Name: quantitative microtubule fractionation technique to separate stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin in mouse tissues
Uploaded: 2023-11-17T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues at JoVE.com

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل JST لإنشاء زمالات جامعية نحو إنشاء ابتكار تكنولوجيا العلوم (A.HT. JPMJFS2145) ، JST SPRING (A.HT. ؛ JPMJSP2129) ، منحة مساعدة لزملاء JSPS (A.HT ؛ 23KJ2078) ، منحة مساعدة للبحث العلمي (B) JSPS KAKENHI (22H02946 ل TM) ، منحة مساعدة للبحث العلمي في المجالات المبتكرة بعنوان "شيخوخة بروتين الدماغ والتحكم في الخرف" من MEXT (TM ؛ 26117004) ، وزمالة Uehara Research من مؤسسة Uehara Memorial Foundation (TM ؛ 202020027). يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

1. طريقة تجزئة MT
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب التي أجريت في هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة دوشيشا. تم استخدام الفئران C57BL / 6J من كلا الجنسين ، 3-4 أشهر من العمر ، هنا. في هذا البروتوكول ، تم تجانس الأنسجة المقطعة ، على سبيل المثال ، الدماغ أو الكب...

<ol>
	<li>Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+code+and+its+role+in+controlling+microtubule+properties+and+functions.">The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).</li><li>Conde, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly,+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites.">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubule+ends+are+required+for+growth+cone+turning+to+avoid+an+inhibitory+guidance+cue.">Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue.</a> Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).</li><li>Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+neuronal+microtubule+cytoskeleton.">Building the neuronal microtubule cytoskeleton.</a> Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).</li><li>Leo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+fidgetin+restrains+axonal+growth+by+severing+labile+domains+of+microtubules.">Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules.</a> Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).</li><li>Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+code:+molecular+components,+readout+mechanisms,+and+functions.">The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions.</a> Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).</li><li>Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+post-translational+modifications+and+microtubule+dynamics.">Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).</li><li>Baas, P. W., Black, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+microtubules+in+the+axon+consist+of+domains+that+differ+in+both+composition+and+stability.">Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability.</a> Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).</li><li>Cartelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+alterations+occur+early+in+experimental+parkinsonism+and+the+microtubule+stabilizer+epothilone+D+is+neuroprotective.">Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective.</a> Scientific Reports. 3, 1837 (2013).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-binding+drugs+offset+tau+sequestration+by+stabilizing+microtubules+and+reversing+fast+axonal+transport+deficits+in+a+tauopathy+model.">Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+alpha-tubulin+in+Alzheimer+disease.">Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease.</a> Translational Neurodegeneration. 4, 9 (2015).</li><li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+improves+tau-induced+neuronal+dysfunction+of+nematodes.">Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes.</a> Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).</li><li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microtubule+assembly+competent+tubulin+synthesis+leads+to+accumulation+of+phosphorylated+tau+in+neuronal+cell+bodies.">Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).</li><li>Vielkind, U., Swierenga, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+fixation+procedure+for+immunofluorescent+detection+of+different+cytoskeletal+components+within+the+same+cell.">A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell.</a> Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).</li><li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+tau+isoforms+and+microtubule+bundle+formation+in+fibroblasts+transfected+with+a+single+tau+cDNA.">Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA.</a> Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).</li><li>Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+microtubules+of+the+axon:+quantitative+analysis+of+tyrosinated+and+acetylated+tubulin+along+individual+axonal+microtubules.">Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules.</a> Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).</li><li>Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+is+enriched+on+dynamic+microtubules+in+the+distal+region+of+growing+axons.">Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons.</a> Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).</li><li>Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+tubulin+synthesis+in+hepatocytes+and+fibroblasts.">Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts.</a> Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).</li><li>Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+destruction+of+stable+microtubules+and+axons+by+inhibitors+of+protein+serine/threonine+phosphatases+in+cultured+human+neurons.">Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons.</a> Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).</li><li>Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+destruction+induces+tau+liberation+and+its+subsequent+phosphorylation.">Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation.</a> FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).</li><li>Hagita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fractionation+of+tissue+microtubules+with+distinct+biochemical+properties+reflecting+their+stability+and+lability.">Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).</li><li>Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+tubulins+are+not+alike:+Heterodimer+dissociation+differs+among+different+biological+sources.">All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).</li><li>Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taxol-dependent+procedure+for+the+isolation+of+microtubules+and+microtubule-associated+proteins+(MAPs).">A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs).</a> Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).</li><li>Bartolo, M. E., Carter, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+microtubule+stabilization+on+the+freezing+tolerance+of+mesophyll+cells+of+spinach.">Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach.</a> Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).</li><li>Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPT+mutations,+tauopathy,+and+mechanisms+of+neurodegeneration.">MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).</li><li>Fourel, G., Boscheron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+mutations+in+neurodevelopmental+disorders+as+a+tool+to+decipher+microtubule+function.">Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function.</a> FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).</li><li>Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+in+Alzheimer's+presenile+dementia.">Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia.</a> The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).</li><li>Yoshida, H., Ihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+in+paired+helical+filaments+is+functionally+distinct+from+fetal+tau:+assembly+incompetence+of+paired+helical+filament-tau.">Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau.</a> Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).</li><li>Cash, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+reduction+in+Alzheimer's+disease+and+aging+is+independent+of+tau+filament+formation.">Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation.</a> The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).</li><li>Hempen, B., Brion, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+acetylated+alpha-tubulin+immunoreactivity+in+neurofibrillary+tangle-bearing+neurons+in+Alzheimer's+disease.">Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).</li><li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+expression+of+tau+and+tubulin+induces+neuronal+dysfunction+in+C.+elegans+models+of+tauopathy.">Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).</li><li>Boiarska, Z., Passarella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-targeting+agents+and+neurodegeneration.">Microtubule-targeting agents and neurodegeneration.</a> Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).</li></ol>

