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January 20th, 2022
DOI :
January 20th, 2022
•0:05
Introduction
1:03
Preparation of the R.MIW
2:13
R.MIW Implantation
5:19
Repeated Intravital Microscopy Through the R.MIW
7:03
Opening and Closing the Lid of the R.MIW in Between Imaging Sessions
7:52
Results: Multi-Day IVM of Mammary Gland Remodeling
10:11
Conclusion
Transcript
स्तन ग्रंथि अत्यधिक गतिशील है और जीवन भर रीमॉडेलिंग के कई दौर से गुजरती है। हमारे प्रोटोकॉल स्वस्थ और रोगग्रस्त स्तन ग्रंथि में ऊतक पुनर्व्यवस्था ड्राइविंग सेलुलर गतिशीलता पर कब्जा करने की अनुमति देता है। एक बदली ढक्कन के साथ हमारी स्तन इमेजिंग विंडो कई हफ्तों तक लंबे समय तक स्तन ग्रंथि के अनुदैर्ध्य इंट्रावाइटल इमेजिंग करने में सक्षम बनाती है।
स्तन इमेजिंग विंडो का बदली ढक्कन हर समय इष्टतम इमेजिंग स्थितियों को सुनिश्चित करता है और इमेजिंग सत्रों के बीच ऊतक हेरफेर या दवा प्रशासन की अनुमति देता है। हमारी विधि न केवल स्वस्थ स्तन ग्रंथि जीव विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है, बल्कि हमें एकल-कोशिका स्तर पर स्तन ट्यूमर दीक्षा और प्रगति का अध्ययन करने की भी अनुमति देती है। एक बाँझ सतह पर स्तन इमेजिंग खिड़की के ढक्कन को रखकर और पूरे रिम ढक्कन परिधि के चारों ओर साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला गोंद लागू करके शुरू करें।
ढक्कन के ऊपर ध्यान से 10 मिलीमीटर गोल ग्लास कवर पर्ची रखें। ग्लास कवर पर्ची की स्थिति के लिए एक बाँझ लकड़ी की छड़ी का उपयोग करें और ग्लास कवर पर्ची और ढक्कन के फ्रेम के बीच एक एयरटाइट सील सुनिश्चित करने के लिए इसे नीचे धकेलने के लिए कुछ बल लागू करें। सुनिश्चित करें कि कांच ढक्कन की बाहों में छेद को कवर नहीं करता है।
ढक्कन और स्तन इमेजिंग विंडो को बंद पेट्री डिश में कम से कम 30 मिनट के लिए 80% इथेनॉल में डुबोकर कीटाणुरहित करें। ग्लास कवर स्लिप पर अतिरिक्त साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला गोंद को हटाने के लिए एसीटोन में भिगोए गए कपास टिप का उपयोग करें। सर्जरी के लिए माउस तैयार करने के लिए, एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर चौथे स्तन ग्रंथि के आसपास के क्षेत्र दाढ़ी।
एक मील का पत्थर के रूप में चौथे निप्पल का उपयोग करें और चिपचिपा टेप का उपयोग करके ढीले बालों को हटा दें। यह सत्यापित करने के लिए एक पंजा वापसी परीक्षण करें कि क्या जानवर पर्याप्त रूप से संवेदनाहारी है। धीरे ठीक ग्रेफ संदंश का उपयोग कर त्वचा लिफ्ट और चौथे स्तन वसा पैड के शीर्ष पर त्वचा में एक 10 से 15 मिलीमीटर विकर्ण चीरा बनाने के लिए छोटे वसंत कैंची का उपयोग करें एक अभिविन्यास बिंदु के रूप में चौथे निप्पल का उपयोग करें और सुनिश्चित करें कि पेरिटोनियम या स्तन ग्रंथि को काटने या नुकसान न पहुंचाएं।
स्तन इमेजिंग विंडो फ्रेम को फिट करने के लिए एक जेब बनाने के लिए चीरा लाइन के चारों ओर पांच से आठ मिलीमीटर तक के कुंद विच्छेदन का उपयोग करके स्तन वसा पैड और अंतर्निहित ऊतक परतों से त्वचा को अलग करें। लिम्फ नोड या ट्यूमर घाव के स्थान सहित स्तन ऊतक की मैक्रोस्कोपिक विशेषताओं के आधार पर क्षेत्र-ब्याज, या आरओआई को परिभाषित करें। चीरा के संबंध में आरओआई को केंद्रीय रखने की कोशिश करें।
बाँझ संदंश का उपयोग स्तन इमेजिंग खिड़की उठाओ और परीक्षण करें कि चीरा खिड़की डालने के लिए काफी बड़ा है या नहीं। यदि आवश्यक हो, तो स्तन इमेजिंग विंडो फिट होने तक चीरा को थोड़ा बढ़ाएं। खिड़की को निकालें और पुच्छल छोर से शुरू होने वाले चीरे के किनारे से एक से दो मिलीमीटर दूर और त्वचा के बाहर से अंदर तक एक पर्स स्ट्रिंग सिवनी रखने के लिए 5-0 रेशम सिवनी का उपयोग करें।
