2.6K Views
•
10:53 min
•
January 20th, 2022
DOI :
January 20th, 2022
•0:05
Introduction
1:03
Preparation of the R.MIW
2:13
R.MIW Implantation
5:19
Repeated Intravital Microscopy Through the R.MIW
7:03
Opening and Closing the Lid of the R.MIW in Between Imaging Sessions
7:52
Results: Multi-Day IVM of Mammary Gland Remodeling
10:11
Conclusion
Transcript
Brystkjertelen er svært dynamisk og gjennomgår flere runder med ombygging gjennom livet. Vår protokoll gjør det mulig å fange cellulær dynamikk drive vev omorganiseringer i sunn og syk brystkjertel. Vårt brystavbildningsvindu med et utskiftbart lokk gjør det mulig å utføre langsgående intravital avbildning av brystkjertelen over lange tidsperioder, opptil flere uker.
Det utskiftbare lokket på pattedyravbildningsvinduet sikrer optimale bildeforhold til enhver tid og tillater vevsmanipulering eller legemiddeladministrasjon mellom bildebehandlingsøkter. Vår metode gir ikke bare innsikt i sunn brystkjertelbiologi, men lar oss også studere mammary tumor initiering og progresjon på encellet nivå. Begynn med å plassere lokket på pattedyrets bildevindu på en steril overflate og påfør cyanoacrylat lim rundt hele kantlokkets omkrets.
Legg forsiktig en 10 millimeter rund glassdekselslipp på toppen av lokket. Bruk en steril trepinne til å plassere glassdekselslippet og påfør litt kraft for å skyve den ned for å sikre en lufttett forsegling mellom glassdekselglidningen og lokkets ramme. Pass på at glasset ikke dekker hullene i lokkets armer.
Desinfiser lokkene og pattedyrets bildevindu ved å senke dem ned i 80% etanol i minst 30 minutter i en lukket Petri-tallerken. Bruk en bomullsspiss gjennomvåt i aceton for å fjerne overflødig cyanoacrylat lim på glassdekselslippet. For å forberede musen til kirurgi, barber området rundt den fjerde brystkjertelen ved hjelp av et barberblad.
Bruk den fjerde brystvorten som et landemerke og fjern de løse hårene ved hjelp av klebrig tape. Utfør en poteuttrekkingstest for å bekrefte om dyret er tilstrekkelig bedøvet. Løft huden forsiktig ved hjelp av fine Graefe tang og bruk liten vårsaks for å lage et 10-til-15 millimeter diagonalt snitt i huden på toppen av den fjerde mammaryfettputen Bruk den fjerde brystvorten som orienteringspunkt og sørg for ikke å kutte eller skade bukhinnen eller brystkjertelen.
Skill huden fra mammaryfettputen og underliggende vevslag ved hjelp av stump disseksjon på opptil fem til åtte millimeter rundt snittlinjen for å lage en lomme som passer til mammary imaging vindusrammen. Definer regionen av interesse, eller avkastning, basert på de makroskopiske egenskapene til pattedyrvevet, inkludert plasseringen av lymfeknuten eller en tumorlesjon. Prøv å holde avkastningen sentral med hensyn til snittet.
Plukk opp mammary imaging vinduet ved hjelp av sterile tang og teste om snittet er stort nok til å sette inn vinduet. Om nødvendig, forstørr snittet litt til brystavbildningsvinduet passer inn. Fjern vinduet og bruk en 5-0 silke sutur for å plassere en veske streng sutur en til to millimeter unna kanten av snittet starter fra kaudal enden og fra utsiden til innsiden av huden.
Beveg omtrent fem millimeter opp langs snittet og før suturtråden gjennom huden fra innsiden til utsiden. Gjenta denne prosedyren langs kanten av snittet, og dermed skape en sirkulær sutur bestående av fem til seks løkker. Den endelige utgangen av suturtråden skal være plassert omtrent to til fem millimeter unna den første inngangen.
Monter mammary imaging vinduet inne i snittet og bruk Graefe tang for å forsiktig plassere huden i sporet av vinduet. Pass på å la suturens løkker stå utenfor. Trekk løkkene i veskestrengen sutur og trekk forsiktig i begge ender av suturen for å stramme den i sporet på mammary imaging vinduet.
Bind av med kirurgiske knuter og kutt bort overflødig tråd. Bruk en tannpirker til å påføre petroleumjell på den indre kanten av vinduet, og unngå det underliggende vevet. Skyv vindusrammen forsiktig nedover med sterile tang og plasser lokket i vindusrammen.
Dette vil unngå et volum luft mellom brystkjertelen vev og mammary bildevindu lokket. Plasser spissene på de tynne tangene gjennom hullene i lokkets armer og stram lokket ved å vri det med klokken. Hvis noe luft forblir etter at lokket er strammet, introduserer du en steril insulinnål gjennom huden i hulrommet mellom brystvevet og lokket og trekker sakte ut stempelet, og skaper dermed et vakuum mellom brystkjertelvevet og brystavbildningsvinduets lokk.