المهمة الأكثر أهمية عند التحقيق في حالة توبولين في الأنسجة من الكائنات الحية هي منع بلمرة MT العرضية أو إزالة البلمرة أثناء التحضير. يتأثر استقرار MTs في العينات بعوامل مثل تركيز Taxol في MSB ، ونسبة كمية الأنسجة إلى المخزن المؤقت ، ودرجة الحرارة أثناء العملية من إزالة الأنسجة إلى التجانس والطر?...

الأنابيب الدقيقة (MTs) هي هياكل أنبوبية ممدودة تتكون من خيوط أولية تتكون من وحدات فرعية غير متجانسة α / β-توبولين. تلعب أدوارا أساسية في العمليات الخلوية المختلفة مثل انقسام الخلايا والحركة والحفاظ على الشكل والنقل داخل الخلايا ، مما يجعلها مكونات متكاملة للهيكل الخلوي حقيقي النواة1. الطرف السالب من MTs ، حيث تتعرض الوحدة الفرعية α-tubulin ، مستقر نسبيا ، في حين أن الطرف الزائد ، حيث تتعرض الوحدة الفرعية β-tubulin ، يخضع لإزالة البلمرة الديناميكيةوالبلمرة 2. هذه الدورة المستمرة من إضافة توبولين ديمر وتفككه في الطرف الزائد ، يشار إليها باسم عدم الاستقرار الديناميكي ، تؤدي إلى عملية متكررة للإنقاذ والكارثة3. تعرض MTs مجالات محورية مع اختلافات محلية في عدم الاستقرار الديناميكي ، بما في ذلك المجالات المستقرة والمرنة4.
يعد التحكم الدقيق في عدم الاستقرار الديناميكي ل MTs أمرا بالغ الأهمية للعديد من الوظائف الخلوية ، لا سيما في الخلايا العصبية التي تتميز بأشكال معقدة. تلعب القدرة على التكيف والمتانة في MTs دورا حيويا في تطوير الخلايا العصبية5،6،7 وحسن سيرها. تم العثور على عدم الاستقرار الديناميكي ل MTs مرتبطا بالعديد من التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) للتوبولين ، مثل الأستلة ، والفسفرة ، وبالميتويل ، وإزالة التيروزين ، ودلتا 2 ، وأكسدة البولي جلوتامين ، و polyglycylation. بالإضافة إلى ذلك ، يعمل ارتباط البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة (MAPs) كآلية تنظيمية8. تحدث PTMs ، باستثناء الأستيل ، في الغالب في منطقة كربوكسي توبولين الطرفية الواقعة على السطح الخارجي ل MTs. تخلق هذه التعديلات ظروفا سطحية متنوعة على MTs ، مما يؤثر على تفاعلها مع MAPs ويحكم في النهاية استقرار MT9. يدل وجود بقايا التيروزين الكربوكسي الطرفي في α-tubulin على MTs الديناميكي ، والذي يتم استبداله بسرعة بتجمع توبولين مجاني. على العكس من ذلك ، فإن إزالة التيروزين من نهاية الكربوكسي وأستلة Lys40 تدل على MTs مستقرة مع انخفاض عدم الاستقرار الديناميكي 9,10.
تم استخدام PTMs من توبولين على نطاق واسع في التجارب لتقييم ديناميكيات واستقرار MTs5،7،11،12،13،14،15. على سبيل المثال ، في دراسات زراعة الخلايا ، يمكن فصل الأنابيب إلى مجموعتين: تجمع توبولين مجاني وتجمع MT. يتم تحقيق ذلك عن طريق إطلاق توبولين مجاني من خلال نفاذية الخلية قبل تثبيت MTsالمتبقية 15،16،17،18،19. تتضمن الطرق البيوكيميائية استخدام مثبتات MT الكيميائية التي تحمي MTs من الكارثة ، مما يتيح فصل MTs والتوبولين الحر من خلال الطرد المركزي20،21،22. ومع ذلك ، فإن هذه الإجراءات لا تفرق بين MTs المستقرة والأقل استقرارا (المتقلبة) ، مما يجعل من المستحيل تحديد MTs أو التوبولين القابل للذوبان في أنسجة مثل الدماغ. وبالتالي ، فقد ثبت أن تقييم استقرار MT في الكائنات الحية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية يمثل تحديا. لمعالجة هذا القيد التجريبي ، قمنا بتطوير تقنية جديدة لفصل MTs والتوبولين الحر بدقة في أنسجة الفئران23.
تتضمن طريقة تجزئة MT الفريدة هذه تجانس الأنسجة في ظل ظروف تحافظ على حالة التوبولين في الأنسجة والطرد المركزي من خطوتين لفصل MTs المستقر و MTs المرن والتوبولين الحر. يمكن تطبيق هذا الإجراء البسيط على دراسات واسعة ، بما في ذلك البحوث الأساسية على MTs و MAPs في الكائنات الحية ، والتحليلات الفسيولوجية والمرضية للصحة والأمراض المرتبطة باستقرار MT ، وتطوير الأدوية والعلاجات الأخرى التي تستهدف MTs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ML TUBE CASE OF 500</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1A2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9028</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02442-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 kDa ultrafiltration spin column</td>
			<td>Aproscience</td>
			<td>PT-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-11B1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA prime plus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antipain</td>
			<td>Peptide Institute Inc.</td>
			<td>4062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aprotinin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>03346-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi-Lumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>07880-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>0.22&#181;m 33.2cm&#178; Nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIFP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>55-91-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIGITAL HOMOGENIZER</td>
			<td></td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>HOM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9026</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14128-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>37346-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W 3.3 Meter Roll</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17018-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td></td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17450-61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman</td>
			<td></td>
			<td>TOMY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9893-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Gauge Software&#160;</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoStar LD&#160;</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>292-69903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMX-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3408</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-4000 luminescent image analyzer</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leupeptin</td>
			<td>Peptide Institute Inc.</td>
			<td>43449-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>21003-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>32013-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31420-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>okadaic acid</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>O-2220&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTIMA MAX-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pepstatin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26436-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free)</td>
			<td></td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified tubulin&#160;</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSONICA Q55</td>
			<td>QSonica</td>
			<td>Q55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taxol</td>
			<td></td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>P-9600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-120.2 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-55 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLCK</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>34219-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative microtubule fractionation technique to separate stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin in mouse tissues

