Name: quantitative microtubule fractionation technique to separate stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin in mouse tissues
Uploaded: 2023-11-17T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues at JoVE.com

Ce travail a été soutenu en partie par JST, la création de bourses universitaires pour la création d’innovations scientifiques et technologiques (A.HT. ; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT. ; JPMJSP2129), une subvention d’aide pour les boursiers de la JSPS (A.HT ; 23KJ2078), une subvention d’aide à la recherche scientifique (B) JSPS KAKENHI (22H02946 pour la MT), une subvention d’aide à la recherche scientifique dans des domaines innovants intitulée « Brain Protein Aging and Dementia Control » de MEXT (TM ; 26117004), et une bourse de recherche Uehara de la Fondation commémorative d’Uehara (TM ; 202020027). Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.

1. Méthode de fractionnement MT
REMARQUE : Toutes les expériences réalisées dans cette étude ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université Doshisha. Des souris C57BL/6J des deux sexes, âgées de 3 à 4 mois, ont été utilisées ici. Dans ce protocole, les tissus disséqués, par exemple le cerveau, le foie ou le thymus, ont été immédiatement homogénéisés dans un tampon stabilisateur de microtubules (MSB) glacé, qui contenait du Taxol...

<ol>
	<li>Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+code+and+its+role+in+controlling+microtubule+properties+and+functions.">The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).</li><li>Conde, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly,+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites.">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubule+ends+are+required+for+growth+cone+turning+to+avoid+an+inhibitory+guidance+cue.">Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue.</a> Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).</li><li>Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+neuronal+microtubule+cytoskeleton.">Building the neuronal microtubule cytoskeleton.</a> Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).</li><li>Leo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+fidgetin+restrains+axonal+growth+by+severing+labile+domains+of+microtubules.">Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules.</a> Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).</li><li>Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+code:+molecular+components,+readout+mechanisms,+and+functions.">The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions.</a> Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).</li><li>Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+post-translational+modifications+and+microtubule+dynamics.">Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).</li><li>Baas, P. W., Black, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+microtubules+in+the+axon+consist+of+domains+that+differ+in+both+composition+and+stability.">Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability.</a> Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).</li><li>Cartelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+alterations+occur+early+in+experimental+parkinsonism+and+the+microtubule+stabilizer+epothilone+D+is+neuroprotective.">Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective.</a> Scientific Reports. 3, 1837 (2013).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-binding+drugs+offset+tau+sequestration+by+stabilizing+microtubules+and+reversing+fast+axonal+transport+deficits+in+a+tauopathy+model.">Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+alpha-tubulin+in+Alzheimer+disease.">Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease.</a> Translational Neurodegeneration. 4, 9 (2015).</li><li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+improves+tau-induced+neuronal+dysfunction+of+nematodes.">Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes.</a> Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).</li><li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microtubule+assembly+competent+tubulin+synthesis+leads+to+accumulation+of+phosphorylated+tau+in+neuronal+cell+bodies.">Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).</li><li>Vielkind, U., Swierenga, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+fixation+procedure+for+immunofluorescent+detection+of+different+cytoskeletal+components+within+the+same+cell.">A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell.</a> Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).</li><li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+tau+isoforms+and+microtubule+bundle+formation+in+fibroblasts+transfected+with+a+single+tau+cDNA.">Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA.</a> Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).</li><li>Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+microtubules+of+the+axon:+quantitative+analysis+of+tyrosinated+and+acetylated+tubulin+along+individual+axonal+microtubules.">Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules.</a> Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).</li><li>Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+is+enriched+on+dynamic+microtubules+in+the+distal+region+of+growing+axons.">Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons.</a> Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).</li><li>Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+tubulin+synthesis+in+hepatocytes+and+fibroblasts.">Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts.</a> Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).</li><li>Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+destruction+of+stable+microtubules+and+axons+by+inhibitors+of+protein+serine/threonine+phosphatases+in+cultured+human+neurons.">Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons.</a> Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).</li><li>Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+destruction+induces+tau+liberation+and+its+subsequent+phosphorylation.">Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation.</a> FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).</li><li>Hagita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fractionation+of+tissue+microtubules+with+distinct+biochemical+properties+reflecting+their+stability+and+lability.">Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).</li><li>Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+tubulins+are+not+alike:+Heterodimer+dissociation+differs+among+different+biological+sources.">All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).</li><li>Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taxol-dependent+procedure+for+the+isolation+of+microtubules+and+microtubule-associated+proteins+(MAPs).">A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs).</a> Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).</li><li>Bartolo, M. E., Carter, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+microtubule+stabilization+on+the+freezing+tolerance+of+mesophyll+cells+of+spinach.">Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach.</a> Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).</li><li>Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPT+mutations,+tauopathy,+and+mechanisms+of+neurodegeneration.">MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).</li><li>Fourel, G., Boscheron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+mutations+in+neurodevelopmental+disorders+as+a+tool+to+decipher+microtubule+function.">Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function.</a> FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).</li><li>Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+in+Alzheimer's+presenile+dementia.">Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia.</a> The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).</li><li>Yoshida, H., Ihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+in+paired+helical+filaments+is+functionally+distinct+from+fetal+tau:+assembly+incompetence+of+paired+helical+filament-tau.">Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau.</a> Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).</li><li>Cash, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+reduction+in+Alzheimer's+disease+and+aging+is+independent+of+tau+filament+formation.">Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation.</a> The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).</li><li>Hempen, B., Brion, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+acetylated+alpha-tubulin+immunoreactivity+in+neurofibrillary+tangle-bearing+neurons+in+Alzheimer's+disease.">Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).</li><li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+expression+of+tau+and+tubulin+induces+neuronal+dysfunction+in+C.+elegans+models+of+tauopathy.">Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).</li><li>Boiarska, Z., Passarella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-targeting+agents+and+neurodegeneration.">Microtubule-targeting agents and neurodegeneration.</a> Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).</li></ol>

