Name: visualizing shifts on neuron-glia circuit with the calcium imaging technique
Uploaded: 2022-04-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique at JoVE.com

Bolsas, patrocinadores e fontes de financiamento: A MS é beneficiária de uma bolsa de doutorado do CNPq. A HRF é beneficiária de uma bolsa pós-doutorado apoiada pelo CNPq (número de bolsas do HRF 152071/2020-2). O RAMR conta com o apoio do CNPq e da FAPERJ (números de bolsas E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 e 312157/2016-9 e INCT-INNT (Instituto Nacional de Neurociências Translacionais).

Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados e realizados seguindo as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Federal do Rio de Janeiro, seguindo os "Princípios do Cuidado Animal Laboratorial" (NIH, Bethesda, EUA); permitir o número IBCCF-035 para ovos de galinha leghorn branco fertilizados.
1. Preparação de soluções
<ol><li>Prepare a solução Krebs: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,4 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2<...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+homeostasis+in+intact+lymphocytes:+cytoplasmic+free+calcium+monitored+with+a+new,+intracellularly+trapped+fluorescent+indicator.">Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator.</a> Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li><li>Islam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling:+From+Basic+to+Bedside.">Calcium Signaling: From Basic to Bedside.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).</li><li>De Melo Reis, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+of+cell+phenotypes+differentiating+from+mice+retinal+neurospheres+using+single+cell+calcium+imaging.">Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).</li><li>Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+itself+promotes+the+developmental+switch+of+neuronal+GABAergic+responses+from+excitation+to+inhibition.">GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition.</a> Cell. 105 (4), 521-532 (2001).</li><li>Schitine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ampakine+CX546+increases+proliferation+and+neuronal+differentiation+in+subventricular+zone+stem/progenitor+cell+cultures.">Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis:+a+role+for+hemopressin.">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).</li><li>Ribeiro-Resende, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+GD3+synthase+display+morphological+abnormalities+in+the+sciatic+nerve+and+neuronal+disturbances+during+peripheral+nerve+regeneration.">Mice lacking GD3 synthase display morphological abnormalities in the sciatic nerve and neuronal disturbances during peripheral nerve regeneration.</a> PLoS One. 9 (10), 108919 (2014).</li><li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+type+1+cannabinoid+receptor+(CB1R)+promotes+neurogenesis+in+murine+subventricular+zone+cell+cultures.">Activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R) promotes neurogenesis in murine subventricular zone cell cultures.</a> PLoS One. 8 (5), 63529 (2013).</li><li>Kubrusly, R. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-glial+cannabinoid+receptors+modulate+signaling+in+the+embryonic+avian+retina.">Neuro-glial cannabinoid receptors modulate signaling in the embryonic avian retina.</a> Neurochemistry International. 112, 27-37 (2018).</li><li>Egan, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+calcium+ions+to+P2X+channel+responses.">Contribution of calcium ions to P2X channel responses.</a> Journal of Neuroscience. 24 (13), 3413-3420 (2004).</li><li>Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+Receptors+Amplify+CNS+Damage+in+Neurodegenerative+Diseases.">P2X7 Receptors Amplify CNS Damage in Neurodegenerative Diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).</li><li>Faroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signaling+mediated+by+P2X7+receptors+controls+myelination+in+sciatic+nerves.">Purinergic signaling mediated by P2X7 receptors controls myelination in sciatic nerves.</a> Journal of Neuroscience Research. 92 (10), 1259-1269 (2014).</li><li>Freitas, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+Induce+Cell+Death+and+Promote+P2X7+Receptor+Signaling+in+Retinal+Glial+Progenitors+in+Culture.">Cannabinoids Induce Cell Death and Promote P2X7 Receptor Signaling in Retinal Glial Progenitors in Culture.</a> Molecular Neurobiology. 56 (9), 6472-6486 (2019).</li><li>Freitas, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione-Induced+Calcium+Shifts+in+Chick+Retinal+Glial+Cells.">Glutathione-Induced Calcium Shifts in Chick Retinal Glial Cells.</a> PLoS One. 11 (4), 0153677 (2016).</li><li>Yang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+receptors+for+glutamate+and+GABA+in+retinal+neurons.">Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons.</a> Progress in Neurobiology. 73 (2), 127-150 (2004).</li><li>Reis, R. A., Kubrusly, R. C., de Mello, M. C., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+coupling+of+NMDA+receptor+with+ip3+production+in+cultured+cells+of+the+avian+retina.">Transient coupling of NMDA receptor with ip3 production in cultured cells of the avian retina.</a> Neurochemistry International. 26 (4), 375-380 (1995).</li><li>L&#243;pez-Colom&#233;, A. M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+amino+acid-induced+phosphoinositide+hydrolysis+in+M&#252;ller+glia.">Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in M&#252;ller glia.</a> Glia. 9 (2), 127-135 (1993).</li><li>Ventura, A. L., de Mello, F. G., de Melo Reis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+dopamine+research+in+retina+cells.">Methods of dopamine research in retina cells.</a> Methods in Molecular Biology. 964, 25-42 (2013).</li><li>Miras-Portugal, M. T., Sebasti&#225;n-Serrano, &. #. 1. 9. 3. ;., de Diego Garc&#237;a, L., D&#237;az-Hern&#225;ndez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+P2X7+Receptor:+Involvement+in+Neuronal+Physiology+and+Pathology.">Neuronal P2X7 Receptor: Involvement in Neuronal Physiology and Pathology.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7063-7072 (2017).</li><li>Illes, P., Khan, T. M., Rubini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+P2X7+Receptors+Revisited:+Do+They+Really+Exist.">Neuronal P2X7 Receptors Revisited: Do They Really Exist.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7049-7062 (2017).</li><li>Schitine, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+plasticity+of+GAT-3+in+avian+M&#252;ller+cells+is+regulated+by+neurons+via+a+glutamatergic+input.">Functional plasticity of GAT-3 in avian M&#252;ller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input.</a> Neurochemistry International. 82, 42-51 (2015).</li><li>Ferreira, D. D., Stutz, B., de Mello, F. G., Reis, R. A., Kubrusly, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+potentiates+the+release+of+GABA+mediated+by+NMDA+receptor+activation:+Involvement+of+A1+adenosine+receptors.">Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A1 adenosine receptors.</a> Neuroscience. 281, 208-215 (2014).</li><li>Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+receptor+large+pore+signaling+in+avian+M&#252;ller+glial+cells.">P2X7 receptor large pore signaling in avian M&#252;ller glial cells.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).</li><li>Passos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Serotonergic+System+by+Kainate+in+the+Avian+Retina.">Regulation of the Serotonergic System by Kainate in the Avian Retina.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 1039-1049 (2019).</li><li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L., Schitine, C. S., de Mello, M. C., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina:+neurotransmitters+and+trophic+factors.">M&#252;ller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochemical Research. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li><li>Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliotransmitter+Release+from+Astrocytes:+Functional+Developmental,+and+Pathological+Implications+in+the+Brain.">Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional Developmental, and Pathological Implications in the Brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 499. 9, 499 (2015).</li></ol>

Usamos o tecido da retina para mostrar que as respostas de cálcio mediadas por KCl ou ATP são claramente compartimentadas em respostas neuronais e gliais, respectivamente (Figura 1). Embora alguns dados na literatura impliquem que os receptores P2X7 sejam expressos em neurônios, que regulam a atividade neuronal e a liberação de neurotransmissores sinápticos20, outros autores questionam a existência de receptores P2X7 neuronais. De fato, os resultados atuais sus...

Devido às propriedades universais do cálcio como segundo mensageiro, este íon está envolvido em um grande número de atividades de sinalização: transcrição genética, nascimento e morte, proliferação, migração e diferenciação, transmissão sináptica e plasticidade. Assim, um método capaz de rastrear a dinâmica de ativação de cálcio com fidelidade e agilidade forneceria uma maneira de observar respostas espaciais-temporais únicas. Tal método é a técnica de imagem de cálcio celular, que correlaciona dados funcionais de cálcio com fenótipos celulares específicos com base em suas respostas distintas.
As sondas Ca2+ foram desenvolvidas pela primeira vez na década de 1980, com melhorias posteriores permitindo que essas moléculas fossem usadas em ensaios de células vivas1. Como indicador químico, a Fura-2 é considerada o padrão para medições quantitativas [Ca2+]i. O éster de acetoximilo (AM) deste indicador (ou seja, Fura-2 AM) permeia facilmente a membrana celular e pode atingir concentrações intracelulares 20 vezes maiores que a diluição de incubação (por exemplo, [5 μM]o/[100 μM]i). Outra vantagem da Fura-2 é que ele tem boa resistência fotobleaching; assim, a imagem deste indicador por períodos mais longos de tempo não afetará muito suas capacidades de fluorescência. Finalmente, a Fura-2 é sensível a uma ampla gama de níveis de cálcio, de ~100 nM a ~100 μM, e tem um Kd de ~145 nM, que é comparável ao repouso [Ca2+]i2. Posteriormente, a imagem de cálcio celular foi desenvolvida com melhores microscópios fluorescentes e métodos de computação, juntamente com sondas racionmétricas que não são afetadas pelo carregamento de corantes.
Cada célula expressa diferentes dispositivos de cálcio (bombas, transportadores, receptores e canais) que contribuem para a resposta final como uma assinatura particular. A dica importante é encontrar respostas seletivas de diferentes tipos de células correlacionadas com sua expressão fenotípica. Assim, existem pelo menos dois receptores diferentes que operam através de mudanças de cálcio: receptores ionotróricos que permeiam o Ca2+ em um modo rápido e receptores metabotrópicos lentos acoplados a vias de sinalização e estoques intracelulares que liberam Ca2+ ativados por terceiros, como triphosfato inositol e ADP-ribose3 cíclico.
Por exemplo, as células progenitoras expressam nestin na retina imatura e mostram receptores GABAA despolarizados por GABA (ou muscimol)4. Isso acontece devido ao gradiente cl-eletroquímico com altos níveis de Cl intracelular; à medida que o tecido se desenvolve, os transportadores KCC2 mudam de excitação em progenitores para inibição em neurônios GABAérgicos maduros5. Por outro lado, células-tronco que expressam sox-2 na imatura zona subventricular (SVZ) de roedores pós-natais também apresentam receptores metabotrópicos H1 ativados pela histamina aumentando Ca2+ de forma lenta6. Um segundo receptor metabotrópico da família receptor-1 (PAR-1) ativado por trombina e rio abaixo para G (q/11) e fosfolipase C (PLC), dá mudanças lentas de Ca2+ em oligodendrocytes (que expressam O4 e PLP) gerados a partir de células-tronco neurais SVZ multipotentes7.
Em geral, os neurônios expressam canais de cálcio dependentes de tensão, bem como os principais receptores neurotransmissores permeáveis ao Ca2+, como glutamatergicos (AMPA, NMDA, kainate) e receptores nicotínicos periféricos e centrais. Cloreto de potássio é geralmente usado como um agente despolarizador para ativar neurônios periféricos, como os neurônios gânglios raiz dorsal8 ou neurônios centrais, a partir de zona subventricular9 ou retina10. Por outro lado, a ATP é reconhecida como o principal gliotransmissor (além do D-serine), que ativa membros P2X permeáveis seletivos Ca2+, como P2X7 e P2X4. Ambos os receptores apresentam correntes ca2+equivalentes, semelhantes às mostradas pelos receptores NMDA reconhecidas como as maiores correntes Ca2+ ativadas pelos transmissores11. Os receptores P2X7 são altamente expressos em microglia, mas em uma densidade menor em astrócitos e oligodendrócitos, tendo um papel na liberação de citocinas proinflamatórias12. Os receptores P2X7 também são expressos nas células Schwann13 e Müller glia na retina14,15.
A retina é conhecida por mostrar quase todos os transmissores vistos no cérebro. Por exemplo, o eixo vertical (fotorreceptores, células gânglios bipolares e retina) é principalmente glutamatergicos, com receptores AMPA permeáveis de cálcio ou kainate expressos em células OFF-bipolar e mgluR6 expressos em células ON-bipolar16. Curiosamente, todos os três receptores também são encontrados em Müller glia, que são acoplado a caminhos triptosfato de cálcio e inositol17,18. O eixo inibitório horizontal, feito por células horizontais e amacrinas, secretam não apenas gaba, mas também dopamina, acetilcolina e outros neurotransmissores clássicos. As células amacrinas são os principais tipos de células encontradas nas culturas de retina aviária, mostrando vários tipos de canais operados por cálcio, como canais glutamatericos, purinérgicos, nicotinicos e de cálcio dependentes de tensão. Por essa razão, este é um excelente modelo para avaliar diferentes propriedades de mudanças de cálcio entre neurônios e glia.
Portanto, a combinação de diferentes receptores e canais resumidos a marcadores fenotípicos seletivos durante o desenvolvimento com padrões de resposta agonista distintos permite assinaturas únicas em haste, progenitor, neurônio, astrócito, oligodendrocyte e microglia que operam através de dispositivos de sinalização seletiva.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mm coverslip</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>111550</td>
			<td>Cell suport</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>510 nm long-pass filter</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Suplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP digital camera</td>
			<td>Roper Scientific, Trenton, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Neon</td>
			<td>1466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/ F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12400-24</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel Software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Suplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Axiovert 200; Carl Zeiss</td>
			<td>B 40-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F1221</td>
			<td>Ratiometric Ca2+ indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>1405-41-0</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DG-4 apparatus</td>
			<td>Sutter Instrument, Novato, CA</td>
			<td>DG-4PLUS/OF30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Help cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metafluor software</td>
			<td>Universal Imaging Corp. West Chester, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Vetec</td>
			<td>129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Isofar</td>
			<td>310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Vetec</td>
			<td>306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH3 platform</td>
			<td>Warner Intruments, Hamden, CT</td>
			<td>64-0286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P6866</td>
			<td>nonionic, surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>Help cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing shifts on neuron-glia circuit with the calcium imaging technique

Aqui, relatamos modelos in vitro seletivos de circuitos baseados em glia (astrócitos, oligodendrócitos e microglia) e/ou neurônios de tecidos periféricos (gânglios raiz dorsal) e centrais (córtex, zona subventricular, organoide) que são estudados dinamicamente em termos de mudanças de cálcio. O modelo escolhido para ilustrar os resultados é a retina, um tecido simples com interações celulares complexas. O cálcio é um mensageiro universal envolvido na maioria dos papéis celulares importantes. Explicamos em um protocolo passo-a-passo como as células neuron-glial da retina na cultura podem ser preparadas e avaliadas, imaginando mudanças de cálcio. Neste modelo, diferenciamos neurônios da glia com base em sua resposta seletiva ao KCl e ATP. Receptores e canais permeáveis de cálcio são expressos seletivamente em diferentes compartimentos. Para analisar as respostas de cálcio, usamos mortes fluorescentes racionmétricas como fura-2. Esta sonda quantifica a concentração gratuita de Ca2+ com base em formas ligadas a Ca2+e Ca2+, apresentando dois picos diferentes, fundadas na intensidade de fluorescência percebida em dois comprimentos de onda.

Aqui, usamos células de retina na cultura a partir de filhotes embrionários do dia 8 para investigar como neurônios e glia sinal em termos de mudanças de cálcio. As culturas foram preparadas essencialmente como descritas15,19 como células neurônio-glial mistas (a uma densidade de ≥ 1 x 106 célula/prato) em um estágio de 7 dias in vitro (Figura 1A). Alternativamente, células neuronais enriquecidas preparadas em ...

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Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

A imagem celular de cálcio é uma metodologia versátil para estudar a sinalização dinâmica de células individuais, em populações mistas na cultura ou mesmo em animais despertados, com base na expressão de canais/receptores permeáveis de cálcio que dão assinaturas funcionais únicas.

Visualizando mudanças no Circuito Neuron-Glia com a Técnica de Imagem de Cálcio

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

O objetivo geral deste procedimento é monitorar mudanças nas concentrações citosóicas de cálcio em células vivas para diferenciar respostas neuronais ou glia com base em cloreto de potássio, ou estímulos ATP. O cálcio é um importante segundo mensageiro envolvido em vários processos celulares, incluindo neurotransmissão, plasticidade e apoptose. O advento do corante de cálcio fluorescente de alta resolução, como o Fura-2 AM, associado ao desenvolvimento de melhores microscópios fluorescentes e métodos de computação, produziu dados ópticos de alta resolução com alto grau de resolução espacial e temporal para a sinalização de cálcio de imagem em células e organismos vivos.Este protocolo é adaptável a neurônios enriquecidos, glia purificada ou culturas populacionais mistas. Ele rastreia quais tipos de células responderam a estímulos determinantes com base na resposta diferencial ao cloreto de potássio e ATP. O potencial de membrana da célula de alteração do cloreto de potássio.E isso abre canais de cálcio fechados de tensão, expressos essencialmente por neurônios. Por outro lado, a ATP ativa o canal P2X7 em grande parte, presente principalmente em células gliais. Ao acoplar cloreto de potássio e estímulos ATP com outras drogas, é possível ver qual compartimento do sistema nervoso está respondendo a eles, com base no aumento da concentração de cálcio intracelular.Para este procedimento, você precisará de alguns instrumentos cirúrgicos ou pinças. Use um armário de biossegurança e realize as melhores práticas para evitar contaminação. Para iniciar a cultura da retina de frango, abra cuidadosamente um óvulo fertilizado pelo fundo, onde a célula de ar está localizada.Remova o conteúdo para uma placa de Petri e proceda com a doação de embriões por decapitação com um par de pinças. Uma vez que a cabeça é removida, leve-a para uma placa de Petri limpa e adicione um pouco de solução livre de cálcio e magnésio a ela. Em seguida, remova os olhos, tomando cuidado para não danificá-los no processo.Leve o olho para outra placa de Petri contendo solução CMF. Com um par de pinças, comece a dissecar o olho removendo a lente. Em seguida, começando pelo orifício deixado pela lente, faça três ou quatro cortes longitudinais no olho.Remova o corpo vítreo transparente com cuidado. Certifique-se de que a retina não está se ligando a ela. Em seguida, desprende suavemente a retina do epitélio pigmentado.Remova qualquer tecido epitelial restante. Quando a retina estiver totalmente clara, corte-a em pequenos pedaços. Pegue todo o tecido da retina com a ajuda de uma pipeta automatizada.Centrifufique brevemente a retina para remover todo o CMF. Adicione 1 mL de 0,25% de trippsina. E incubar o tecido a 37 C por 10 minutos.Pare a reação de trippsina adicionando 1 mL de meio contendo soro de bezerro fetal de 10%. Centrifugar a retina para remover toda a trippsina. Lave as células duas ou três vezes com meio contendo 10% DE FCS.Em seguida, adicione 2 mL de médio por retina e dissocia-o suavemente mecanicamente. Diluir as células para que você possa contá-las adequadamente com um hemótmetro. Use tampas de 15 mm protegidas com poli-L-lisina e laminina para ajudar a adesão celular.Pipeta 50 L de suas células diluídas em cada deslizamento de cobertura. Incubar as células a 37 C em atmosfera de CO2 de 5%. E esfriá-los para anexar o vidro.Isso deve levar cerca de uma a duas horas. Adicione 1 mL de meio e devolva-o à incubadora até o dia do experimento. Se necessário, troque metade do meio a cada dois ou três dias.Reconstitua um frasco de 50 g de Fura-2 AM com 50 L de DMSO. A solução krebs é uma boa opção para transferir células durante o experimento, porque não interfere na medição da fluorescência. Pré-aqueça a solução para 37 antes de começar.Adicione Poloxamer 407. Adicione Fura-2 AM e DMSO. Sonicate-lo por sete minutos em um banho de água.Prepare uma placa de 6 poços adicionando solução Krebs a três poços e a solução Fura-2 em funcionamento em outro. Lave a tampa conter suas células três vezes antes de adicionar ao poço Fura-2. Incubar as células a 37 C e 5% de CO2 atmosfera por 30 minutos em uma incubadora escura.Depois da incubação, lave-o três vezes novamente. Transfira para outro destinatário contendo Krebs e proteja-o da luz. É possível reutilizar o Fura-2 preparado para incubar mais tampas com células.Adicione silício ao suporte de deslizamento de tampas e câmara antes de cada corrida para evitar vazamentos da solução. Retire o deslizamento da solução Krebs e lave cuidadosamente o fundo com água destilada para evitar a cristalização do sal na lente do microscópio. Coloque o deslizamento de cobertura no suporte, pressionando as bordas com cautela.Conecte o suporte de deslizamento de tampas e a câmara ao microscópio e comece a perfundar as células com a solução Krebs. Selecione células apropriadas e escolha um bom campo. Determine manualmente as regiões de interesse selecionando corpos celulares com base em sua morfologia distinta.As variações da concentração de cálcio foram avaliadas quantificando a razão da fluorescência emitida em 510 nm após excitação alternativa em 340 e 380 nm. Depois de adicionar cloreto de potássio é possível ver muitas células brilhando e a resposta de fluorescência aumentando no gráfico. Cloreto de potássio abre canais de cálcio fechados de tensão, apresenta-se principalmente em neurônios.Cada linha individual no gráfico representa a única região de interesse. Portanto, é possível rastrear respostas celulares individuais durante o experimento. Estímulos ATP abre receptor P2X7, essencialmente expresso por células gliais.Esta é uma cultura de neurônios enriquecida. Portanto, há poucas células gliais aqui. Esta é a razão pela qual tão poucas células respondem aos estímulos ATP.Os valores adquiridos foram processados utilizando-se o software Metafluor. Os resultados experimentais são expressos em uma tabela Excel, onde cada linha representa uma célula individual, e cada linha, um ponto de tempo. Usando o software Excel, é possível traçar variações de cálcio de células individuais separadamente, ou de todas elas no mesmo gráfico.Para quantificar a quantidade de células reativas a qualquer estímulo, defina um corte de 30% nos níveis de linha de base de cálcio. Aqui usamos células de retina na cultura a partir de filhotes embrionários do dia 8 para investigar como os neurônios e o sinal de glia em termos de mudanças de cálcio, depois de receber 50 mm de cloreto de potássio e 1 mm de estímulos ATP. Em cada experimento, cerca de 100 células foram prontamente analisadas.A Figura A representa uma cultura mista contendo neurônios e glia, que foi mantida por uma semana. Quando quantificamos as respostas, é possível ver que cerca de metade das células analisadas respondem cloreto de potássio, e a outra metade respondeu à ATP. A figura B refere-se a uma cultura enriquecida por neurônios.Foi incubado por apenas três dias, portanto, a maioria das células gliais ainda não se diferenciaram. Neste caso, 89% das células respondem cloreto de potássio, reforçando a prevalência de neurônios. A Figura C mostra uma cultura glia purificada.Essas células foram mantidas por 10 dias com alterações médias a cada três dias. Depois desse tempo a maioria dos neurônios morre, deixando apenas glia. De fato, essa cultura foi ativada exclusivamente pela ATP.Essa metodologia tem sido amplamente utilizada devido às propriedades universais do cálcio como segundo mensageiro. A análise fenotípica pode ser aprimorada complementando essa metodologia com a imunoquímica das células fixas após a imagem de cálcio. Este protocolo também poderia ser adaptado a outros sistemas de células mistas que expressam outros canais de cálcio.A dica importante é encontrar respostas seletivas de diferentes tipos de células correlacionadas com sua expressão fenotípica.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Investigações sobre alterações da função Circuito Hippocampal Após lesão cerebral traumática leve

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

Neurociência

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

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Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

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In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

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A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up para a investigação detalhada da Relação Neuron-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

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Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

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Na imagem latente de cálcio Vivo de células de cabelo linha Lateral no Zebrafish Larval

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Cultura de Pericytes Capilares Cerebrais para Medições citosóicas de cálcio e estudos de imagem de cálcio

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Um modelo de cultura celular para estudar o papel das interações neurônio-glia na isquemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar conectividade do circuito neuronal vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...