الأنابيب الدقيقة ، المكونة من دايمرات α / β-توبولين ، هي عنصر حاسم في الهيكل الخلوي في الخلايا حقيقية النواة. تظهر هذه البوليمرات الشبيهة بالأنبوب عدم استقرار ديناميكي حيث تخضع الوحدات الفرعية غير المتجانسة للتوبولين للبلمرة المتكررة وإزالة البلمرة. يعد التحكم الدقيق في استقرار وديناميكيات الأنابيب الدقيقة ، والذي يتحقق من خلال تعديلات توبولين بعد الترجمة والبروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة ، أمرا ضروريا لمختلف الوظائف الخلوية. الاختلالات في الأنابيب الدقيقة متورطة بقوة في التسبب في المرض ، بما في ذلك الاضطرابات التنكسية العصبية. تركز الأبحاث الجارية على العوامل العلاجية التي تستهدف الأنابيب الدقيقة التي تعدل الاستقرار ، مما يوفر خيارات علاجية محتملة لهذه الأمراض والسرطانات. وبالتالي ، فإن فهم الحالة الديناميكية للأنابيب الدقيقة أمر بالغ الأهمية لتقييم تطور المرض والآثار العلاجية.
تقليديا ، تم تقييم ديناميكيات الأنابيب الدقيقة في المختبر أو في الخلايا المستزرعة من خلال التجزئة الخشنة أو المقايسة المناعية ، باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف تعديلات ما بعد الترجمة من توبولين. ومع ذلك ، فإن التحليل الدقيق لحالة التوبولين في الأنسجة باستخدام مثل هذه الإجراءات يشكل تحديات. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير طريقة تجزئة الأنابيب الدقيقة البسيطة والمبتكرة لفصل الأنابيب الدقيقة المستقرة ، والأنابيب الدقيقة المرنة ، والتوبولين الحر في أنسجة الفئران.
تضمن الإجراء تجانس أنسجة الفئران المشرحة في مخزن مؤقت لتثبيت الأنابيب الدقيقة بنسبة حجم 19: 1. ثم تم تجزئة التجانسات من خلال عملية طرد مركزي فائقة من خطوتين بعد الطرد المركزي البطيء الأولي (2400 × جم) لإزالة الحطام. أدت خطوة الطرد المركزي الفائق الأولى (100000 × جم) إلى ترسب الأنابيب الدقيقة المستقرة ، بينما تعرض العنصر الطافي الناتج لخطوة الطرد المركزي الفائقة الثانية (500000 × جم) لتجزئة الأنابيب الدقيقة القابلة للذوبان وثنائيات التوبولين القابلة للذوبان. حددت هذه الطريقة نسب التوبولين التي تشكل أنابيب دقيقة مستقرة أو قابلة للذوبان في دماغ الفأر. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت اختلافات الأنسجة المتميزة في استقرار الأنابيب الدقيقة التي ترتبط بالقدرة التكاثرية للخلايا المكونة. تسلط هذه النتائج الضوء على الإمكانات الكبيرة لهذه الطريقة الجديدة لتحليل استقرار الأنابيب الدقيقة في الظروف الفسيولوجية والمرضية.

القياس الكمي للتوبولين في الكسور P2 و P3 و S3 من دماغ الفأر بطريقة تجزئة MT تم فصل التوبولين في أنسجة الفئران إلى كسور P2 و P3 و S3 بواسطة طريقة تجزئة MT وتم قياسها كميا بواسطة النشاف الغربي (الشكل 1 أ). تمثل رواسب MTs التي بقيت في جزء P2 عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 100000 × <em...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues at JoVE.com

Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues

تلعب الأنابيب الدقيقة ، وهي بوليمرات توبولين ، دورا مهما كمكون للهيكل الخلوي في الخلايا حقيقية النواة ومعروفة بعدم استقرارها الديناميكي. طورت هذه الدراسة طريقة لتجزئة الأنابيب الدقيقة لفصلها إلى أنابيب دقيقة مستقرة ، وأنابيب دقيقة قابلة للتعديل ، وتوبولين حر لتقييم استقرار الأنابيب الدقيقة في أنسجة الفئران المختلفة.