La tâche la plus importante lors de l’étude de l’état de la tubuline dans les tissus d’organismes vivants est d’empêcher la polymérisation ou la dépolymérisation accidentelle de la magnétoscopie pendant la préparation. La stabilité des MT dans les échantillons est affectée par des facteurs tels que la concentration de Taxol dans la MSB, la proportion de quantité tissulaire à tamponner et la température pendant le processus allant du prélèvement des tissus à l’homogénéisation et à la centrif...

Les microtubules (MT) sont des structures tubulaires allongées comprenant des protofilaments constitués de sous-unités hétérodimères α/β-tubuline. Ils jouent un rôle essentiel dans divers processus cellulaires tels que la division cellulaire, la motilité, le maintien de la forme et le transport intracellulaire, ce qui en fait des composants intégraux du cytosquelette eucaryote1. L’extrémité négative des MT, où la sous-unité α-tubuline est exposée, est relativement stable, tandis que l’extrémité positive, où la sous-unité β-tubuline est exposée, subit une dépolymérisation dynamique et une polymérisation2. Ce cycle continu d’ajout et de dissociation des dimères de tubuline à l’extrémité positive, appelé instabilité dynamique, entraîne un processus répétitif de sauvetage et de catastrophe3. Les MT présentent des domaines focaux avec des variations localisées de l’instabilité dynamique, y compris des domaines stables et labiles4.
Un contrôle précis de l’instabilité dynamique des MT est crucial pour de nombreuses fonctions cellulaires, en particulier dans les neurones caractérisés par des morphologies complexes. L’adaptabilité et la durabilité des MT jouent un rôle essentiel dans le développement et le bon fonctionnement des cellules nerveuses 5,6,7. L’instabilité dynamique des MT s’est avérée être associée à diverses modifications post-traductionnelles (PTM) de la tubuline, telles que l’acétylation, la phosphorylation, la palmitoylation, la détyrosination, le delta 2, l’oxydation de la polyglutamine et la polyglycylation. De plus, la liaison des protéines associées aux microtubules (MAP) sert de mécanisme de régulation8. Les PTM, à l’exclusion de l’acétylation, se produisent principalement dans la région carboxy-terminale de la tubuline située sur la surface externe des MT. Ces modifications créent des conditions de surface diverses sur les MT, influençant leur interaction avec les MAP et, en fin de compte, régissant la stabilité des MT9. La présence d’un résidu de tyrosine carboxy-terminale dans la α-tubuline est révélatrice de MT dynamiques, qui sont rapidement remplacées par le pool de tubuline libre. À l’inverse, la détyrosination de l’extrémité carboxy et l’acétylation de Lys40 signifient des MT stables avec une instabilité dynamique réduite 9,10.
Les PTM de la tubuline ont été largement utilisés dans des expériences visant à évaluer la dynamique et la stabilité des MT 5,7,11,12,13,14,15. Par exemple, dans les études de culture cellulaire, les tubulines peuvent être séparées en deux pools : le pool de tubulines libres et le pool MT. Ceci est réalisé en libérant de la tubuline libre par perméabilisation cellulaire avant de fixer les MT restantes 15,16,17,18,19. Les méthodes biochimiques impliquent l’utilisation de stabilisateurs chimiques de MT qui protègent les MT d’une catastrophe, permettant la séparation des MT et de la tubuline libre par centrifugation20,21,22. Cependant, ces procédures ne font pas la différence entre les MT stables et moins stables (labiles), ce qui rend impossible la quantification des MT ou de la tubuline soluble dans des tissus comme le cerveau. Par conséquent, l’évaluation de la stabilité de la TA chez les organismes dans des conditions physiologiques et pathologiques s’est avérée difficile. Pour remédier à cette limite expérimentale, nous avons mis au point une nouvelle technique permettant de séparer avec précision les MT et la tubuline libre dans les tissus de souris23.
Cette méthode unique de fractionnement de la magnétoscopie implique l’homogénéisation des tissus dans des conditions qui maintiennent le statut de la tubuline dans les tissus et la centrifugation en deux étapes pour séparer les MT stables, les MT labiles et la tubuline libre. Cette procédure simple peut être appliquée à de vastes études, y compris la recherche fondamentale sur les MT et les MAP dans les organismes vivants, les analyses physiologiques et pathologiques de la santé et des maladies associées à la stabilité des MT, et le développement de médicaments et d’autres thérapies qui ciblent les MT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ML TUBE CASE OF 500</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1A2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9028</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02442-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 kDa ultrafiltration spin column</td>
			<td>Aproscience</td>
			<td>PT-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-11B1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA prime plus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antipain</td>
			<td>Peptide Institute Inc.</td>
			<td>4062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aprotinin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>03346-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi-Lumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>07880-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>0.22&#181;m 33.2cm&#178; Nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIFP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>55-91-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIGITAL HOMOGENIZER</td>
