Name: visualizing shifts on neuron-glia circuit with the calcium imaging technique
Uploaded: 2022-04-08T15:00:00
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Sovvenzioni, sponsor e fonti di finanziamento: MH è destinatario di una borsa di studio CNPq di dottorato. HRF è destinatario di una borsa di studio postdoc supportata da CNPq (numero di sovvenzione HRF 152071/2020-2). RAMR è supportato da CNPq e FAPERJ (numeri di sovvenzione E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 e 312157/2016-9 e INCT-INNT (Istituto Nazionale di Neuroscienze Traslazionali).

Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali sono stati approvati e condotti seguendo le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università Federale di Rio de Janeiro, seguendo i "Principi di cura degli animali da laboratorio" (NIH, Bethesda, USA); numero di permesso IBCCF-035 per uova di gallina Livorno Bianca fecondate.
1. Preparazione delle soluzioni
<ol><li>Preparare la soluzione di Krebs: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,4 mM MgCl2<...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+homeostasis+in+intact+lymphocytes:+cytoplasmic+free+calcium+monitored+with+a+new,+intracellularly+trapped+fluorescent+indicator.">Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator.</a> Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li><li>Islam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling:+From+Basic+to+Bedside.">Calcium Signaling: From Basic to Bedside.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).</li><li>De Melo Reis, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+of+cell+phenotypes+differentiating+from+mice+retinal+neurospheres+using+single+cell+calcium+imaging.">Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).</li><li>Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+itself+promotes+the+developmental+switch+of+neuronal+GABAergic+responses+from+excitation+to+inhibition.">GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition.</a> Cell. 105 (4), 521-532 (2001).</li><li>Schitine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ampakine+CX546+increases+proliferation+and+neuronal+differentiation+in+subventricular+zone+stem/progenitor+cell+cultures.">Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis:+a+role+for+hemopressin.">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).</li><li>Ribeiro-Resende, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+GD3+synthase+display+morphological+abnormalities+in+the+sciatic+nerve+and+neuronal+disturbances+during+peripheral+nerve+regeneration.">Mice lacking GD3 synthase display morphological abnormalities in the sciatic nerve and neuronal disturbances during peripheral nerve regeneration.</a> PLoS One. 9 (10), 108919 (2014).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+type+1+cannabinoid+receptor+(CB1R)+promotes+neurogenesis+in+murine+subventricular+zone+cell+cultures.">Activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R) promotes neurogenesis in murine subventricular zone cell cultures.</a> PLoS One. 8 (5), 63529 (2013).</li><li>Kubrusly, R. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-glial+cannabinoid+receptors+modulate+signaling+in+the+embryonic+avian+retina.">Neuro-glial cannabinoid receptors modulate signaling in the embryonic avian retina.</a> Neurochemistry International. 112, 27-37 (2018).</li><li>Egan, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+calcium+ions+to+P2X+channel+responses.">Contribution of calcium ions to P2X channel responses.</a> Journal of Neuroscience. 24 (13), 3413-3420 (2004).</li><li>Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+Receptors+Amplify+CNS+Damage+in+Neurodegenerative+Diseases.">P2X7 Receptors Amplify CNS Damage in Neurodegenerative Diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).</li><li>Faroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signaling+mediated+by+P2X7+receptors+controls+myelination+in+sciatic+nerves.">Purinergic signaling mediated by P2X7 receptors controls myelination in sciatic nerves.</a> Journal of Neuroscience Research. 92 (10), 1259-1269 (2014).</li><li>Freitas, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Induce+Cell+Death+and+Promote+P2X7+Receptor+Signaling+in+Retinal+Glial+Progenitors+in+Culture.">Cannabinoids Induce Cell Death and Promote P2X7 Receptor Signaling in Retinal Glial Progenitors in Culture.</a> Molecular Neurobiology. 56 (9), 6472-6486 (2019).</li><li>Freitas, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione-Induced+Calcium+Shifts+in+Chick+Retinal+Glial+Cells.">Glutathione-Induced Calcium Shifts in Chick Retinal Glial Cells.</a> PLoS One. 11 (4), 0153677 (2016).</li><li>Yang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+receptors+for+glutamate+and+GABA+in+retinal+neurons.">Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons.</a> Progress in Neurobiology. 73 (2), 127-150 (2004).</li><li>Reis, R. A., Kubrusly, R. C., de Mello, M. C., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+coupling+of+NMDA+receptor+with+ip3+production+in+cultured+cells+of+the+avian+retina.">Transient coupling of NMDA receptor with ip3 production in cultured cells of the avian retina.</a> Neurochemistry International. 26 (4), 375-380 (1995).</li><li>L&#243;pez-Colom&#233;, A. M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+amino+acid-induced+phosphoinositide+hydrolysis+in+M&#252;ller+glia.">Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in M&#252;ller glia.</a> Glia. 9 (2), 127-135 (1993).</li><li>Ventura, A. L., de Mello, F. G., de Melo Reis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+dopamine+research+in+retina+cells.">Methods of dopamine research in retina cells.</a> Methods in Molecular Biology. 964, 25-42 (2013).</li><li>Miras-Portugal, M. T., Sebasti&#225;n-Serrano, &. #. 1. 9. 3. ;., de Diego Garc&#237;a, L., D&#237;az-Hern&#225;ndez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+P2X7+Receptor:+Involvement+in+Neuronal+Physiology+and+Pathology.">Neuronal P2X7 Receptor: Involvement in Neuronal Physiology and Pathology.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7063-7072 (2017).</li><li>Illes, P., Khan, T. M., Rubini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+P2X7+Receptors+Revisited:+Do+They+Really+Exist.">Neuronal P2X7 Receptors Revisited: Do They Really Exist.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7049-7062 (2017).</li><li>Schitine, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+plasticity+of+GAT-3+in+avian+M&#252;ller+cells+is+regulated+by+neurons+via+a+glutamatergic+input.">Functional plasticity of GAT-3 in avian M&#252;ller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input.</a> Neurochemistry International. 82, 42-51 (2015).</li><li>Ferreira, D. D., Stutz, B., de Mello, F. G., Reis, R. A., Kubrusly, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+potentiates+the+release+of+GABA+mediated+by+NMDA+receptor+activation:+Involvement+of+A1+adenosine+receptors.">Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A1 adenosine receptors.</a> Neuroscience. 281, 208-215 (2014).</li><li>Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+receptor+large+pore+signaling+in+avian+M&#252;ller+glial+cells.">P2X7 receptor large pore signaling in avian M&#252;ller glial cells.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).</li><li>Passos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Serotonergic+System+by+Kainate+in+the+Avian+Retina.">Regulation of the Serotonergic System by Kainate in the Avian Retina.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 1039-1049 (2019).</li><li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L., Schitine, C. S., de Mello, M. C., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina:+neurotransmitters+and+trophic+factors.">M&#252;ller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochemical Research. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li><li>Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliotransmitter+Release+from+Astrocytes:+Functional+Developmental,+and+Pathological+Implications+in+the+Brain.">Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional Developmental, and Pathological Implications in the Brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 499. 9, 499 (2015).</li></ol>

Abbiamo usato il tessuto retinico per dimostrare che le risposte calciche mediate da KCl o ATP sono chiaramente compartimentate in risposte neuronali e gliali, rispettivamente (Figura 1). Sebbene alcuni dati in letteratura implichino che i recettori P2X7 siano espressi in neuroni, che regolano l'attività neuronale e il rilascio di neurotrasmettitori sinaptici20, altri autori mettono in dubbio l'esistenza di recettori P2X7 neuronali. In effetti, i risultati attuali so...

A causa delle proprietà universali del calcio come secondo messaggero, questo ione è coinvolto in un vasto numero di attività di segnalazione: trascrizione genica, nascita e morte, proliferazione, migrazione e differenziazione, trasmissione sinaptica e plasticità. Quindi, un metodo in grado di tracciare le dinamiche di attivazione del calcio con fedeltà e agilità fornirebbe un modo per osservare risposte spazio-temporali uniche. Tale metodo è la tecnica di imaging del calcio cellulare, che correla i dati funzionali degli spostamenti del calcio con fenotipi cellulari specifici in base alle loro risposte distinte.
Le sonde Ca2+ sono state sviluppate per la prima volta nel 1980, con miglioramenti successivi che hanno permesso a queste molecole di essere utilizzate in saggi di cellule vive1. Come indicatore chimico, Fura-2 è considerato lo standard per le misurazioni quantitative [Ca2+]i. L'estere acetosimetilico (AM) di questo indicatore (cioè Fura-2 AM) permea facilmente la membrana cellulare e può raggiungere concentrazioni intracellulari 20 volte superiori alla diluizione di incubazione (ad esempio, [5 μM]o/[100 μM]i). Un altro vantaggio di Fura-2 è che ha una buona resistenza al fotosbiancamento; pertanto, l'imaging di questo indicatore per periodi di tempo più lunghi non influenzerà notevolmente le sue capacità di fluorescenza. Infine, Fura-2 è sensibile a una vasta gamma di livelli di calcio, da ~ 100 nM a ~ 100 μM, e ha un Kd di ~ 145 nM, che è paragonabile al riposante [Ca2 +] i2. Successivamente, l'imaging del calcio cellulare è stato sviluppato con microscopi fluorescenti e metodi di calcolo migliori, insieme a sonde raziometriche che non sono influenzate dal carico del colorante.
Ogni cellula esprime diversi dispositivi di calcio (pompe, trasportatori, recettori e canali) che contribuiscono alla risposta finale come una particolare firma. Il consiglio importante è quello di trovare risposte selettive di diversi tipi di cellule correlate con la loro espressione fenotipica. Di conseguenza, ci sono almeno due diversi recettori che operano attraverso gli spostamenti del calcio: i recettori ionotropici che permeano Ca2 + in modo veloce e recettori metabotropici lenti accoppiati a vie di segnalazione e stock intracellulari che rilasciano Ca2 + attivato da secondi messaggeri, come l'inositolo trifosfato e l'ADP-ribosio ciclico3.
Ad esempio, le cellule progenitrici esprimono la nestin nella retina immatura e mostrano recettori GABAA depolarizzati dal GABA (o muscimolo)4. Ciò accade a causa del gradiente elettrochimico Cl- con alti livelli intracellulari di Cl− ; man mano che il tessuto si sviluppa, i trasportatori KCC2 passano dall'eccitazione sui progenitori all'inibizione sui neuroni GABAergici maturi5. D'altra parte, le cellule staminali che esprimono sox-2 nella zona subventricolare immatura (SVZ) dei roditori postnatali presentano anche recettori H1 metabotropici attivati dall'istamina che aumenta Il Ca2+ in modo lento6. Un secondo recettore metabotropico della famiglia par-1 (1) attivato dalla proteasi, attivato dalla trombina e a valle di G(q/11) e fosfolipasi C (PLC), fornisce lenti spostamenti di Ca2+ negli oligodendrociti (che esprimono O4 e PLP) generati da cellule staminali neurali SVZ multipotenti7.
In generale, i neuroni esprimono canali del calcio voltaggio-dipendenti e i principali recettori dei neurotrasmettitori permeabili al Ca2+, come i recettori glutamatergici (AMPA, NMDA, kainate) e periferici e centrali. Il cloruro di potassio viene solitamente utilizzato come agente depolarizzante per attivare i neuroni periferici, come i neuroni gangliari della radice dorsale8 o i neuroni centrali, come dalla zona subventricolare9 o retina10. D'altra parte, l'ATP è riconosciuto come il principale gliotrasmettitore (oltre alla D-serina), che attiva i membri P2X permeabili selettivi al Ca2 +, come P2X7 e P2X4. Entrambi i recettori presentano correnti di Ca2+ equivalenti, simili a quelle mostrate dai recettori NMDA riconosciuti come le più grandi correnti di Ca2+ attivate dai trasmettitori11. I recettori P2X7 sono altamente espressi sulle microglia, ma a una densità inferiore su astrociti e oligodendrociti, avendo un ruolo nel rilascio di citochine proinfiammatorie12. I recettori P2X7 sono espressi anche sulle cellule di Schwann13 e sulla glia di Müller nella retina14,15.
La retina è nota per mostrare quasi tutti i trasmettitori osservati nel cervello. Ad esempio, l'asse verticale (fotorecettori, cellule gangliari bipolari e retiniche) è principalmente glutamatergico, con AMPA permeabili al calcio o recettori kainate espressi in cellule OFF-bipolari e mgluR6 espresso in cellule ON-bipolari16. Curiosamente, tutti e tre i recettori si trovano anche nella glia di Müller, che sono accoppiati alle vie del calcio e dell'inositolo trifosfato17,18. L'asse inibitorio orizzontale, costituito da cellule orizzontali e amacrine, secerne non solo GABA, ma anche dopamina, acetilcolina e altri neurotrasmettitori classici. Le cellule amacrine sono i principali tipi di cellule presenti nelle colture retiniche aviarie, mostrando diversi tipi di canali gestiti dal calcio, come i canali del calcio glutamatergici, purinergici, nicotinici e voltaggio-dipendenti. Per questo motivo, questo è un ottimo modello per valutare le diverse proprietà degli spostamenti di calcio tra neuroni e glia.
Pertanto, la combinazione di diversi recettori e canali sommati a marcatori fenotipici selettivi durante lo sviluppo con distinti modelli di risposta agonista consente firme uniche in stelo, progenitore, neurone, astrocita, oligodendrocita e microglia che operano attraverso dispositivi di segnalazione selettiva.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mm coverslip</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>111550</td>
			<td>Cell suport</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>510 nm long-pass filter</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Suplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP digital camera</td>
			<td>Roper Scientific, Trenton, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Neon</td>
			<td>1466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/ F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12400-24</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel Software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Suplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Axiovert 200; Carl Zeiss</td>
			<td>B 40-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F1221</td>
			<td>Ratiometric Ca2+ indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>1405-41-0</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DG-4 apparatus</td>
			<td>Sutter Instrument, Novato, CA</td>
			<td>DG-4PLUS/OF30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Help cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metafluor software</td>
			<td>Universal Imaging Corp. West Chester, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Vetec</td>
			<td>129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Isofar</td>
			<td>310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Vetec</td>
			<td>306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH3 platform</td>
			<td>Warner Intruments, Hamden, CT</td>
			<td>64-0286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P6866</td>
			<td>nonionic, surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Help cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing shifts on neuron-glia circuit with the calcium imaging technique

Qui, riportiamo modelli selettivi in vitro di circuiti basati su glia (astrociti, oligodendrociti e microglia) e / o neuroni da tessuti periferici (gangli della radice dorsale) e centrali (corteccia, zona subventricolare, organoide) che sono dinamicamente studiati in termini di spostamenti di calcio. Il modello scelto per illustrare i risultati è la retina, un tessuto semplice con complesse interazioni cellulari. Il calcio è un messaggero universale coinvolto nella maggior parte dei ruoli cellulari importanti. Spieghiamo in un protocollo passo-passo come le cellule neuronali-gliali retiniche in coltura possono essere preparate e valutate, immaginando spostamenti di calcio. In questo modello, differenziamo i neuroni dalla glia in base alla loro risposta selettiva a KCl e ATP. I recettori e i canali permeabili al calcio sono espressi selettivamente in diversi compartimenti. Per analizzare le risposte al calcio, utilizziamo stampi fluorescenti raziometrici come Fura-2. Questa sonda quantifica la concentrazione libera di Ca2+ in base alle forme Ca2+-free e Ca2+-bound, presentando due diversi picchi, fondati sull'intensità di fluorescenza percepita su due lunghezze d'onda.

Qui, abbiamo usato le cellule della retina in coltura dai pulcini embrionali del giorno 8 per studiare come i neuroni e la glia segnalano in termini di spostamenti di calcio. Le colture sono state preparate essenzialmente come descritto15,19 come cellule miste neurone-gliali (ad una densità di ≥ 1 x 106 cellula/piatto) in una fase di 7 giorni in vitro (Figura 1A). In alternativa, cellule neuronali arricchite preparate i...

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Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

L'imaging cellulare del calcio è una metodologia versatile per studiare la segnalazione dinamica di singole cellule, su popolazioni miste in coltura o anche su animali risvegliati, basata sull'espressione di canali/recettori permeabili al calcio che danno firme funzionali uniche.

Visualizzazione dei cambiamenti sul circuito Neuron-Glia con la tecnica di imaging del calcio

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di monitorare i cambiamenti nelle concentrazioni di calcio citosolico nelle cellule vive per differenziare le risposte neuronali o gliali in base al cloruro di potassio o agli stimoli ATP. Il calcio è un importante secondo messaggero coinvolto in diversi processi cellulari, tra cui neurotrasmissione, plasticità e apoptosi. L'avvento del colorante di calcio fluorescente ad alta selettività, come Fura-2 AM, associato allo sviluppo di migliori microscopi fluorescenti e metodi di calcolo, ha prodotto dati ottici ad alta risoluzione con un alto grado di risoluzione spaziale e temporale per l'immagine della segnalazione del calcio su cellule e organismi viventi.Questo protocollo è adattabile a neuroni arricchiti, glia purificati o colture a popolazione mista. Tiene traccia di quali tipi di cellule hanno risposto a determinati stimoli in base alla risposta differenziale al cloruro di potassio e all'ATP. Il cloruro di potassio modifica il potenziale di membrana della cellula.E questo apre canali del calcio voltaggio-dipendenti, espressi essenzialmente dai neuroni. D'altra parte, ATP attiva il canale P2X7 di grandi dimensioni, presente principalmente nelle cellule gliali. Accoppiando gli stimoli del cloruro di potassio e dell'ATP con altri farmaci, è possibile vedere quale compartimento del sistema nervoso sta rispondendo a loro, in base all'aumento della concentrazione intracellulare di calcio.Per questa procedura, avrai bisogno di alcuni strumenti chirurgici o pinzette. Utilizzare un armadio di biosicurezza ed eseguire le migliori pratiche per evitare la contaminazione. Per iniziare la coltura della retina di pollo, aprire con attenzione un uovo fecondato sul fondo, dove si trova la cellula dell'aria.Rimuovere il contenuto in una capsula di Petri e procedere con la donazione dell'embrione per decapitazione con un paio di pinzette. Una volta rimossa la testa, portarla in una capsula di Petri pulita e aggiungere una soluzione priva di calcio e magnesio. Quindi, rimuovere gli occhi, facendo attenzione a non danneggiarli nel processo.Portare l'occhio su un'altra capsula di Petri contenente soluzione di CMF. Con un paio di pinzette, inizia a sezionare l'occhio rimuovendo la lente. Quindi, partendo dal foro lasciato dalla lente, fai tre o quattro tagli longitudinali nell'occhio.Rimuovere il corpo vitreo trasparente con cautela. Assicurarsi che la retina non sia legata ad essa. Quindi, staccare delicatamente la retina dall'epitelio pigmentato.Rimuovere qualsiasi tessuto epiteliale rimanente. Quando la retina è totalmente chiara, tagliarla a pezzetti. Prendi tutto il tessuto della retina con l'aiuto di una pipetta automatizzata.Centrifugare brevemente la retina per rimuovere tutta la CMF. Aggiungere 1 ml di 0,25% di tripsina. E incubare il tessuto a 37 ° C per 10 minuti.Interrompere la reazione alla tripsina aggiungendo 1 mL di mezzo contenente il 10% di siero fetale del vitello. Centrifugare la retina per rimuovere tutta la tripsina. Lavare le cellule due o tre volte con un mezzo contenente il 10% di FCS.Quindi, aggiungere 2 ml di mezzo per retina e dissociarlo delicatamente meccanicamente. Diluire le cellule in modo da poterle contare correttamente con un emocitometro. Utilizzare coperture da 15 mm protette con poli-L-lisina e laminina per aiutare l'adesione cellulare.Pipettare 50 L delle cellule diluite su ogni coverslip. Incubare le cellule a 37 C in atmosfera al 5% di CO2. E raffreddarli per attaccare il bicchiere.Questo dovrebbe richiedere circa una o due ore. Aggiungere 1 mL di mezzo e restituirlo all'incubatrice fino al giorno dell'esperimento. Se necessario, cambiare metà del mezzo ogni due o tre giorni.Ricostituire un flaconcino da 50 g di Fura-2 AM con 50 L di DMSO. La soluzione di Krebs è una buona opzione per trasferire le cellule durante l'esperimento, perché non interferisce con la misurazione della fluorescenza. Preriscaldare la soluzione a 37 prima di iniziare.Aggiungere Poloxamer 407. Aggiungi Fura-2 AM e DMSO. Sonicatelo per sette minuti a bagnomaria.Preparare una piastra a 6 pozzetti aggiungendo la soluzione krebs a tre pozzetti e la soluzione Fura-2 funzionante su un altro. Lavare il coverslip contiene le cellule tre volte prima di aggiungere al fura-2 bene. Incubare le cellule a 37 C e 5% di CO2 per 30 minuti in un incubatore buio.Dopo l'incubazione, lavarlo di nuovo tre volte. Trasferiscilo a un altro recipiente contenente Krebs e proteggilo dalla luce. È possibile riutilizzare il Fura-2 preparato per incubare più coverslip con le cellule.Aggiungere silicio al supporto e alla camera del coperchio prima di ogni corsa per evitare perdite di soluzione. Estrarre il coverslip dalla soluzione di Krebs e lavare accuratamente il fondo con acqua distillata per evitare la cristallizzazione del sale sulla lente del microscopio. Metti la coverslip sul supporto, premendo i bordi con cautela.Collegare il supporto e la camera del coverslip al microscopio e iniziare a perfondere le cellule con la soluzione di Krebs. Selezionare le celle appropriate e scegliere un buon campo. Determinare manualmente le regioni di interesse selezionando i corpi cellulari in base alla loro morfologia distinta.Le variazioni della concentrazione di calcio sono state valutate quantificando il rapporto della fluorescenza emessa a 510 nm a seguito di eccitazione alternata a 340 e 380 nm. Dopo aver aggiunto cloruro di potassio è possibile vedere molte cellule incandescenti e la risposta di fluorescenza che si alza sul grafico. Il cloruro di potassio apre canali del calcio voltaggio-dipendenti, presenti principalmente nei neuroni.Ogni singola linea del grafico rappresenta la regione unica di interesse. Pertanto, è possibile tenere traccia delle singole risposte cellulari durante l'esperimento. Gli stimoli ATP aprono il recettore P2X7, essenzialmente espresso dalle cellule gliali.Questa è una cultura neuronale arricchita. Pertanto, ci sono poche cellule gliali qui. Questo è il motivo per cui così poche cellule rispondono agli stimoli dell'ATP.I valori acquisiti sono stati elaborati utilizzando il software Metafluor. I risultati sperimentali sono espressi in una tabella excel, in cui ogni riga rappresenta una singola cella e ogni riga un punto temporale. Utilizzando il software Excel, è possibile tracciare separatamente le variazioni di calcio delle singole celle o di tutte sullo stesso grafico.Per quantificare la quantità di cellule reattive a qualsiasi stimolo, impostare un cutoff del 30% aumentando i livelli basali di calcio. Qui usiamo cellule della retina in coltura da pulcini embrionali del giorno 8 per studiare come i neuroni e la glia segnalano in termini di spostamenti di calcio, dopo aver ricevuto 50 mm di cloruro di potassio e 1 mm di STIMOLI ATP. In ogni esperimento, circa 100 cellule sono state prontamente analizzate.La figura A rappresenta una coltura mista contenente sia neuroni che glia, che è stata mantenuta per una settimana. Quando quantifichiamo le risposte, è possibile vedere che circa la metà delle cellule analizzate risponde al cloruro di potassio e l'altra metà risponde all'ATP. La figura B si riferisce a una cultura arricchita di neuroni.È stato incubato per soli tre giorni, quindi la maggior parte delle cellule gliali non si è ancora differenziata. In questo caso, l'89% delle cellule risponde al cloruro di potassio, rafforzando la prevalenza dei neuroni. La figura C mostra una cultura glia purificata.Queste cellule sono state mantenute per 10 giorni con cambiamenti medi ogni tre giorni. Dopo quel tempo la maggior parte dei neuroni muore, lasciando solo glia. In effetti, questa cultura è stata attivata esclusivamente dall'ATP.Questa metodologia è stata ampiamente utilizzata a causa delle proprietà universali del calcio come secondo messaggero. L'analisi fenotipica può essere migliorata completando questa metodologia con l'immunochimica delle cellule fisse dopo l'imaging del calcio. Questo protocollo potrebbe anche essere adattato ad altri sistemi cellulari misti che esprimono altri canali del calcio.Il consiglio importante è quello di trovare risposte selettive di diversi tipi di cellule correlate con la loro espressione fenotipica.

Research

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Neuroscience

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Neuroscienze

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