تقنية تجزئة الأنابيب الدقيقة الكمية لفصل الأنابيب الدقيقة المستقرة والأنابيب الدقيقة المرنة والتوبولين الحر في أنسجة الفئران

Microtubules, composed of &#945;/&#946;-tubulin dimers, are a crucial component of the cytoskeleton in eukaryotic cells. These tube-like polymers exhibit ...

يساعد بروتوكولنا الجديد على تمييز وتحديد ثلاث حالات من حلقات الأنبوب ، مثل الأنابيب الدقيقة المستقرة ، والأنابيب الدقيقة المرنة ، والأنابيب الحرة في الأنسجة الحيوانية. تتكون هذه التقنية من خطوات بسيطة ويمكنها تقييم الاستقرار الهيكلي للأنابيب ، والذي لا يمكن اكتشافه عن طريق القياس الكمي للأنابيب بعد التعديل المتعدي. هذه الطريقة ضرورية للبحث وتطوير طرق علاجية للأمراض التي يكون فيها استقرار الأنابيب الدقيقة أمرا بالغ الأهمية ، مثل مرض الزهايمر والسرطانات.ابدأ الإجراء عن طريق تحضير ملابس المختبر لتشريح الأنسجة. املأ صندوقا بالثلج المجروش وضع طبقين بتري عليه. املأ طبقا واحدا بمحلول عازل فوسفات بارد مثلج أو PBS للغسيل العابر وتخزين الأنسجة المشرحة.ضع ورق الترشيح المبلل ب PBS على الطبق الثاني. بعد ذلك ، قم بوزن الأنابيب الدقيقة التي يبلغ سعتها 1.5 ملليلتر المملوءة ب PBS لتخزين الأنسجة المشرحة. بعد استخراج الأنسجة من فأر القتل الرحيم ، انقلها إلى الأنابيب وأعد وزن كل أنبوب دقيق.انقل الأنسجة إلى خالط زجاجي باستخدام محلول تثبيت الأنابيب الدقيقة الباردة أو MSB + وسط ، وقم بتجانس الأنسجة على الفور باستخدام خالط مبرد. الآن نقل تجانس الأنسجة إلى أنبوب دقيق 2 مليلتر باستخدام ماصة باستور وأجهزة الطرد المركزي في 2،400 غرام لمدة ثلاث دقائق عند درجتين مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر لإزالة الحطام.دوامة الطافية أو جزء S1 في أنبوب دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر. ماصة على الفور 200 ميكرولتر من جزء S1 في أنبوب ميكرو الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 100،000 غرام باستخدام الدوار TLA-55 لمدة 20 دقيقة عند درجتين مئوية. بعد الطرد المركزي الثاني ، افصل طاف S2 عن راسب P2.قم على الفور بنقل الكمية الكاملة من جزء S2 إلى أنبوب دقيق للطرد المركزي واستخدم دوار TLA-120.2 لتدويره عند 500،000 جم لمدة 60 دقيقة عند درجتين مئويتين. بعد الطرد المركزي الثالث ، افصل طاف S3 عن راسب P3. قم بإذابة جزء S3 بالكامل في 200 ميكرولتر من كبريتات دوديسيل الصوديوم 2X ، أو المخزن المؤقت لعينة SDS.