E-cadherin-membranens CFP-signal blev brugt til at markere duktalcellerne. Kikume grønrøde mus blev afbildet på dag nul før og efter udsættelse for violet lys. Billeddannelsessessionerne blev gentaget på dag to, seks og 10 efter konvertering.

Det samme område af brystkirtlen blev afbildet gennem et brystbilledvindue i 10 dage. Mindre regioner blev fotokonverteret på dag nul og viste en lignende fortyndingshastighed af Kikume røde signal over tid, hvilket indikerer en lige omsætningshastighed i hele epitelet. Zoombilleder af de angivne regioner viser proliferativ heterogenitet på mobilniveau seks og 10 dage efter fotokonvertering.

Kvantificering af det røde til grønne forhold mellem forskellige celler 10 dage efter fotokonvertering afslørede meget variable fortyndingshastigheder for nogle celler inden for det samme duktale mikromiljø. Et afgørende trin i denne procedure er at åbne låget mellem billeddannelsessessionerne. Denne unikke funktion af vinduet forbedrer billeddannelsesbetingelserne og giver mulighed for langsgående billeddannelse af vævet.

Brystbilleddannelsesvinduet med et udskifteligt låg vil lette nye spørgsmål vedrørende in vivo, hurtigtvirkende lægemiddeltest og screening inden for tumorinitiering og progression i musepattekirtlen.