			<td></td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>HOM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9026</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14128-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>37346-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W 3.3 Meter Roll</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17018-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td></td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17450-61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman</td>
			<td></td>
			<td>TOMY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9893-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Gauge Software&#160;</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoStar LD&#160;</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>292-69903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMX-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3408</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-4000 luminescent image analyzer</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leupeptin</td>
			<td>Peptide Institute Inc.</td>
			<td>43449-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>21003-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>32013-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31420-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>okadaic acid</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>O-2220&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTIMA MAX-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pepstatin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26436-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free)</td>
			<td></td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified tubulin&#160;</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSONICA Q55</td>
			<td>QSonica</td>
			<td>Q55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taxol</td>
			<td></td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>P-9600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-120.2 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-55 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLCK</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>34219-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative microtubule fractionation technique to separate stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin in mouse tissues

Les microtubules, composés de dimères de α/β-tubuline, sont un composant crucial du cytosquelette des cellules eucaryotes. Ces polymères tubulaires présentent une instabilité dynamique lorsque les sous-unités hétérodimères de tubuline subissent une polymérisation et une dépolymérisation répétitives. Un contrôle précis de la stabilité et de la dynamique des microtubules, obtenu grâce à des modifications post-traductionnelles de la tubuline et à des protéines associées aux microtubules, est essentiel pour diverses fonctions cellulaires. Les dysfonctionnements des microtubules sont fortement impliqués dans la pathogenèse, y compris les troubles neurodégénératifs. Les recherches en cours se concentrent sur les agents thérapeutiques ciblant les microtubules qui modulent la stabilité, offrant des options de traitement potentielles pour ces maladies et cancers. Par conséquent, la compréhension de l’état dynamique des microtubules est cruciale pour évaluer la progression de la maladie et les effets thérapeutiques.
Traditionnellement, la dynamique des microtubules a été évaluée in vitro ou dans des cellules en culture par fractionnement approximatif ou immunoessai, à l’aide d’anticorps ciblant les modifications post-traductionnelles de la tubuline. Cependant, l’analyse précise du statut de la tubuline dans les tissus à l’aide de telles procédures pose des défis. Dans cette étude, nous avons développé une méthode simple et innovante de fractionnement des microtubules pour séparer les microtubules stables, les microtubules labiles et la tubuline libre dans les tissus de souris.
La procédure a consisté à homogénéiser des tissus de souris disséqués dans un tampon stabilisateur de microtubules à un rapport de volume de 19 :1. Les homogénats ont ensuite été fractionnés par un processus d’ultracentrifugation en deux étapes après une centrifugation lente initiale (2 400 × g) pour éliminer les débris. La première étape d’ultracentrifugation (100 000 × g) a précipité les microtubules stables, tandis que le surnageant résultant a été soumis à une deuxième étape d’ultracentrifugation (500 000 × g) pour fractionner les microtubules labiles et les dimères de tubuline solubles. Cette méthode a permis de déterminer les proportions de tubuline constituant des microtubules stables ou labiles dans le cerveau de la souris. De plus, des variations tissulaires distinctes dans la stabilité des microtubules ont été observées qui étaient corrélées avec la capacité proliférative des cellules constitutives. Ces résultats mettent en évidence le potentiel important de cette nouvelle méthode pour l’analyse de la stabilité des microtubules dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Quantification de la tubuline dans les fractions P2, P3 et S3 du cerveau de souris par la méthode de fractionnement MT La tubuline dans les tissus de souris a été séparée en fractions P2, P3 et S3 par la méthode de fractionnement MT et quantifiée par Western blot (Figure 1A). Le précipité de MT qui est resté dans la fraction P2 par ultracentrifugation à 100 000 × g pendant 20 min représentait 34,86 % ± 1,68 % de la tubuline totale dans un cerveau de...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues at JoVE.com

Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues

Les microtubules, qui sont des polymères de tubuline, jouent un rôle crucial en tant que composant du cytosquelette des cellules eucaryotes et sont connus pour leur instabilité dynamique. Cette étude a mis au point une méthode de fractionnement des microtubules pour les séparer en microtubules stables, microtubules labiles et tubuline libre afin d’évaluer la stabilité des microtubules dans divers tissus de souris.

Technique quantitative de fractionnement des microtubules pour séparer les microtubules stables, les microtubules labiles et la tubuline libre dans les tissus de souris

Microtubules, composed of &#945;/&#946;-tubulin dimers, are a crucial component of the cytoskeleton in eukaryotic cells. These tube-like polymers exhibit ...

Notre nouveau protocole permet de distinguer et de quantifier trois statuts des anneaux tubulaires, tels que les microtubules stables, les microtubules labiles et les tubules libres dans les tissus animaux. Cette technique est composée d’étapes simples et permet d’évaluer la stabilité structurelle des tubes, qui ne peut pas être détectée par la quantification des tubes après modification translationnelle. Cette méthode est essentielle pour la recherche et le développement de moyens thérapeutiques pour les maladies où la stabilité des microtubules est critique, comme la maladie d’Alzheimer et les cancers.Commencez la procédure en préparant le vêtement de laboratoire pour la dissection tissulaire. Remplissez une boîte de glace pilée et placez-y deux boîtes de Pétri. Remplissez un plat avec une solution tampon de phosphate glacée ou PBS pour le lavage transitoire et le stockage des tissus disséqués.Posez du papier filtre imbibé de PBS sur le deuxième plat. Ensuite, pesez les microtubes de 1,5 millilitre remplis de PBS pour le stockage des tissus disséqués. Après avoir extrait les tissus d’une souris euthanasiée, transférez-les dans les tubes et pesez à nouveau chaque microtube.Déplacez les tissus dans un homogénéisateur en verre avec un tampon stabilisateur de microtubules glacé ou un milieu MSB+, et homogénéisez immédiatement le tissu à l’aide d’un homogénéisateur réfrigéré. Transférez maintenant l’homogénat tissulaire dans un microtube de deux millilitres à l’aide d’une pipette Pasteur et d’une centrifugeuse à 2 400 g pendant trois minutes à deux degrés Celsius. Transférez le surnageant dans un nouveau microtube de 1,5 millilitre pour éliminer les débris.Vortex le surnageant ou la fraction S1 dans un nouveau microtube de 1,5 millilitre. Pipeter immédiatement 200 microlitres de la fraction S1 dans un microtube de centrifugation et centrifuger à 100 000 G à l’aide d’un rotor TLA-55 pendant 20 minutes à deux degrés Celsius. Après la deuxième centrifugation, séparez le surnageant S2 du précipité P2.Transférez immédiatement la totalité de la fraction S2 dans un microtube de centrifugation et utilisez un rotor TLA-120.2 pour la faire tourner à 500 000 G pendant 60 minutes à deux degrés Celsius. Après la troisième centrifugation, séparez le surnageant S3 du précipité P3. Dissoudre toute la fraction S3 dans 200 microlitres de dodécylsulfate de sodium 2X ou tampon d’échantillon SDS.Mélangez les fractions S1 restantes avec un volume égal de tampon d’échantillon SDS 2X pour l’utiliser comme courbe standard pour le transfert Western. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de tampon d’échantillon SDS dans les tubes de fraction P2 et P3. Ensuite, sonifiez brièvement la solution pour dissoudre le précipité avant de transférer les échantillons dans de nouveaux microtubes de 1,5 millilitre et de les placer dans la glacière.Faites bouillir tous les échantillons à 100 degrés Celsius pendant trois minutes. Les microtubules de la fraction P2 représentaient 34,86 % de l’alpha-tubuline totale dans le cerveau d’une souris, tandis que ceux des fractions P3 et S3 représentaient respectivement 56,13 % et 9,01 %. Le pourcentage de bêta-3 tubuline dans les fractions P2, P3 et S3 n’était pas significativement différent de celui de l’alpha-tubuline.La fraction S2 a montré un passage limité de