امزج كسور S1 المتبقية بحجم متساو من المخزن المؤقت لعينة 2X SDS لاستخدامها كمنحنى قياسي للنشاف الغربي. بعد ذلك ، أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS إلى أنابيب الكسر P2 و P3. بعد ذلك ، قم بصوتنة المحلول لفترة وجيزة لإذابة الراسب قبل نقل العينات إلى أنابيب دقيقة جديدة سعة 1.5 ملليلتر ووضعها في صندوق الثلج.غلي جميع العينات عند 100 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. شكلت الأنابيب الدقيقة في جزء P2 34.86٪ من إجمالي ألفا توبولين في دماغ الفأر ، في حين شكلت تلك الموجودة في الكسور P3 و S3 56.13٪ و 9.01٪ على التوالي. لم تكن النسبة المئوية لتوبولين بيتا 3 في كسور P2 و P3 و S3 مختلفة بشكل كبير عن تلك الموجودة في ألفا توبولين.أظهر الجزء S2 مرورا محدودا للتوبولين عبر عمود دوران الترشيح الفائق 300 كيلو دالتون ، بينما سمح جزء S3 بمرور كامل لمجمعات التوبولين. أدى الفصل الكروماتوغرافي إلى شطف 100 كيلو دالتون من توبولين S3. تم استرداد نسب متساوية من ألفا وبيتا توبولين في كل جزء.تم إثراء كسور P2 بشكل كبير مع ألفا توبولين الأسيتيل ، بينما كان التيروزين ألفا توبولين سائدا في جزء P3. أدى تجميد الدماغ قبل التجانس إلى انخفاض تركيز ألفا توبولين في أجزاء P2. ومع ذلك ، زاد ألفا توبولين في جزء P3.كما قلل التجميد من مستويات الأستيل وزاد من مستويات التيروزين لألفا توبولين في جزء P2. انخفض علاج نوكودازول ألفا توبولين في جزء P2. على عكس التجميد ، لم يؤثر نوكودازول على تعديلات توبولين P2 بعد الترجمة.أظهرت أنسجة المخ تركيزا أعلى بكثير من الأنابيب P2 ، بينما تركزت توبولين P3 في الأنسجة التكاثرية. أظهر النشاف الغربي أن توبولين P2 الموجود على وجه التحديد في الجهاز العصبي نشأ من الأنابيب الدقيقة المستقرة ، وأن توبولين P3 نشأ من الأنابيب الدقيقة المستقرة. استقرار الأنابيب الدقيقة ديناميكي للغاية.من المهم إكمال هذا البروتوكول بسرعة ، دون انقطاع ، في بيئة درجة الحرارة الباردة. تأكد أيضا من عدم تجميد الأنسجة والكسور حتى يتم إذابتها في المخزن المؤقت لعينة SDS. من المتوقع أن يؤدي الجمع بين العرض المناعي باستخدام كل جزء مع البروتينات إلى تحديد العوامل المشاركة في ديناميكيات الأنابيب الدقيقة.باستخدام هذه الطريقة ، كشفنا عن مدى وجود تاو الطبيعي على الأنابيب الدقيقة. يمكن استخدامه أيضا لدراسة كيف يصبح غير طبيعي في أدمغة المسنين من أجل تحديد أهداف دوائية جديدة للخرف.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