चीरा के साथ लगभग पांच मिलीमीटर ऊपर ले जाएं और अंदर से बाहर तक त्वचा के माध्यम से सिवनी धागे को पास करें। चीरा के किनारे के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं, जिससे पांच से छह छोरों से मिलकर एक गोलाकार सिवनी बन ती है। सिवनी धागे का अंतिम निकास पहले प्रवेश द्वार से लगभग दो से पांच मिलीमीटर दूर स्थित होना चाहिए।
चीरा के अंदर स्तन इमेजिंग खिड़की फिट और ध्यान से खिड़की के नाली में त्वचा जगह करने के लिए ग्रेफ संदंश का उपयोग करें। सिवनी के छोरों को बाहर छोड़ना सुनिश्चित करें। पर्स स्ट्रिंग सिवनी के छोरों को खींचें और स्तन इमेजिंग खिड़की के नाली में कसने के लिए सीवन के दोनों सिरों को धीरे से खींचें।
सर्जिकल समुद्री मील के साथ बांधें और अतिरिक्त धागे को काट लें। अंतर्निहित ऊतक से परहेज करते हुए, खिड़की के आंतरिक रिम पर पेट्रोलियम जेली लागू करने के लिए टूथपिक का उपयोग करें। धीरे बाँझ संदंश के साथ खिड़की के फ्रेम नीचे की ओर धक्का और खिड़की के फ्रेम में ढक्कन की स्थिति।
यह स्तन ग्रंथि ऊतक और स्तन इमेजिंग खिड़की के ढक्कन के बीच हवा की मात्रा से बचेगा। ढक्कन की बाहों में छेद के माध्यम से पतली संदंश की युक्तियों को रखें और इसे दक्षिणावर्त घुमाकर ढक्कन को कस लें। यदि ढक्कन को कसने के बाद कुछ हवा बनी रहती है, तो स्तन ऊतक और ढक्कन के बीच गुहा में त्वचा के माध्यम से एक बाँझ इंसुलिन सुई पेश करें और धीरे-धीरे सवार को बाहर निकालें, जिससे स्तन ग्रंथि ऊतक और स्तन इमेजिंग खिड़की के ढक्कन के बीच एक वैक्यूम बन जाता है।
अब इस प्रक्रिया के बाद लिम्फ नोड को आसानी से देखा जा सकता है। स्तन इमेजिंग खिड़की फ्रेम और ढक्कन की स्थिति का निरीक्षण करें, जिसमें टांके की स्थिरता या ढक्कन को कोई संभावित नुकसान शामिल है। जड़ना पर माउस को इस तरह से रखें कि स्तन इमेजिंग विंडो इमेजिंग बॉक्स जड़ना के छेद में गिर जाती है।
माउस को स्थिर करने और श्वसन के कारण ऊतक गति को कम करने के लिए माउस के पीछे अर्ध-पारदर्शी और पेपर टेप लागू करें। तीन घंटे से अधिक इमेजिंग सत्रों के लिए, माउस की गर्दन में एक लचीली सुई चमड़े के नीचे रखें और इसे पेपर टेप के साथ सुरक्षित करें। एक लचीली सिलिकॉन ट्यूब के लिए एक पोषक तत्व मिश्रण के साथ एक 10 मिलीमीटर सिरिंज संलग्न करें और पोषक तत्व मिश्रण को तब तक धक्का दें जब तक कि यह ट्यूब के अंत तक न पहुंच जाए।
सिलिकॉन ट्यूब को लचीली सुई से कनेक्ट करें और हर 30 मिनट में संक्रमित समाधान के 50 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें। इसे बंद करने के लिए इमेजिंग बॉक्स पर ढक्कन रखें। फिर, माइक्रोस्कोप के चरण में इमेजिंग बॉक्स को सुरक्षित करें।
सत्यापित करें कि माउस इमेजिंग बॉक्स के अंदर स्थिर है। माइक्रोस्कोप के एपिफ्लोरेसेंस मोड का उपयोग करके ब्याज के क्षेत्र को परिभाषित करें और माइक्रोस्कोप सेटिंग्स लागू करें। इमेजिंग सॉफ्टवेयर नेविगेटर मोड में सर्पिल फ़ंक्शन का उपयोग एक बड़ा अवलोकन टाइल स्कैन उत्पन्न करने और ऊतक का संदर्भ मानचित्र बनाने के लिए करें।
सर्पिल अवलोकन के भीतर क्षेत्र के हितों को परिभाषित करें और फिर जेड स्टैक निर्धारित करने के लिए ऊपरी और निचले जेड विमानों को परिभाषित करें। ऊतक के विस्तृत त्रि-आयामी या चार-आयामी जेड ढेर प्राप्त करने के लिए प्रारंभ दबाएं। ढक्कन की बाहों में स्तन इमेजिंग खिड़की छेद के माध्यम से पतली संदंश की युक्तियों रखें और विरोधी दक्षिणावर्त में घुमाकर ढक्कन को ढीला करें।
वैकल्पिक रूप से, ऊतक में हेरफेर किया जा सकता है या विशिष्ट क्षेत्र के ब्याज के लिए इमेजिंग शर्तों का अनुकूलन करने के लिए बाँझ कुंद संदंश का उपयोग कर पुनर्स्थापित किया जा सकता है। अंतर्निहित ऊतक से परहेज, स्तन इमेजिंग खिड़की के आंतरिक रिम के लिए पेट्रोलियम जेली लागू करें। धीरे बाँझ संदंश के साथ खिड़की के फ्रेम नीचे की ओर धक्का और खिड़की के फ्रेम में ढक्कन की स्थिति।
अंत में, ढक्कन की बाहों के छेद के माध्यम से पतली संदंश की युक्तियों को रखें और इसे दक्षिणावर्त घुमाकर ढक्कन को हल्का करें। ईआरटी 2 रोजा 26-झिल्ली टमाटर-झिल्ली जीएफपी चूहों को टैमोक्सीफेन की कम खुराक के साथ इंजेक्ट किया गया था, जिससे रोजा 26-झिल्ली टमाटर-झिल्ली जीएफपी एलील का क्रे-मध्यस्थता पुनर्संयोजन हुआ। विकासशील स्तन ग्रंथि में गतिशील परिवर्तनों का पालन करने के लिए चूहों को एक, तीन और पांच दिनों में चित्रित किया गया था।
प्रतिनिधि छवियां एक स्तन इमेजिंग विंडो के माध्यम से इमेज किए गए कई दिनों में एक लम्बी और ब्रांचिंग स्तन वाहिनी के 3 डी प्रतिपादन को दिखाती हैं। ब्रांचिंग टिप और लम्बी शाखा की एकल जेड-प्लेन छवियां यहां दिखाई गई हैं। स्ट्रोमा में एकल कोशिकाओं को सफेद तारांकन द्वारा हाइलाइट किया जाता है।
प्रतिनिधि छवियां स्तन इमेजिंग विंडो के माध्यम से इमेज किए गए माउस के वंक्षण लिम्फ नोड को दिखाती हैं। दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी को हरे रंग में दर्शाया गया है। लगातार कई दिनों में एक वयस्क महिला ई-कैडरिन झिल्ली सीएफपी माउस की स्तन नलिका संरचना की 3 डी-रेंडर की गई छवियां यहां दिखाई गई हैं।
कोलेजन मैं पैटर्न का उपयोग उसी आरओआई को वापस लेने के लिए किया गया था और ई-कैडरिन झिल्ली सीएफपी सिग्नल का उपयोग डक्टल कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए किया गया था। किकुमे हरे-लाल चूहों को वायलेट प्रकाश के संपर्क में आने से पहले और बाद में दिन शून्य पर चित्रित किया गया था। रूपांतरण के बाद इमेजिंग सत्र दो, छह और 10 दिनों में दोहराए गए थे।
स्तन ग्रंथि के एक ही क्षेत्र को 10 दिनों के लिए स्तन इमेजिंग विंडो के माध्यम से चित्रित किया गया था। छोटे क्षेत्रों को शून्य दिन पर फोटो-परिवर्तित किया गया था और समय के साथ किकुमे लाल सिग्नल की एक समान कमजोर पड़ने की दर दिखाई दी, जो पूरे उपकला में समान कारोबार दर का संकेत देती है। संकेतित क्षेत्रों की ज़ूम छवियां फोटो-रूपांतरण के छह और 10 दिनों के बाद सेलुलर स्तर पर प्रसार विषमता दिखाती हैं।
फोटो रूपांतरण के 10 दिनों बाद विभिन्न कोशिकाओं के लाल से हरे रंग के अनुपात की मात्रा का ठहराव एक ही डक्टल माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर कुछ कोशिकाओं की अत्यधिक चर कमजोर पड़ने की दर का पता चला। इस प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण कदम इमेजिंग सत्रों के बीच ढक्कन खोल रहा है। खिड़की की यह अनूठी विशेषता इमेजिंग स्थितियों में सुधार करती है और ऊतक के अनुदैर्ध्य इमेजिंग की अनुमति देती है।
एक बदली ढक्कन के साथ स्तन इमेजिंग विंडो माउस स्तन ग्रंथि में ट्यूमर दीक्षा और प्रगति के क्षेत्र में विवो, तेजी से अभिनय दवा परीक्षण और स्क्रीनिंग के बारे में उपन्यास प्रश्नों की सुविधा प्रदान करेगा।
यह प्रोटोकॉल एक बदली ढक्कन (आर.एमआईडब्ल्यू) के साथ एक उपन्यास स्तन इमेजिंग विंडो का वर्णन करता है। आर.एमआईडब्ल्यू के आरोपण के बाद इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी विभिन्न विकास चरणों के दौरान सेलुलर रिज़ॉल्यूशन के साथ स्वस्थ और रोगग्रस्त स्तन ग्रंथि के अनुदैर्ध्य और बहु-दिवसीय इमेजिंग की अनुमति देता है।
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