la tubuline à travers une colonne de spin d’ultrafiltration de 300 kilodaltons, tandis que la fraction S3 a permis un passage complet des complexes de tubuline. La séparation chromatographique a donné lieu à une élution de 100 kilodaltons de tubuline S3. Des proportions égales d’alpha et de bêta-tubuline ont été récupérées dans chaque fraction.Les fractions P2 étaient significativement enrichies en alpha-tubuline acétylée, tandis que l’alpha-tubuline tyrosinée était dominante dans la fraction P3. La congélation du cerveau avant l’homogénéisation a entraîné une diminution de la concentration d’alpha-tubuline dans les fractions P2. Cependant, l’alpha-tubuline a augmenté dans la fraction P3.La congélation a également diminué les niveaux d’acétylation et augmenté les niveaux de tyrosination de l’alpha-tubuline dans la fraction P2. Le traitement au nocodazole a diminué l’alpha-tubuline dans la fraction P2. Contrairement à la congélation, le nocodazole n’a pas affecté les modifications post-traductionnelles de la tubuline P2.Le tissu cérébral présentait une concentration significativement plus élevée de tubulines P2, tandis que les tubulines P3 étaient concentrées dans le tissu prolifératif. Le transfert Western a montré que la tubuline P2 spécifiquement présente dans le système nerveux provenait de microtubules stables, et que la tubuline P3 provenait de microtubules labiles. La stabilité des microtubules est très dynamique.Il est important de compléter ce protocole rapidement, sans interruption, dans un environnement à température froide. Assurez-vous également que les tissus et les fractions n’ont pas été congelés avant d’être dissous dans le tampon d’échantillon SDS. La combinaison de la présentation immunitaire à l’aide de chaque fraction et de la protéomique devrait permettre d’identifier les facteurs impliqués dans la dynamique des microtubules.À l’aide de cette méthode, nous avons révélé comment la protéine tau normale existe sur les microtubules. Il peut également être utilisé pour étudier comment il devient anormal dans les cerveaux âgés afin d’identifier de nouvelles cibles médicamenteuses de la démence.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolation des protéines de filament intermédiaires à partir de tissus de souris multiples pour étudier les modifications post-traductionnelles associées au vieillissement

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Recherche

Biochimie

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Méthode quantitative et Qualitative de sphingomyéline par LC-MS à l’aide de deux Stable isotopiquement étiquetés sphingomyéline espèces

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipulation de cellules vivantes pour construire Stable Assemblée cellulaire 3D sans échafaudage artificiel

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Spectrométrie de masse de pulvérisation foliaire : Une Technique d’ionisation ambiant rapide pour évaluer directement les métabolites de tissus végétaux

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robuste comparaison des niveaux de protéine tissus et partout ailleurs au développement aide à éponger occidental quantitatives standardisées

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Mesurer les interactions entre les sondes fluorescentes et la lignine dans les sections végétales par sFLIM Basé sur l'autofluorescence indigène

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Visualisation simultanée de la dynamique des microtubules réticulés et simples in vitro par microscopie TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Microscopie à fluorescence par interférence simultanée et à réflexion interne totale pour l’imagerie de microtubules dynamiques et de protéines associées

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

Auto-assemblage de tactoïdes de microtubules

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

La technique du peel-blot : une méthode de préparation d’échantillons cryo-EM pour séparer les couches uniques des échantillons biologiques multicouches ou concentrés

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...