عزل بروتينات الشعيرة المتوسطة من أنسجة الفئران المتعددة لدراسة التعديلات المرتبطة بالشيخوخة بعد الترجمة

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

الأسلوب الكمي والنوعي سفينجوميلين من LC-MS استخدام اثنين مستقرة نظير المسمى الأنواع سفينجوميلين

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

التعامل مع الخلايا الحية لبناء الجمعية الخلوية 3D مستقرة دون سقالة اصطناعية

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

نبات رذاذ الكتلي: أسلوب تاين المحيطة سريع مباشرة تقييم نواتج الأيض من الأنسجة النباتية

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

مقارنة مستويات البروتين عبر الأنسجة، وفي جميع أنحاء تطوير استخدام النشاف الغربية كمية موحدة قوية

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

قياس التفاعلات بين مجسات الفلورسنت والليغسين في أقسام النبات بواسطة sFLIM استنادا إلى الفلورية الاصليه

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

التصور المتزامن لديناميكيات الأنابيب الدقيقة المتقاطعة والمفردة في المختبر بواسطة مجهر TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

انعكاس التداخل المتزامن والمجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي لتصوير الأنابيب الدقيقة الديناميكية والبروتينات المرتبطة بها

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

التجميع الذاتي لل Tactoids microtubule

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

تقنية التقشير واللطخة: طريقة تحضير عينة Cryo-EM لفصل الطبقات المفردة عن العينات البيولوجية متعددة الطبقات أو المركزة

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...