乳腺は非常に動的であり、生涯を通じて改造の複数のラウンドを受けます。私たちのプロトコルは、健康な乳腺と病気の乳腺における組織再配列を駆動する細胞ダイナミクスを捉えることを可能にします。交換可能な蓋を備えた当社の乳腺イメージングウィンドウは、数週間までの長期間にわたって乳腺の縦方向のインバイタル内イメージングを行うことができます。
乳房イメージングウィンドウの交換可能な蓋は、常に最適なイメージング条件を保証し、イメージングセッション間の組織操作または薬物投与を可能にします。私たちの方法は、健康な乳腺生物学への洞察を提供するだけでなく、単一細胞レベルで乳腺腫瘍の開始と進行を研究することを可能にします。まず、乳房造影窓の蓋を滅菌面に置き、リム蓋の周囲全体にシアノアクリレート接着剤を塗布します。
10 mm の丸いガラスカバースリップを蓋の上に慎重に置きます。滅菌した木の棒を使用してガラスカバースリップを配置し、ガラスカバースリップと蓋のフレームの間に気密シールを確保するために、押し下げるために力を加えます。ガラスが蓋の腕の穴を覆っていないことを確認してください。
蓋と乳房のイメージングウィンドウを消毒するには、閉じたペトリ皿で80%エタノールに少なくとも30分間浸します。アセトンに浸した綿の先端を使用して、ガラスカバースリップ上の余分なシアノアクリレート接着剤接着剤を取り除きます。手術のためにマウスを準備するために、カミソリの刃を使用して第4乳腺の周りの領域を剃る。
4番目の乳首を目印にし、粘着テープでゆるい毛を取り除きます。動物が適切に麻酔されているかどうかを確認するために足の撤回試験を行います。細かい鉗子を使って皮膚をやさしく持ち上げ、小さなスプリングハサミを使って4番目の乳房脂肪パッドの上に皮膚に10〜15ミリメートルの対角線切開を行います 第4乳首を向きのポイントとして使用し、腹膜や乳腺を切断または損傷しないようにしてください。
切開ラインの周囲に最大5〜8ミリメートルの鈍い解剖を使用して、乳房脂肪パッドおよび下層の組織層から皮膚を分離し、乳房イメージング窓枠に収まるポケットを作成する。リンパ節または腫瘍病変の位置を含む乳腺組織の巨視的特徴に基づいて、関心領域またはROIを定義する。切開に関してROIを中心に保つようにしてください。
滅菌鉗子を使用して乳房イメージングウィンドウを拾い上げ、切開部がウィンドウを挿入するのに十分な大きさであるかどうかをテストします。必要に応じて、乳房の画像検査窓が収まるまで切開部をわずかに拡大します。窓を取り外し、5-0シルク縫合糸を使用して、尾端から始まり、皮膚の外側から内側まで、切開部の端から1〜2ミリメートル離れたところに財布の紐縫合糸を配置する。
切開部に沿って約5ミリメートル上に移動させ、縫合糸を皮膚の内側から外側に通す。切開部の縁に沿ってこの手順を繰り返し、それによって5〜6個のループからなる円形の縫合糸を作成する。縫合糸の最終出口は、最初の入り口から約2〜5ミリメートル離れた場所に配置する必要があります。
乳房のイメージングウィンドウを切開部内に収め、グレーフ鉗子を使用して、窓の溝に皮膚を慎重に配置します。縫合糸のループを外側に残してください。財布の紐縫合糸のループを引っ張り、縫合糸の両端を優しく引っ張って乳房造影窓の溝に締め付けます。
外科用結び目で結び、余分な糸を切り取ります。爪楊枝を使用して、ワセリンを窓の内側の縁に塗布し、下層の組織を避けます。滅菌鉗子で窓枠をゆっくりと下に押し下げ、蓋を窓枠に入れます。
これにより、乳腺組織と乳房画像窓蓋との間の空気の体積が回避される。蓋の腕の穴に細い鉗子の先端を置き、時計回りにひねって蓋を締めます。蓋を締めた後に空気が残っている場合は、皮膚を通して乳房組織と蓋の間の空洞に滅菌インスリン針を導入し、プランジャーをゆっくりと引き出して、乳腺組織と乳腺イメージング窓の蓋との間に真空を作り出す。
今、リンパ節は、この手順の後に容易に観察することができます.乳房の画像窓枠と蓋の状態を検査し、縫合糸の安定性や蓋の潜在的な損傷を含めます。乳房の撮像窓が撮像ボックスインレイの穴に落ちるように、マウスをインレイの上に置きます。
マウスの背面に半透明の紙テープを貼り、マウスを安定させ、呼吸による組織運動を軽減します。3 時間以上のイメージング セッションの場合は、マウスの首に柔軟な針を皮下に置き、紙テープで固定します。栄養ミックスの入った10ミリメートルのシリンジを柔軟なシリコーンチューブに取り付け、チューブの端に達するまで栄養ミックスを押します。
シリコーンチューブを柔軟な針に接続し、30分ごとに50マイクロリットルの注入溶液を注入する。イメージングボックスの上に蓋をして閉じます。次いで、顕微鏡のステージに撮像ボックスを固定する。
マウスがイメージングボックス内で安定していることを確認します。顕微鏡の落射蛍光モードを使用して関心領域を定義し、顕微鏡設定を適用します。イメージングソフトウェアナビゲータモードでスパイラル機能を使用して、大きな概観タイルスキャンを生成し、組織の参照マップを作成します。
スパイラル概要内の関心領域を定義し、Z スタックを決定するために上下の Z 平面を定義します。開始を押して、組織の詳細な3次元または4次元Zスタックを取得します。薄い鉗子の先端を蓋の腕の乳房造影窓の穴に通し、反時計回りにねじってふたを緩めます。
あるいは、滅菌鈍鉗子を使用して組織を操作または再配置して、特定の関心領域の画像化条件を最適化することができます。ワセリンを乳房イメージングウィンドウの内側の縁に塗布し、下層の組織を避けます。滅菌鉗子で窓枠をゆっくりと下に押し下げ、蓋を窓枠に入れます。
最後に、薄い鉗子の先端を蓋の腕の穴に通し、時計回りにねじってふたを軽くします。思春期Rosa26 Cre/ERT2 Rosa26膜トマト膜GFPマウスに低用量のタモキシフェンを注射し、Rosa26膜トマト膜GFP対立遺伝子のCre媒介組換えをもたらした。マウスを1日目、3日目、および5日目に画像化し、発達中の乳腺の動的変化を追跡した。
代表的な画像は、乳腺イメージングウィンドウを通して画像化された数日間にわたる細長く枝分かれした乳管の3Dレンダリングを示しています。分岐先端と細長い枝の単一Z平面画像がここに示されている。間質内の単一細胞は、白いアスタリスクで強調表示されている。
代表的な画像は、乳房画像化窓を通して画像化されたマウスの鼠径リンパ節を示す。第2高調波発生は緑色で示されています。複数の連続した数日間にわたる成体雌E-カドヘリン膜CFPマウスの乳腺管構造の3Dレンダリング画像がここに示されている。
コラーゲンIパターンは、同じROIをたどるために使用され、E-カドヘリン膜CFPシグナルは、乳管細胞をマークするために使用された。キクメ緑赤色マウスは、紫色光に曝す前後0日目に画像化した。イメージングセッションは、変換後2日目、6日目、および10日目に繰り返されました。
乳腺の同じ領域を、乳腺画像化窓を通して10日間画像化した。より小さな領域は零日目に光変換され、時間の経過とともにキクメ赤色信号の同様の希釈速度を示し、上皮全体で等しい代謝回転速度を示した。示された領域のズーム画像は、光変換後6日目および10日目に細胞レベルで増殖性不均一性を示す。
光変換後10日目に異なる細胞の赤と緑の比を定量化すると、同じ乳管微小環境内のいくつかの細胞の希釈率が高度に変動することが明らかになった。この手順の重要なステップは、イメージングセッションの間に蓋を開けることです。ウィンドウのこのユニークな特徴は、イメージング条件を改善し、組織の縦方向イメージングを可能にします。
交換可能な蓋を備えた乳房イメージングウィンドウは、マウス乳腺における腫瘍の開始および進行の分野におけるin vivo、速効性薬物検査およびスクリーニングに関する新しい質問を容易にする。