Nå kan lymfeknuten lett observeres etter denne prosedyren. Inspiser tilstanden til mammary imaging vindusrammen og lokket, inkludert stabiliteten til suturene eller potensiell skade på lokket. Plasser musen på innlegget på en slik måte at pattedyrets bildevindu faller i hullet på bildeboksinnlegget.
Påfør halvgjennomsiktig og papirbånd over baksiden av musen for å stabilisere musen og redusere vevsbevegelsen på grunn av åndedrett. For bildebehandlingsøkter som er større enn tre timer, plasserer du en fleksibel nål subkutant i musens hals og fester den med papirbånd. Fest en 10 millimeter sprøyte med næringsblanding til et fleksibelt silikonrør og skyv næringsblandingen til den når enden av røret.
Koble silikonrøret til den fleksible nålen og injiser 50 mikroliter av den tilsatte løsningen hvert 30. Plasser lokket over bildeboksen for å lukke det. Fest deretter bildeboksen i mikroskopets stadium.
Kontroller at musen er stabil inne i bildeboksen. Definer interesseområdet ved hjelp av mikroskopets epifluorescensmodus og bruk mikroskopinnstillingene. Bruk Spiral-funksjonen i navigatørmodus for bildebehandlingsprogramvare til å generere en stor oversiktsflisskanning og opprette et referansekart over vevet.
Definer interesseområdet i Spiral-oversikten, og definer deretter de øvre og nedre Z-planene for å bestemme Z-stakken. Trykk på Start for å få detaljerte tredimensjonale eller firedimensjonale Z-stabler av vevet. Plasser spissene på de tynne tangene gjennom de pattedyravbildningsvindushullene i lokkets armer og løsne lokket ved å vri mot urviseren.
Alternativt kan vevet manipuleres eller omplasseres ved hjelp av sterile stumpe tang for å optimalisere bildeforholdene for den spesifikke interesseregionen. Påfør petroleumjell på den indre kanten av pattedyrets bildevindu, unngå det underliggende vevet. Skyv vindusrammen forsiktig nedover med sterile tang og plasser lokket i vindusrammen.
Til slutt plasserer du spissene på de tynne tangene gjennom hullene på armene på lokket og letter lokket ved å vri det med klokken. Pubertal Rosa26 Cre/ERT2 Rosa26-membrane tomatmembran GFP-mus ble injisert med en lav dose tamoksifen, noe som førte til Cre-mediert rekombinasjon av Rosa26-membranen tomatmembran GFP allele. Musene ble avbildet på dag én, tre og fem for å følge de dynamiske endringene i den utviklende brystkjertelen.
De representative bildene viser 3D-gjengivelsen av en langstrakt og forgrenende pattedyrkanal over flere dager avbildet gjennom et pattedyravbildningsvindu. Enkelt Z-plane bilder av forgreningsspissen og den langstrakte grenen vises her. Enkeltceller i stromaen er uthevet av hvite stjerner.
De representative bildene viser den inguinale lymfeknuten til musen som er avbildet gjennom et pattedyravbildningsvindu. Den andre harmoniske generasjonen er avbildet i grønt. 3D-gjengitte bilder av en pattedyrkanalstruktur av en voksen kvinnelig E-kadherinmembran CFP-mus over flere påfølgende dager vises her.
Kollagen I-mønsteret ble brukt til å spore samme avkastning, og CFP-signalet for E-kadherinmembranen ble brukt til å markere kanalcellene. Kikume grønnrøde mus ble avbildet på dag null før og etter eksponering for fiolett lys. Bildebehandlingsøktene ble gjentatt på dag to, seks og 10 etter konvertering.
Det samme området av brystkjertelen ble avbildet gjennom et pattedyravbildningsvindu i 10 dager. Mindre regioner ble fotoomdannet på dag null og viste en lignende fortynningshastighet av Kikume rødt signal over tid, noe som indikerer en lik omsetningshastighet gjennom hele epitelet. Zoombilder av de angitte områdene viser proliferativ heterogenitet på cellenivå seks og 10 dager etter fotokonvertering.
Kvantifisering av det røde til grønne forholdet mellom forskjellige celler 10 dager etter fotokonvertering avslørte svært variable fortynningshastigheter for noen celler i samme kanalmikromiljø. Et avgjørende trinn i denne prosedyren er å åpne lokket mellom bildebehandlingsøktene. Denne unike egenskapen i vinduet forbedrer bildeforholdene og gir mulighet for langsgående bildebehandling av vevet.
Det pattedyravbildningsvinduet med et utskiftbart lokk vil lette nye spørsmål om in vivo, hurtigvirkende legemiddeltesting og screening innen tumorinitiering og progresjon i musepattedyrkjertelen.
Denne protokollen beskriver et nytt pattedyr bildevindu med et utskiftbart lokk (R.MIW). Intravital mikroskopi etter implantasjon av R.MIW gir mulighet for langsgående og flerdagers avbildning av den sunne og syke brystkjertelen med cellulær oppløsning i de forskjellige utviklingsstadiene.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved