Name: visualizing shifts on neuron-glia circuit with the calcium imaging technique
Uploaded: 2022-04-08T15:00:00
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Zuschüsse, Sponsoren und Finanzierungsquellen: MH erhält ein PhD CNPq-Stipendium. HRF ist Empfänger eines Postdoc-Stipendiums, das von CNPq unterstützt wird (HRF-Fördernummer 152071/2020-2). RAMR wird von CNPq und FAPERJ (Fördernummern E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 und 312157/2016-9 und INCT-INNT (National Institute for Translational Neuroscience) unterstützt.

Alle Tierversuche wurden von den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Federal University of Rio de Janeiro nach den "Principles of Laboratory Animal Care" (NIH, Bethesda, USA) genehmigt und durchgeführt. Genehmigungsnummer IBCCF-035 für befruchtete Hühnereier aus Weißem Leghorn.
1. Vorbereitung von Lösungen
<ol><li>Krebslösung vorbereiten: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,4 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 6 mM Glukose, 10 mM HEPES, pH 7,4, 373 mO...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+homeostasis+in+intact+lymphocytes:+cytoplasmic+free+calcium+monitored+with+a+new,+intracellularly+trapped+fluorescent+indicator.">Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator.</a> Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li><li>Islam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling:+From+Basic+to+Bedside.">Calcium Signaling: From Basic to Bedside.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).</li><li>De Melo Reis, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+of+cell+phenotypes+differentiating+from+mice+retinal+neurospheres+using+single+cell+calcium+imaging.">Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).</li><li>Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+itself+promotes+the+developmental+switch+of+neuronal+GABAergic+responses+from+excitation+to+inhibition.">GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition.</a> Cell. 105 (4), 521-532 (2001).</li><li>Schitine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ampakine+CX546+increases+proliferation+and+neuronal+differentiation+in+subventricular+zone+stem/progenitor+cell+cultures.">Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis:+a+role+for+hemopressin.">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).</li><li>Ribeiro-Resende, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+GD3+synthase+display+morphological+abnormalities+in+the+sciatic+nerve+and+neuronal+disturbances+during+peripheral+nerve+regeneration.">Mice lacking GD3 synthase display morphological abnormalities in the sciatic nerve and neuronal disturbances during peripheral nerve regeneration.</a> PLoS One. 9 (10), 108919 (2014).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+type+1+cannabinoid+receptor+(CB1R)+promotes+neurogenesis+in+murine+subventricular+zone+cell+cultures.">Activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R) promotes neurogenesis in murine subventricular zone cell cultures.</a> PLoS One. 8 (5), 63529 (2013).</li><li>Kubrusly, R. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-glial+cannabinoid+receptors+modulate+signaling+in+the+embryonic+avian+retina.">Neuro-glial cannabinoid receptors modulate signaling in the embryonic avian retina.</a> Neurochemistry International. 112, 27-37 (2018).</li><li>Egan, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+calcium+ions+to+P2X+channel+responses.">Contribution of calcium ions to P2X channel responses.</a> Journal of Neuroscience. 24 (13), 3413-3420 (2004).</li><li>Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+Receptors+Amplify+CNS+Damage+in+Neurodegenerative+Diseases.">P2X7 Receptors Amplify CNS Damage in Neurodegenerative Diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).</li><li>Faroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signaling+mediated+by+P2X7+receptors+controls+myelination+in+sciatic+nerves.">Purinergic signaling mediated by P2X7 receptors controls myelination in sciatic nerves.</a> Journal of Neuroscience Research. 92 (10), 1259-1269 (2014).</li><li>Freitas, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Induce+Cell+Death+and+Promote+P2X7+Receptor+Signaling+in+Retinal+Glial+Progenitors+in+Culture.">Cannabinoids Induce Cell Death and Promote P2X7 Receptor Signaling in Retinal Glial Progenitors in Culture.</a> Molecular Neurobiology. 56 (9), 6472-6486 (2019).</li><li>Freitas, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione-Induced+Calcium+Shifts+in+Chick+Retinal+Glial+Cells.">Glutathione-Induced Calcium Shifts in Chick Retinal Glial Cells.</a> PLoS One. 11 (4), 0153677 (2016).</li><li>Yang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+receptors+for+glutamate+and+GABA+in+retinal+neurons.">Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons.</a> Progress in Neurobiology. 73 (2), 127-150 (2004).</li><li>Reis, R. A., Kubrusly, R. C., de Mello, M. C., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+coupling+of+NMDA+receptor+with+ip3+production+in+cultured+cells+of+the+avian+retina.">Transient coupling of NMDA receptor with ip3 production in cultured cells of the avian retina.</a> Neurochemistry International. 26 (4), 375-380 (1995).</li><li>L&#243;pez-Colom&#233;, A. M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+amino+acid-induced+phosphoinositide+hydrolysis+in+M&#252;ller+glia.">Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in M&#252;ller glia.</a> Glia. 9 (2), 127-135 (1993).</li><li>Ventura, A. L., de Mello, F. G., de Melo Reis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+dopamine+research+in+retina+cells.">Methods of dopamine research in retina cells.</a> Methods in Molecular Biology. 964, 25-42 (2013).</li><li>Miras-Portugal, M. T., Sebasti&#225;n-Serrano, &. #. 1. 9. 3. ;., de Diego Garc&#237;a, L., D&#237;az-Hern&#225;ndez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+P2X7+Receptor:+Involvement+in+Neuronal+Physiology+and+Pathology.">Neuronal P2X7 Receptor: Involvement in Neuronal Physiology and Pathology.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7063-7072 (2017).</li><li>Illes, P., Khan, T. M., Rubini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+P2X7+Receptors+Revisited:+Do+They+Really+Exist.">Neuronal P2X7 Receptors Revisited: Do They Really Exist.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7049-7062 (2017).</li><li>Schitine, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+plasticity+of+GAT-3+in+avian+M&#252;ller+cells+is+regulated+by+neurons+via+a+glutamatergic+input.">Functional plasticity of GAT-3 in avian M&#252;ller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input.</a> Neurochemistry International. 82, 42-51 (2015).</li><li>Ferreira, D. D., Stutz, B., de Mello, F. G., Reis, R. A., Kubrusly, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+potentiates+the+release+of+GABA+mediated+by+NMDA+receptor+activation:+Involvement+of+A1+adenosine+receptors.">Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A1 adenosine receptors.</a> Neuroscience. 281, 208-215 (2014).</li><li>Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+receptor+large+pore+signaling+in+avian+M&#252;ller+glial+cells.">P2X7 receptor large pore signaling in avian M&#252;ller glial cells.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).</li><li>Passos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Serotonergic+System+by+Kainate+in+the+Avian+Retina.">Regulation of the Serotonergic System by Kainate in the Avian Retina.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 1039-1049 (2019).</li><li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L., Schitine, C. S., de Mello, M. C., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina:+neurotransmitters+and+trophic+factors.">M&#252;ller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochemical Research. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li><li>Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliotransmitter+Release+from+Astrocytes:+Functional+Developmental,+and+Pathological+Implications+in+the+Brain.">Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional Developmental, and Pathological Implications in the Brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 499. 9, 499 (2015).</li></ol>

