2.6K Views
•
10:53 min
•
January 20th, 2022
DOI :
January 20th, 2022
•0:05
Introduction
1:03
Preparation of the R.MIW
2:13
R.MIW Implantation
5:19
Repeated Intravital Microscopy Through the R.MIW
7:03
Opening and Closing the Lid of the R.MIW in Between Imaging Sessions
7:52
Results: Multi-Day IVM of Mammary Gland Remodeling
10:11
Conclusion
Transcript
Bröstkörteln är mycket dynamisk och genomgår flera ombyggnader under hela livet. Vårt protokoll gör det möjligt att fånga den cellulära dynamiken som driver vävnadsomläggningar i den friska och sjuka bröstkörteln. Vårt bröstavbildningsfönster med ett utbytbart lock gör det möjligt att utföra longitudinell intravital avbildning av bröstkörteln under långa tidsperioder, upp till flera veckor.
Det utbytbara locket på bröstavbildningsfönstret säkerställer optimala avbildningsförhållanden hela tiden och möjliggör vävnadsmanipulation eller läkemedelsadministration mellan bildsessionerna. Vår metod ger inte bara insikter i hälsosam bröstkörtelbiologi, utan gör det också möjligt för oss att studera initiering och progression av brösttumörer på encellsnivå. Börja med att placera locket på bröstavbildningsfönstret på en steril yta och applicera cyanoakrylatlim runt hela fälglockets omkrets.
Placera försiktigt en 10 millimeter rund glaslockslip ovanpå locket. Använd en steril träpinne för att placera glasluckan och använd lite kraft för att trycka ner den för att säkerställa en lufttät tätning mellan glaskåpan och lockets ram. Se till att glaset inte täcker hålen i lockets armar.
Desinficera locken och bröstavbildningsfönstret genom att sänka ner dem i 80% etanol i minst 30 minuter i en sluten petriskål. Använd en bomullsspets indränkt i aceton för att ta bort överflödigt cyanoakrylatlim på glaslocket. För att förbereda musen för operation, raka området runt den fjärde bröstkörteln med ett rakblad.
Använd den fjärde bröstvårtan som ett landmärke och ta bort de lösa hårstråna med tejp. Utför ett tassuttagstest för att verifiera om djuret är tillräckligt bedövat. Lyft försiktigt huden med fina Graefe-pincett och använd en liten fjädersax för att göra ett 10 till 15 millimeter diagonalt snitt i huden ovanpå den fjärde bröstfettkudden Använd den fjärde bröstvårtan som en orienteringspunkt och se till att inte skära eller skada bukhinnan eller bröstkörteln.
Separera huden från bröstfettkudden och underliggande vävnadsskikt med trubbig dissektion på upp till fem till åtta millimeter runt snittlinjen för att skapa en ficka som passar bröstavbildningsfönsterramen. Definiera regionen av intresse, eller ROI, baserat på de makroskopiska egenskaperna hos bröstvävnaden, inklusive placeringen av lymfkörteln eller en tumörskada. Försök att hålla ROI centralt när det gäller snittet.
Plocka upp bröstavbildningsfönstret med sterila pincett och testa om snittet är tillräckligt stort för att sätta in fönstret. Om det behövs, förstora snittet något tills bröstavbildningsfönstret passar in. Ta bort fönstret och använd en 5-0 silkesutur för att placera en handväska sträng sutur en till två millimeter från snittets kant från den kaudala änden och från utsidan till insidan av huden.
Flytta cirka fem millimeter upp längs snittet och för suturtråden genom huden från insidan till utsidan. Upprepa denna procedur längs snittets kant och därigenom skapa en cirkulär sutur bestående av fem till sex slingor. Suturgängans slutliga utgång bör placeras ungefär två till fem millimeter från den första ingången.
Montera bröstavbildningsfönstret inuti snittet och använd Graefe-tången för att försiktigt placera huden i fönstrets spår. Se till att lämna suturens öglor utanför. Dra i öglorna på handväskans sträng sutur och dra försiktigt i båda ändarna av suturen för att dra åt den i spåret på bröstavbildningsfönstret.
Bind av med kirurgiska knutar och skär bort överflödig tråd. Använd en tandpetare för att applicera vaselin på fönstrets inre kant och undvik den underliggande vävnaden. Tryck försiktigt fönsterkarmen nedåt med sterila pincett och placera locket i fönsterkarmen.
Detta kommer att undvika en volym luft mellan bröstkörtelvävnaden och bröstavbildningsfönstrets lock. Placera spetsarna på de tunna tångarna genom hålen i lockets armar och dra åt locket genom att vrida det medurs. Om lite luft kvarstår efter att locket har dragits åt, för in en steril insulinnål genom huden i hålrummet mellan bröstvävnaden och locket och dra långsamt ut kolven och därigenom skapa ett vakuum mellan bröstkörtelvävnaden och bröstavbildningsfönstrets lock.
Nu kan lymfkörteln lätt observeras efter denna procedur. Kontrollera tillståndet för bröstavbildningsfönsterramen och locket, inklusive suturernas stabilitet eller eventuella skador på locket. Placera musen på inlagan på ett sådant sätt att bröstavbildningsfönstret faller i hålet på bildlådans inlägg.
Applicera halvtransparent och papperstejp över musens baksida för att stabilisera musen och minska vävnadsrörelsen på grund av andning. För avbildningssessioner som är längre än tre timmar, placera en flexibel nål subkutant i musens hals och säkra den med papperstejp. Fäst en 10-millimeters spruta med en näringsblandning på ett flexibelt silikonrör och tryck på näringsblandningen tills den når rörets ände.
Anslut silikonröret till den flexibla nålen och injicera 50 mikroliter av den infunderade lösningen var 30: e minut. Placera locket över bildlådan för att stänga den. Säkra sedan bildlådan i mikroskopets stadium.
Kontrollera att musen är stabil inuti bildrutan. Definiera intresseområdet med hjälp av mikroskopets epifluorescensläge och tillämpa mikroskopinställningarna. Använd funktionen Spiral i navigatorläget för bildprogramvaran för att generera en stor översiktspanelsökning och skapa en referenskarta över vävnaden.
Definiera intresseområdet i spiralöversikten och definiera sedan de övre och nedre Z-planen för att bestämma Z-stacken. Tryck på Start för att få detaljerade tredimensionella eller fyrdimensionella Z-stackar i vävnaden. Placera spetsarna på den tunna tången genom bröstens fönsterhål i lockets armar och lossa locket genom att vrida in moturs.
Alternativt kan vävnaden manipuleras eller omplaceras med hjälp av sterila trubbiga pincett för att optimera avbildningsförhållandena för den specifika regionen av intresse. Applicera vaselin på den inre kanten av bröstavbildningsfönstret och undvik den underliggande vävnaden. Tryck försiktigt fönsterkarmen nedåt med sterila pincett och placera locket i fönsterkarmen.
Slutligen placera spetsarna på de tunna tångarna genom hålen på lockets armar och lätta locket genom att vrida det medurs. Pubertala Rosa26 Cre/ERT2 Rosa26-membran tomatmembran GFP-möss injicerades med en låg dos tamoxifen, vilket ledde till Kre-medierad rekombination av Rosa26-membran tomatmembran GFP-allelen. Mössen avbildades dag ett, tre och fem för att följa de dynamiska förändringarna i den utvecklande bröstkörteln.
De representativa bilderna visar 3D-rendering av en långsträckt och förgrenande bröstkanal under flera dagar avbildad genom ett bröstavbildningsfönster. Enstaka Z-planbilder av förgreningsspetsen och den töjande grenen visas här. Enstaka celler i stroma markeras med vita asterisker.
De representativa bilderna visar musens inguinala lymfkörtel avbildad genom ett bröstavbildningsfönster. Den andra harmoniska generationen är avbildad i grönt. 3D-renderade bilder av en bröstduktal struktur av en vuxen kvinnlig E-cadherin membran CFP-mus under flera på varandra följande dagar visas här.
Kollagen I-mönstret användes för att spåra samma ROI och E-cadherinmembranETS CFP-signal användes för att markera duktala celler. Kikume grönröda möss avbildades vid dag noll före och efter exponering för violett ljus. Avbildningssessionerna upprepades dag två, sex och 10 efter konvertering.
Samma område av bröstkörteln avbildades genom ett bröstavbildningsfönster i 10 dagar. Mindre regioner fotokonverterades på dag noll och visade en liknande utspädningshastighet för Kikume-röda signalen över tid, vilket indikerar en lika stor omsättningshastighet i hela epitelet. Zoombilder av de angivna regionerna visar proliferativ heterogenitet på cellnivå sex och 10 dagar efter fotokonvertering.
Kvantifiering av det röda till gröna förhållandet mellan olika celler 10 dagar efter fotokonvertering avslöjade mycket varierande utspädningshastigheter för vissa celler inom samma duktala mikromiljö. Ett viktigt steg i denna procedur är att öppna locket mellan bildsessionerna. Denna unika egenskap hos fönstret förbättrar bildförhållandena och möjliggör longitudinell avbildning av vävnaden.
Bröstavbildningsfönstret med ett utbytbart lock kommer att underlätta nya frågor om in vivo, snabbverkande drogtestning och screening inom tumörinitiering och progression i musens bröstkörtel.
Detta protokoll beskriver ett nytt bröstavbildningsfönster med ett utbytbart lock (R.MIW). Intravital mikroskopi efter implantation av R.MIW möjliggör longitudinell och flerdagarsavbildning av den friska och sjuka bröstkörteln med en cellulär upplösning under de olika utvecklingsstadierna.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved