Protokollet är signifikant för att visa zebrafiskmotorisk försämring och en efterföljande återhämtning, efter intracerebroventrikulär injektion av neurotoxin 6-hydroxigopamin vid ventral diencefalon. Denna teknik visar förändringar i de funktionella effekterna, som motsvarar den specifika ablationen av dopaminerga neuroner i ventral diencephalon av 6-OHDA-lesionerad vuxen zebrafisk, med hjälp av en mycket enkel inställning. Framtida studier om mekanismerna bakom neuroregenerering, liksom de inneboende och yttre faktorerna som modulerar processen, kan ge viktiga insikter i strategier för cellersättningsbehandling mot Parkinsons sjukdom.
Håll fisken i en luftad destillerad mineraliserad vattentank med ett gram per liter kommersiellt havssalt, under en kontrolltemperatur på 28, plus eller minus en grad Celsius. Hus högst 25 fiskar per 45-liters tank och utsätt dem för en 14-timmars ljus och 10-timmars mörk fotoperiod. Foder fisken minst två gånger om dagen med matpellets, kompletterad med frystorkade maskar.
Förbered en stamlösning av trikainmetansulfonat genom att lösa upp två och ett halvt gram trikainmetansulfonat och fem gram natriumbikarbonat i 250 ml destillerat vatten. Späd två milliliter stamlösning för att göra 200 ml arbetsanestesilösning. Nyförbered 99,96 millimolär 6-hydroxydopamin, genom att först lösa upp 0,2 milligram askorbinsyra i en milliliter 0,9 volymprocent sterilfiltrerad natriumklorid.
Filtrera lösningen med ett 0,2 mikron filter. Tillsätt sedan 25 milligram 6-hydroxigopamin, i pulverform, i lösningen. Placera den bedövade fisken på en vattendränkt svamp, placerad under ett stereomikroskop och blöt fisken regelbundet.
Identifiera positionen för injektion, baserat på skärningspunkten mellan den metopiska suturen, koronal sutur och sagittal sutur, som förbinder zebrafiskhjärnans parietala och frontala skalle. Gör sedan ett litet hål på en millimeter i kvadrat med en skarp 27 gauge nål. Sänk mikrokapillärinjektorn i 60 graders vinkel tills den når ett djup av 1200 mikrometer från zebrafiskskallens kranialtak.
Tryck på Z-gränsen för att fixa positionen. Ställ in det initiala injektionstrycket till 4000 hektopascal. Injektionstid vid 2,3 sekunder.
Kompensationstryck till 10 hektopascal. Sänk injektionsintensiteten med varje efterföljande injektion. Injicera 0,5 mikroliter 99,96 millimolärt neurotoxin 6-hydroxigopamin eller 0,9 volymprocent saltlösning, i bluffkontrollgruppen, och låt mikrokapillären vila i 20 sekunder.
Fortsätt att blöta fisken med destillerat vatten under hela processen för att förhindra torkning. Ta långsamt bort mikrokapillären och återuppliva fisken under rinnande destillerat vatten. Placera fisken i en isolerad återvinningstank och ta bort eventuella distraktioner som potentiellt kan störa återhämtningsprocessen.
Spola mikrokapillären före nästa injektion, för att rensa blockeringen och se till att injektionsintensiteten är tillräcklig för att ge den önskade volymen av 0,5 mikroliter 6-hydroxingopamin. Utför lokomotorisk bedömning av zebrafisk individuellt, via det öppna tanktestet, vid dag tre och dag 30, efter 6-hydroxydopamin. Placera experimenttanken, med sina väggar täckta med vitt papper, på en upphöjd plattform.
Tänd tanken från botten med en ljuskälla. Fyll tanken med 80 till 90% destillerat vatten och håll temperaturen vid 28, plus eller minus en grad Celsius. Mät temperaturen med en termometer och reglera den med en kommersiell akvarievärmare.
Efter minst två minuters acklimatisering, spela in fiskens simningsbeteende från en planerad vy på det tvådimensionella planet i experimentområdet med hjälp av en videokamera i fem minuter. För att undvika inkonsekvenser, i olika partier av inspelningar, överskrid inte 10 minuters acklimatisering. Analysera videorna med hjälp av videospårningsprogramvara med det öppna tankprotokollet, för förvärv av tillryggalagd sträcka och medelhastighet för varje ämne.
Det föreliggande experimentet bedömde förändringarna i vuxna zebrafiskars simbeteende, efter intracerebroventrikulär mikroinjektion med 6-hydroxigopamin. Den huvudsakliga hjärnregionen av intresse var den ventrala diencephalonen, som består av det preoptiska området, bakre tuberkulum och hypotalamus. Mer än 85% av tyrosinhydroxylas immunoreaktiva dopaminerga neuroner i ventral diencephalon ablerades på dag tre postlesion.
Antalet tyrosinhydroxylas immunoreaktiva dopaminergena neuroner ökar sedan med mer än 50% vid dag 14 postlesion, innan full regenerering 30 dagar efter läsion. Analys av zebrafiskens simbeteende, med hjälp av videospårningsprogramvara, indikerade att både medelhastigheten och avståndet för den lesionerade gruppen, på dag tre postlesion, reducerades signifikant till mindre än 45% jämfört med skam. Den lesionerade gruppen uppvisade återhämtning av motorisk funktion, 30 dagar efter förlossningen, utan någon signifikant skillnad mellan varken medelhastigheten eller det tillryggalagda avståndet, jämfört med sham.
Det är viktigt att den lokomotoriska bedömningen utförs inom en fast tidsram. Till exempel 08:00 till 12:00. Och vattentemperaturen hölls på 28 grader Celsius, under hela experimentet. Andra beteendetester, som shoaling och ångestliknande beteenden, kan utföras, för att utforska ytterligare förändringar eller funktionella effekter av dopaminerga neuroner ablation, efter 6-OHDA injektion av den vuxna zebrafiskhjärnan.