Wir haben das Netzhautgewebe verwendet, um zu zeigen, dass Kalziumreaktionen, die durch KCl oder ATP vermittelt werden, eindeutig in neuronale bzw. gliale Reaktionen unterteilt sind (Abbildung 1). Obwohl einige Daten in der Literatur darauf hindeuten, dass P2X7-Rezeptoren in Neuronen exprimiert werden, die die neuronale Aktivität und die freisetzung synaptischer Neurotransmitter regulieren20, stellen andere Autoren die Existenz neuronaler P2X7-Rezeptoren in Frage. Ta...

Aufgrund der universellen Eigenschaften von Kalzium als zweiter Botenstoff ist dieses Ion an einer Vielzahl von Signalaktivitäten beteiligt: Gentranskription, Geburt und Tod, Proliferation, Migration und Differenzierung, synaptische Übertragung und Plastizität. Daher würde eine Methode, die in der Lage ist, die Dynamik der Kalziumaktivierung mit Genauigkeit und Beweglichkeit zu verfolgen, eine Möglichkeit bieten, einzigartige räumlich-zeitliche Reaktionen zu beobachten. Eine solche Methode ist die zelluläre Kalzium-Bildgebungstechnik, die funktionelle Daten mit spezifischen Zellphänotypen korreliert, basierend auf ihren unterschiedlichen Reaktionen.
Ca2+-Sonden wurden erstmals in den 1980er Jahren entwickelt, mit späteren Verbesserungen, die es ermöglichten, diese Moleküle in Lebendzellassays zu verwenden1. Als chemischer Indikator gilt Fura-2 als Standard für quantitative [Ca2+]i-Messungen. Der Acetoxymethylester (AM) dieses Indikators (d. h. Fura-2 AM) durchdringt leicht die Zellmembran und kann intrazelluläre Konzentrationen erreichen, die 20-fach größer sind als die Inkubationsverdünnung (z. B. [5 μM]o/[100 μM]i). Ein weiterer Vorteil von Fura-2 ist, dass es eine gute Fotobleichbeständigkeit hat; Daher hat die Abbildung dieses Indikators über längere Zeiträume keinen großen Einfluss auf seine Fluoreszenzfähigkeiten. Schließlich ist Fura-2 empfindlich gegenüber einem breiten Bereich von Kalziumspiegeln, von ~ 100 nM bis ~ 100 μM, und hat einen Kd von ~ 145 nM, was mit dem ruhenden [Ca2 + ]i2 vergleichbar ist. Später wurde die Zellkalziumbildgebung mit besseren Fluoreszenzmikroskopen und Berechnungsmethoden entwickelt, zusammen mit ratiometrischen Sonden, die nicht von der Farbstoffbelastung betroffen sind.
Jede Zelle exprimiert verschiedene Kalziumgeräte (Pumpen, Transporter, Rezeptoren und Kanäle), die als besondere Signatur zur endgültigen Reaktion beitragen. Der wichtige Tipp ist, selektive Reaktionen verschiedener Zelltypen zu finden, die mit ihrer phänotypischen Expression korrelieren. Dementsprechend gibt es mindestens zwei verschiedene Rezeptoren, die durch Kalziumverschiebungen arbeiten: ionotrope Rezeptoren, die Ca2+ in einem schnellen Modus durchdringen, und langsame metabotrope Rezeptoren, die an Signalwege gekoppelt sind, und intrazelluläre Bestände, die Ca2+ freisetzen, das durch zweite Botenstoffe wie Inositoltriphosphat und zyklisches ADP-Ribose3 aktiviert wird.
Zum Beispiel exprimieren Vorläuferzellen Nestin in der unreifen Netzhaut und zeigen GABAA-Rezeptoren, die durch GABA (oder Muscimol) depolarisiert sind4. Dies geschieht aufgrund des elektrochemischen Cl-Gradienten mit hohen intrazellulären Cl−-Werten; Wenn sich das Gewebe entwickelt, wechseln KCC2-Transporter von der Anregung an Vorläuferzellen zur Hemmung an reifen GABAergen Neuronen5. Auf der anderen Seite präsentieren Stammzellen, die Sox-2 in der unreifen subventrikulären Zone (SVZ) postnataler Nagetiere exprimieren, auch metabotrope H1-Rezeptoren, die durch Histamin aktiviert werden, das Ca2+ langsam erhöht6. Ein zweiter metabotroper Rezeptor aus der Protease-aktivierten Rezeptor-1 (PAR-1)-Familie, der durch Thrombin aktiviert wird und nach G(q/11) und Phospholipase C (PLC) nachgeschaltet ist, führt zu langsamen Ca2+-Verschiebungen in Oligodendrozyten (die O4 und PLP exprimieren), die aus multipotenten neuronalen SVZ-Stammzellen erzeugt werden7.
Im Allgemeinen exprimieren Neuronen spannungsabhängige Kalziumkanäle sowie wichtige Neurotransmitterrezeptoren, die für Ca2 + durchlässig sind, als glutamaterge (AMPA, NMDA, Kainate) und periphere und zentrale Nikotinrezeptoren. Kaliumchlorid wird normalerweise als Depolarisationsmittel verwendet, um periphere Neuronen zu aktivieren, wie die dorsalen Wurzelganglion-Neuronen8 oder zentrale Neuronen, wie aus der subventrikulären Zone9 oder Retina10. Auf der anderen Seite wird ATP als der wichtigste Gliotransmitter (zusätzlich zu D-Serin) anerkannt, der selektive Ca2 + permeable P2X-Mitglieder als P2X7 und P2X4 aktiviert. Beide Rezeptoren weisen äquivalente Ca2+-Ströme auf, ähnlich denen, die von NMDA-Rezeptoren gezeigt werden, die als die größten Ca2+-Ströme anerkannt sind, die von Transmittern aktiviert werden11. P2X7-Rezeptoren werden auf Mikroglia stark exprimiert, aber in einer geringeren Dichte auf Astrozyten und Oligodendrozyten, die eine Rolle bei der Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen spielen12. P2X7-Rezeptoren werden auch auf Schwann-Zellen13 und Müller-Glia in der Netzhaut14,15 exprimiert.
Es ist bekannt, dass die Netzhaut fast alle im Gehirn gesehenen Sender zeigt. Zum Beispiel ist die vertikale Achse (Photorezeptoren, bipolare und retinale Ganglienzellen) hauptsächlich glutamaterg, mit calciumdurchlässigen AMPA- oder Kainatrezeptoren, die in OFF-bipolaren Zellen exprimiert werden, und mgluR6, das in ON-bipolaren Zellen exprimiert wird16. Seltsamerweise finden sich alle drei Rezeptoren auch in Müller-Glia, die an Calcium- und Inositoltriphosphatwege gekoppelt sind17,18. Die horizontale inhibitorische Achse, die aus horizontalen und amakrinen Zellen besteht, sezerniert nicht nur GABA, sondern auch Dopamin, Acetylcholin und andere klassische Neurotransmitter. Amakrinzellen sind die Haupttypen von Zellen, die in den Vogelnetzhautkulturen vorkommen und verschiedene Arten von kalziumbetriebenen Kanälen zeigen, wie glutamaterge, purinerge, nikotinische und spannungsabhängige Kalziumkanäle. Aus diesem Grund ist dies ein hervorragendes Modell, um verschiedene Eigenschaften von Kalziumverschiebungen zwischen Neuronen und Glia zu bewerten.
Daher ermöglicht die Kombination verschiedener Rezeptoren und Kanäle, die während der Entwicklung zu selektiven phänotypischen Markern summiert werden, mit unterschiedlichen Agonisten-Reaktionsmustern einzigartige Signaturen in Stamm, Vorläufer, Neuron, Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia, die durch selektive Signalgeräte arbeiten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mm coverslip</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>111550</td>
			<td>Cell suport</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>510 nm long-pass filter</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Suplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP digital camera</td>
			<td>Roper Scientific, Trenton, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Neon</td>
			<td>1466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/ F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12400-24</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel Software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Suplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Axiovert 200; Carl Zeiss</td>
			<td>B 40-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F1221</td>
			<td>Ratiometric Ca2+ indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>1405-41-0</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DG-4 apparatus</td>
			<td>Sutter Instrument, Novato, CA</td>
			<td>DG-4PLUS/OF30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Help cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metafluor software</td>
			<td>Universal Imaging Corp. West Chester, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Vetec</td>
			<td>129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Isofar</td>
			<td>310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Vetec</td>
			<td>306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH3 platform</td>
			<td>Warner Intruments, Hamden, CT</td>
			<td>64-0286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P6866</td>
			<td>nonionic, surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Help cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing shifts on neuron-glia circuit with the calcium imaging technique

Hier berichten wir über selektive In-vitro-Modelle von Schaltkreisen, die auf Glia-Schaltkreisen (Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia) und/oder Neuronen aus peripheren (dorsale Wurzelganglien) und zentralen Geweben (Kortex, subventrikuläre Zone, Organoid) basieren, die dynamisch in Bezug auf Kalziumverschiebungen untersucht werden. Das Modell, das zur Veranschaulichung der Ergebnisse gewählt wurde, ist die Netzhaut, ein einfaches Gewebe mit komplexen zellulären Interaktionen. Kalzium ist ein universeller Botenstoff, der an den meisten wichtigen zellulären Rollen beteiligt ist. Wir erklären in einem Schritt-für-Schritt-Protokoll, wie retinale Neuron-Gliazellen in Kultur vorbereitet und ausgewertet werden können, wobei wir uns Kalziumverschiebungen vorstellen. In diesem Modell unterscheiden wir Neuronen von Glia basierend auf ihrer selektiven Reaktion auf KCl und ATP. Kalziumpermeable Rezeptoren und Kanäle werden selektiv in verschiedenen Kompartimenten exprimiert. Um Kalziumreaktionen zu analysieren, verwenden wir ratiometrische fluoreszierende Matrizen wie Fura-2. Diese Sonde quantifiziert die freie Ca2+-Konzentration basierend auf Ca2+-freien und Ca2+-gebundenen Formen und zeigt zwei verschiedene Peaks, die auf der Fluoreszenzintensität basieren, die auf zwei Wellenlängen wahrgenommen wird.

Hier verwendeten wir Netzhautzellen in Kultur ab embryonalen Küken am 8. Tag, um zu untersuchen, wie Neuronen und Glia in Bezug auf Kalziumverschiebungen signalisieren. Kulturen wurden im Wesentlichen wie beschrieben15,19 als gemischte Neuron-Gliazellen (bei einer Dichte von ≥ 1 x 106 Zelle/Schale) in einem Stadium von 7 Tagen in vitro hergestellt (Abbildung 1A). Alternativ können angereicherte neuronale Zellen, die in...

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Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

Die Zellkalziumbildgebung ist eine vielseitige Methodik zur Untersuchung der dynamischen Signalgebung einzelner Zellen, an gemischten Populationen in Kultur oder sogar an erwachten Tieren, basierend auf der Expression von kalziumdurchlässigen Kanälen / Rezeptoren, die einzigartige funktionelle Signaturen ergeben.

Visualisierung von Verschiebungen auf dem Neuron-Glia-Schaltkreis mit der Kalzium-Bildgebungstechnik

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Veränderungen der zytosolischen Kalziumkonzentrationen in lebenden Zellen zu überwachen, um neuronale oder Gliareaktionen basierend auf Kaliumchlorid oder ATP-Reizen zu differenzieren. Kalzium ist ein wichtiger zweiter Botenstoff, der an mehreren zellulären Prozessen beteiligt ist, einschließlich Neurotransmission, Plastizität und Apoptose. Das Aufkommen von hochselektiven fluoreszierenden Kalziumfarbstoffen wie Fura-2 AM, verbunden mit der Entwicklung besserer Fluoreszenzmikroskope und Berechnungsmethoden, lieferte hochauflösende optische Daten mit einem hohen Maß an räumlicher und zeitlicher Auflösung, um Kalziumsignale auf lebenden Zellen und Organismen abzubilden.Dieses Protokoll kann an angereicherte Neuronen, gereinigte Glia- oder Mischpopulationskulturen angepasst werden. Es verfolgt, welche Zelltypen auf bestimmte Reize reagierten, basierend auf der differentiellen Reaktion auf Kaliumchlorid und ATP. Kaliumchlorid verändert das Membranpotential der Zelle.Und dies öffnet spannungsgesteuerte Kalziumkanäle, die im Wesentlichen von Neuronen ausgedrückt werden. Auf der anderen Seite aktiviert ATP den P2X7-Großteilkanal, der hauptsächlich in Gliazellen vorhanden ist. Durch die Kopplung von Kaliumchlorid und ATP-Stimuli mit anderen Medikamenten ist es möglich zu sehen, welches Kompartiment des Nervensystems auf sie reagiert, basierend auf der Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration.Für dieses Verfahren benötigen Sie einige chirurgische Instrumente oder eine Pinzette. Verwenden Sie eine Biosicherheitswerkbank und führen Sie Best Practices durch, um Kontaminationen zu vermeiden. Um die Hühnernetzhautkultur zu beginnen, öffnen Sie vorsichtig ein befruchtetes Ei am Boden, wo sich die Luftzelle befindet.Entfernen Sie den Inhalt in eine Petrischale und fahren Sie mit der Embryonenabgabe durch Enthauptung mit einer Pinzette fort. Sobald der Kopf entfernt ist, bringen Sie ihn in eine saubere Petrischale und fügen Sie etwas kalzium- und magnesiumfreie Lösung hinzu. Als nächstes entfernen Sie die Augen und achten Sie darauf, sie dabei nicht zu beschädigen.Bringen Sie das Auge zu einer anderen Petrischale mit CMF-Lösung. Beginnen Sie mit einer Pinzette, das Auge zu sezieren, indem Sie die Linse entfernen. Dann, beginnend mit dem Loch, das die Linse hinterlassen hat, machen Sie drei oder vier Längsschnitte im Auge.Entfernen Sie den transparenten Glaskörper mit Vorsicht. Stellen Sie sicher, dass die Netzhaut nicht daran gebunden ist. Als nächstes lösen Sie vorsichtig die Netzhaut vom pigmentierten Epithel.Entfernen Sie das verbleibende Epithelgewebe. Wenn die Netzhaut völlig klar ist, schneiden Sie sie in kleine Stücke. Nehmen Sie das gesamte Netzhautgewebe mit Hilfe einer automatisierten Pipette ein.Zentrifugieren Sie kurz die Netzhaut, um das gesamte CMF zu entfernen. Fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin hinzu. Und inkubieren Sie das Gewebe bei 37 ° C für 10 Minuten.Stoppen Sie die Trypsinreaktion, indem Sie 1 ml Medium hinzufügen, das 10% fetales Kälberserum enthält. Zentrifugieren Sie die Netzhaut, um das gesamte Trypsin zu entfernen. Waschen Sie die Zellen zwei- oder dreimal mit einem Medium, das 10% FCS enthält.Als nächstes fügen Sie 2 ml Medium pro Netzhaut hinzu und dissoziieren Sie es sanft mechanisch. Verdünnen Sie die Zellen, damit Sie sie mit einem Hämozytometer richtig zählen können. Verwenden Sie 15-mm-Deckgläser, die mit Poly-L-Lysin und Laminin geschützt sind, um die Zelladhäsion zu unterstützen.Pipette 50 L Ihrer verdünnten Zellen auf jedem Deckglas. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in 5%CO2-Atmosphäre. Und kühlen Sie sie, um das Glas zu befestigen.Dies sollte etwa ein bis zwei Stunden dauern. Fügen Sie 1 ml Medium hinzu und bringen Sie es bis zum Tag des Experiments in den Inkubator zurück. Bei Bedarf wechseln Sie alle zwei bis drei Tage die Hälfte des Mediums.Rekonstituieren Sie eine 50 g Fläschchen Fura-2 AM mit 50 L DMSO. Krebslösung ist eine gute Option, um Zellen während des Experiments zu übertragen, da sie die Fluoreszenzmessung nicht stört. Die Lösung vor Beginn auf 37 vorheizen.Poloxamer 407 hinzufügen. Fügen Sie Fura-2 AM und DMSO hinzu. Beschallen Sie es sieben Minuten lang in einem Wasserbad.Bereiten Sie eine 6-Well-Platte vor, indem Sie Krebs-Lösung zu drei Vertiefungen und die funktionierende Fura-2-Lösung zu einer anderen hinzufügen. Waschen Sie das Deckglas, das Ihre Zellen enthält, dreimal, bevor Sie es zum Fura-2-Brunnen hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 5% CO2-Atmosphäre für 30 Minuten in einem dunklen Inkubator.Nach der Inkubation dreimal waschen. Übertragen Sie es auf einen anderen Empfänger, der Krebs enthält, und schützen Sie es vor dem Licht. Es ist möglich, den vorbereiteten Fura-2 wiederzuverwenden, um mehr Deckgläser mit Zellen zu inkubieren.Fügen Sie vor jedem Durchlauf Silizium zur Deckglashalterung und -kammer hinzu, um ein Auslaufen der Lösung zu vermeiden. Nehmen Sie das Deckglas aus Krebs-Lösung heraus und waschen Sie den Boden vorsichtig mit destilliertem Wasser, um eine Salzkristallisation auf der Mikroskoplinse zu vermeiden. Setzen Sie den Decklack auf die Stütze und drücken Sie vorsichtig auf die Ränder.Befestigen Sie die Deckglasstütze und die Kammer am Mikroskop und beginnen Sie, die Zellen mit Krebslösung zu durchbluten. Markieren Sie die entsprechenden Zellen und wählen Sie ein gutes Feld aus. Bestimmen Sie manuell die Regionen von Interesse, indem Sie Zellkörper basierend auf ihrer unterschiedlichen Morphologie auswählen.Die Variationen der Calciumkonzentration wurden durch Quantifizierung des Verhältnisses der Fluoreszenz, die bei 510 nm nach abwechselnder Anregung bei 340 und 380 nm emittiert wurde, bewertet. Nach der Zugabe von Kaliumchlorid ist es möglich, viele Zellen leuchten zu sehen und die Fluoreszenzreaktion in der Grafik zu erhöhen. Kaliumchlorid öffnet spannungsgesteuerte Kalziumkanäle, die hauptsächlich in Neuronen vorhanden sind.Jede einzelne Linie im Diagramm stellt die einzigartige Region von Interesse dar. Daher ist es möglich, einzelne Zellreaktionen während des Experiments zu verfolgen. ATP-Stimuli öffnen den P2X7-Rezeptor, der im Wesentlichen von Gliazellen exprimiert wird.Dies ist eine angereicherte Neuronenkultur. Daher gibt es hier nur wenige Gliazellen. Dies ist der Grund, warum so wenige Zellen auf die ATP-Reize reagieren.Die erfassten Werte wurden mit der Metafluor-Software verarbeitet. Experimentelle Ergebnisse werden in einer Excel-Tabelle ausgedrückt, in der jede Zeile eine einzelne Zelle und jede Zeile einen Zeitpunkt darstellt. Mit Excel-Software ist es möglich, Kalziumvariationen einzelner Zellen separat oder von allen im selben Diagramm darzustellen.Um die Menge an reaktiven Zellen für einen Stimulus zu quantifizieren, legen Sie einen Grenzwert von 30% fest, der den Kalzium-Ausgangswert erhöht. Hier verwenden wir Netzhautzellen in Kultur ab embryonalen Küken des 8. Tages, um zu untersuchen, wie Neuronen und Glia in Bezug auf Kalziumverschiebungen signalisieren, nachdem sie 50 mm Kaliumchlorid und 1 mm ATP-Reize erhalten haben. In jedem Experiment wurden etwa 100 Zellen leicht analysiert.Abbildung A stellt eine Mischkultur dar, die sowohl Neuronen als auch Glia enthält und eine Woche lang aufrechterhalten wurde. Wenn wir die Antworten quantifizieren, ist es möglich zu sehen, dass etwa die Hälfte der analysierten Zellen Kaliumchlorid antwortet und die andere Hälfte auf ATP reagiert. Abbildung B bezieht sich auf eine mit Neuronen angereicherte Kultur.Es wurde nur drei Tage lang inkubiert, daher haben sich die meisten Gliazellen noch nicht differenziert. In diesem Fall antworten 89% der Zellen auf Kaliumchlorid und verstärken die Prävalenz von Neuronen. Abbildung C zeigt eine gereinigte Gliakultur.Diese Zellen wurden 10 Tage lang mit mittleren Änderungen alle drei Tage aufrechterhalten. Nach dieser Zeit sterben die meisten Neuronen und hinterlassen nur noch Glia. Tatsächlich wurde diese Kultur ausschließlich von ATP aktiviert.Diese Methodik wurde aufgrund der universellen Eigenschaften von Kalzium als Second Messenger breit angewendet. Die phänotypische Analyse kann verbessert werden, indem diese Methodik mit der Immunchemie fester Zellen nach der Kalziumbildgebung ergänzt wird. Dieses Protokoll könnte auch an andere Mischzellsysteme angepasst werden, die andere Kalziumkanäle exprimieren.Der wichtige Tipp ist, selektive Reaktionen verschiedener Zelltypen zu finden, die mit ihrer phänotypischen Expression korrelieren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Untersuchungen über Veränderungen der hippokampalen Schaltung Funktion Nach Mild Traumatic Brain Injury

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

Forschung

Neurowissenschaften

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

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In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

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In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Für die detaillierte Untersuchung von Neuron-Glia Interaktionen Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

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Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

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In Vivo Calcium Imaging der Seitenlinie Haarzellen im Larvenstadium Zebrafisch

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Kultur der Hirnkapillarpericyten für zytosolische Kalziummessungen und Calcium-Imaging-Studien

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ein Zellkulturmodell zum Studium der Rolle von Neuron-Glia-Interaktionen in Ischämie

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Wedge Slice Vorbereitung für Diemimitieren In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...