Name: quantitative microtubule fractionation technique to separate stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin in mouse tissues
Uploaded: 2023-11-17T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal JST, dall'istituzione di borse di studio universitarie per la creazione di innovazione scientifica e tecnologica (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), Grant-in-Aid for JSPS Fellows (A.HT.; 23KJ2078), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) JSPS KAKENHI (22H02946 for TM), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas intitolato "Brain Protein Aging and Dementia Control" di MEXT (TM; 26117004) e Uehara Research Fellowship della Uehara Memorial Foundation (TM; 202020027). Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

1. Metodo di frazionamento MT
NOTA: Tutti gli esperimenti eseguiti in questo studio sono stati approvati dal Comitato Etico Animale della Doshisha University. In questo caso sono stati utilizzati topi C57BL/6J di entrambi i sessi, di 3-4 mesi di età. In questo protocollo, i tessuti sezionati, ad esempio cervello, fegato o timo, sono stati immediatamente omogeneizzati in un tampone stabilizzante dei microtubuli ghiacciato (MSB), che conteneva Taxol (stabilizzatore MT) a una conc...

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	<li>Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+code+and+its+role+in+controlling+microtubule+properties+and+functions.">The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).</li><li>Conde, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly,+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites.">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubule+ends+are+required+for+growth+cone+turning+to+avoid+an+inhibitory+guidance+cue.">Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue.</a> Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).</li><li>Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+neuronal+microtubule+cytoskeleton.">Building the neuronal microtubule cytoskeleton.</a> Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).</li><li>Leo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+fidgetin+restrains+axonal+growth+by+severing+labile+domains+of+microtubules.">Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules.</a> Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).</li><li>Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+code:+molecular+components,+readout+mechanisms,+and+functions.">The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions.</a> Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).</li><li>Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+post-translational+modifications+and+microtubule+dynamics.">Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).</li><li>Baas, P. W., Black, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+microtubules+in+the+axon+consist+of+domains+that+differ+in+both+composition+and+stability.">Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability.</a> Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).</li><li>Cartelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+alterations+occur+early+in+experimental+parkinsonism+and+the+microtubule+stabilizer+epothilone+D+is+neuroprotective.">Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective.</a> Scientific Reports. 3, 1837 (2013).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-binding+drugs+offset+tau+sequestration+by+stabilizing+microtubules+and+reversing+fast+axonal+transport+deficits+in+a+tauopathy+model.">Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+alpha-tubulin+in+Alzheimer+disease.">Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease.</a> Translational Neurodegeneration. 4, 9 (2015).</li><li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+improves+tau-induced+neuronal+dysfunction+of+nematodes.">Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes.</a> Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).</li><li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microtubule+assembly+competent+tubulin+synthesis+leads+to+accumulation+of+phosphorylated+tau+in+neuronal+cell+bodies.">Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).</li><li>Vielkind, U., Swierenga, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+fixation+procedure+for+immunofluorescent+detection+of+different+cytoskeletal+components+within+the+same+cell.">A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell.</a> Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).</li><li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+tau+isoforms+and+microtubule+bundle+formation+in+fibroblasts+transfected+with+a+single+tau+cDNA.">Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA.</a> Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).</li><li>Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+microtubules+of+the+axon:+quantitative+analysis+of+tyrosinated+and+acetylated+tubulin+along+individual+axonal+microtubules.">Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules.</a> Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).</li><li>Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+is+enriched+on+dynamic+microtubules+in+the+distal+region+of+growing+axons.">Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons.</a> Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).</li><li>Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+tubulin+synthesis+in+hepatocytes+and+fibroblasts.">Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts.</a> Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).</li><li>Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+destruction+of+stable+microtubules+and+axons+by+inhibitors+of+protein+serine/threonine+phosphatases+in+cultured+human+neurons.">Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons.</a> Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).</li><li>Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+destruction+induces+tau+liberation+and+its+subsequent+phosphorylation.">Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation.</a> FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).</li><li>Hagita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fractionation+of+tissue+microtubules+with+distinct+biochemical+properties+reflecting+their+stability+and+lability.">Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).</li><li>Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+tubulins+are+not+alike:+Heterodimer+dissociation+differs+among+different+biological+sources.">All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).</li><li>Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taxol-dependent+procedure+for+the+isolation+of+microtubules+and+microtubule-associated+proteins+(MAPs).">A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs).</a> Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).</li><li>Bartolo, M. E., Carter, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+microtubule+stabilization+on+the+freezing+tolerance+of+mesophyll+cells+of+spinach.">Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach.</a> Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).</li><li>Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPT+mutations,+tauopathy,+and+mechanisms+of+neurodegeneration.">MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).</li><li>Fourel, G., Boscheron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+mutations+in+neurodevelopmental+disorders+as+a+tool+to+decipher+microtubule+function.">Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function.</a> FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).</li><li>Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+in+Alzheimer's+presenile+dementia.">Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia.</a> The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).</li><li>Yoshida, H., Ihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+in+paired+helical+filaments+is+functionally+distinct+from+fetal+tau:+assembly+incompetence+of+paired+helical+filament-tau.">Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau.</a> Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).</li><li>Cash, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+reduction+in+Alzheimer's+disease+and+aging+is+independent+of+tau+filament+formation.">Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation.</a> The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).</li><li>Hempen, B., Brion, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+acetylated+alpha-tubulin+immunoreactivity+in+neurofibrillary+tangle-bearing+neurons+in+Alzheimer's+disease.">Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).</li><li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+expression+of+tau+and+tubulin+induces+neuronal+dysfunction+in+C.+elegans+models+of+tauopathy.">Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).</li><li>Boiarska, Z., Passarella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-targeting+agents+and+neurodegeneration.">Microtubule-targeting agents and neurodegeneration.</a> Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).</li></ol>

Il compito più significativo quando si studia lo stato della tubulina nei tessuti di organismi viventi è prevenire la polimerizzazione o la depolimerizzazione accidentale della MT durante la preparazione. La stabilità delle MT nei campioni è influenzata da fattori quali la concentrazione di Taxol nell'MSB, la proporzione di quantità di tessuto rispetto al tampone e la temperatura durante il processo dalla rimozione del tessuto all'omogeneizzazione e centrifugazione. Pertanto, le condizioni sono state ottimizzate in ...

I microtubuli (MT) sono strutture tubolari allungate costituite da protofilamenti costituiti da subunità eterodimeriche di α/β-tubulina. Svolgono ruoli essenziali in vari processi cellulari come la divisione cellulare, la motilità, il mantenimento della forma e il trasporto intracellulare, rendendoli componenti integrali del citoscheletro eucariotico1. L'estremità negativa delle MT, in cui è esposta la subunità α-tubulina, è relativamente stabile, mentre l'estremità negativa, in cui è esposta la subunità β-tubulina, subisce depolimerizzazione dinamica e polimerizzazione2. Questo ciclo continuo di aggiunta e dissociazione del dimero di tubulina all'estremità positiva, indicato come instabilità dinamica, si traduce in un processo ripetitivo di salvataggio e catastrofe3. Le MT presentano domini focali con variazioni localizzate nell'instabilità dinamica, inclusi domini stabili e labili4.
Il controllo preciso dell'instabilità dinamica delle MT è fondamentale per numerose funzioni cellulari, in particolare nei neuroni caratterizzati da morfologie complesse. L'adattabilità e la durata delle MT svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo e nel corretto funzionamento delle cellule nervose 5,6,7. È stato riscontrato che l'instabilità dinamica delle MT è associata a varie modificazioni post-traduzionali (PTM) della tubulina, come l'acetilazione, la fosforilazione, la palmitoilazione, la detirosinazione, il delta 2, l'ossidazione della poliglutammina e la poliglicilazione. Inoltre, il legame delle proteine associate ai microtubuli (MAP) funge da meccanismo di regolazione8. I PTM, esclusa l'acetilazione, si trovano prevalentemente nella regione carbossi-terminale della tubulina situata sulla superficie esterna delle MT. Queste modificazioni creano diverse condizioni superficiali sulle MT, influenzando la loro interazione con le MAP e, in ultima analisi, governando la stabilità della MT9. La presenza di un residuo di tirosina carbossi-terminale nella α-tubulina è indicativa di MT dinamiche, che vengono rapidamente sostituite dal pool di tubulina libera. Al contrario, la detirosinazione dell'estremità carbossilica e l'acetilazione di Lys40 indicano MT stabili con ridotta instabilità dinamica 9,10.
I PTM della tubulina sono stati ampiamente impiegati in esperimenti per valutare la dinamica e la stabilità delle MT 5,7,11,12,13,14,15. Ad esempio, negli studi sulle colture cellulari, le tubuline possono essere segregate in due pool: il pool di tubulina libera e il pool MT. Ciò si ottiene liberando la tubulina libera attraverso la permeabilizzazione cellulare prima di fissare le MT rimanenti 15,16,17,18,19. I metodi biochimici prevedono l'uso di stabilizzatori chimici MT che salvaguardano le MT dalla catastrofe, consentendo la separazione delle MT e della tubulina libera attraverso la centrifugazione20,21,22. Tuttavia, queste procedure non distinguono tra MT stabili e meno stabili (labili), rendendo così impossibile quantificare le MT o la tubulina solubile in tessuti come il cervello. Di conseguenza, la valutazione della stabilità della MT negli organismi in condizioni fisiologiche e patologiche si è rivelata impegnativa. Per affrontare questa limitazione sperimentale, abbiamo sviluppato una nuova tecnica per separare con precisione le MT e la tubulina libera nel tessuto di topo23.
Questo metodo unico di frazionamento MT prevede l'omogeneizzazione dei tessuti in condizioni che mantengono lo stato di tubulina nei tessuti e la centrifugazione in due fasi per separare le MT stabili, le MT labili e la tubulina libera. Questa semplice procedura può essere applicata a studi ampi, tra cui la ricerca di base su MT e MAP negli organismi viventi, analisi fisiologiche e patologiche della salute e delle malattie associate alla stabilità della MT e lo sviluppo di farmaci e altre terapie mirate alle MT.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ML TUBE CASE OF 500</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1A2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9028</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02442-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 kDa ultrafiltration spin column</td>
			<td>Aproscience</td>
			<td>PT-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-11B1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA prime plus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antipain</td>
			<td>Peptide Institute Inc.</td>
			<td>4062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aprotinin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>03346-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi-Lumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>07880-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>0.22&#181;m 33.2cm&#178; Nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIFP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>55-91-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIGITAL HOMOGENIZER</td>
			<td></td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>HOM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9026</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14128-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>37346-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W 3.3 Meter Roll</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17018-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td></td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17450-61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman</td>
			<td></td>
			<td>TOMY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9893-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Gauge Software&#160;</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoStar LD&#160;</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>292-69903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMX-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3408</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-4000 luminescent image analyzer</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leupeptin</td>
			<td>Peptide Institute Inc.</td>
			<td>43449-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>21003-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>32013-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31420-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>okadaic acid</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>O-2220&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTIMA MAX-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pepstatin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26436-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free)</td>
			<td></td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified tubulin&#160;</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSONICA Q55</td>
			<td>QSonica</td>
			<td>Q55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taxol</td>
			<td></td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>P-9600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-120.2 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-55 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLCK</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>34219-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative microtubule fractionation technique to separate stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin in mouse tissues

I microtubuli, composti da dimeri di α/β-tubulina, sono un componente cruciale del citoscheletro nelle cellule eucariotiche. Questi polimeri tubolari mostrano instabilità dinamica poiché le subunità eterodimeriche della tubulina subiscono polimerizzazione e depolimerizzazione ripetitive. Il controllo preciso della stabilità e della dinamica dei microtubuli, ottenuto attraverso le modificazioni post-traduzionali della tubulina e le proteine associate ai microtubuli, è essenziale per varie funzioni cellulari. Le disfunzioni nei microtubuli sono fortemente implicate nella patogenesi, comprese le malattie neurodegenerative. La ricerca in corso si concentra sugli agenti terapeutici mirati ai microtubuli che modulano la stabilità, offrendo potenziali opzioni di trattamento per queste malattie e tumori. Di conseguenza, la comprensione dello stato dinamico dei microtubuli è fondamentale per valutare la progressione della malattia e gli effetti terapeutici.
Tradizionalmente, la dinamica dei microtubuli è stata valutata in vitro o in coltura attraverso il frazionamento approssimativo o l'immunodosaggio, utilizzando anticorpi mirati alle modificazioni post-traduzionali della tubulina. Tuttavia, l'analisi accurata dello stato della tubulina nei tessuti utilizzando tali procedure pone delle sfide. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo di frazionamento dei microtubuli semplice e innovativo per separare i microtubuli stabili, i microtubuli labili e la tubulina libera nei tessuti di topo.
La procedura prevedeva l'omogeneizzazione di tessuti di topo sezionati in un tampone stabilizzante con microtubuli con un rapporto di volume di 19:1. Gli omogenati sono stati poi frazionati attraverso un processo di ultracentrifugazione in due fasi dopo una centrifugazione lenta iniziale (2.400 × g) per rimuovere i detriti. La prima fase di ultracentrifugazione (100.000 × g) ha precipitato microtubuli stabili, mentre il surnatante risultante è stato sottoposto a una seconda fase di ultracentrifugazione (500.000 × g) per frazionare i microtubuli labili e i dimeri solubili della tubulina. Questo metodo ha determinato le proporzioni di tubulina che costituiscono microtubuli stabili o labili nel cervello del topo. Inoltre, sono state osservate distinte variazioni tissutali nella stabilità dei microtubuli correlate con la capacità proliferativa delle cellule costituenti. Questi risultati evidenziano il potenziale significativo di questo nuovo metodo per l'analisi della stabilità dei microtubuli in condizioni fisiologiche e patologiche.

Quantificazione della tubulina nelle frazioni P2, P3 e S3 del cervello di topo con il metodo del frazionamento MT La tubulina nel tessuto di topo è stata separata nelle frazioni P2, P3 e S3 con il metodo del frazionamento MT e quantificata mediante Western blotting (Figura 1A). Il precipitato di MT che è rimasto nella frazione P2 mediante ultracentrifugazione a 100.000 × g per 20 minuti ha rappresentato il 34,86% ± l'1,68% della tubulina totale nel cervello d...

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Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues

I microtubuli, che sono polimeri di tubulina, svolgono un ruolo cruciale come componente del citoscheletro nelle cellule eucariotiche e sono noti per la loro instabilità dinamica. Questo studio ha sviluppato un metodo per frazionare i microtubuli per separarli in microtubuli stabili, microtubuli labili e tubulina libera per valutare la stabilità dei microtubuli in vari tessuti di topo.

Tecnica di frazionamento quantitativo dei microtubuli per separare microtubuli stabili, microtubuli labili e tubulina libera nei tessuti di topo

Microtubules, composed of &#945;/&#946;-tubulin dimers, are a crucial component of the cytoskeleton in eukaryotic cells. These tube-like polymers exhibit ...

Il nostro nuovo protocollo aiuta a distinguere e quantificare tre stati degli anelli tubolari, come i microtubuli stabili, i microtubuli labili e i tubuli liberi nei tessuti animali. Questa tecnica è composta da semplici passaggi e può valutare la stabilità strutturale del tubo, che non può essere rilevata dalla quantificazione della modifica post-traduzionale del tubo. Questo metodo è essenziale per la ricerca e lo sviluppo di metodi terapeutici per le malattie in cui la stabilità dei microtubuli è fondamentale, come il morbo di Alzheimer e i tumori.Iniziare la procedura preparando l'abbigliamento da laboratorio per la dissezione dei tessuti. Riempi una scatola con ghiaccio tritato e posizionaci sopra due piastre di Petri. Riempire un piatto con soluzione tampone fosfato ghiacciata o PBS per il lavaggio transitorio e la conservazione dei tessuti sezionati.Adagiare la carta da filtro inumidita con PBS sul secondo piatto. Successivamente, pesare le microprovette da 1,5 millilitri riempite con PBS per la conservazione dei tessuti dissezionati. Dopo aver estratto i tessuti da un topo sottoposto a eutanasia, trasferirli nelle provette e pesare nuovamente ogni microprovetta.Spostare i tessuti in un omogeneizzatore di vetro con tampone stabilizzante dei microtubuli ghiacciato o MSB+medium e omogeneizzare immediatamente il tessuto utilizzando un omogeneizzatore refrigerato. Ora trasferisci l'omogenato tissutale in una microprovetta da due millilitri utilizzando una pipetta Pasteur e centrifuga a 2.400 G per tre minuti a due gradi Celsius. Trasferire il surnatante in un nuovo microtubo da 1,5 millilitri per rimuovere i detriti.Vorticare il surnatante o la frazione S1 in un nuovo microtubo da 1,5 millilitri. Pipettare immediatamente 200 microlitri della frazione S1 in una microprovetta di centrifugazione e centrifugare a 100.000 G utilizzando un rotore TLA-55 per 20 minuti a due gradi Celsius. Dopo la seconda centrifugazione, separare il surnatante S2 dal precipitato P2.Trasferire immediatamente l'intera quantità della frazione S2 in una microprovetta di centrifugazione e utilizzare un rotore TLA-120.2 per farla girare a 500.000 G per 60 minuti a due gradi Celsius. Dopo la terza centrifugazione, separare il surnatante S3 dal precipitato P3. Sciogliere l'intera frazione S3 in 200 microlitri di 2X sodio dodecil solfato o tampone campione SDS.Miscelare le restanti frazioni S1 con un volume uguale di tampone campione SDS 2X da utilizzare come curva standard per il western blotting. Successivamente, aggiungere 400 microlitri di tampone per campioni SDS alle provette della frazione P2 e P3. Quindi, sonicare brevemente la soluzione per sciogliere il precipitato prima di trasferire i campioni in nuove microprovette da 1,5 millilitri e posizionarle nella ghiacciaia.Far bollire tutti i campioni a 100 gradi Celsius per tre minuti. I microtubuli nella frazione P2 rappresentavano il 34,86% dell'alfa-tubulina totale nel cervello di un topo, mentre quelli nelle frazioni P3 e S3 rappresentavano rispettivamente il 56,13% e il 9,01%. La percentuale di beta-3 tubulina nelle frazioni P2, P3 e S3 non era significativamente diversa da quella dell'alfa-tubulina.La frazione S2 ha mostrato un passaggio limitato di tubulina attraverso una colonna di spin di ultrafiltrazione da 300 kilodalton, mentre la frazione S3 ha permesso il passaggio completo dei complessi di tubulina. La separazione cromatografica ha portato a un'eluizione di 100 kilodalton di tubulina S3. Proporzioni uguali di alfa e beta-tubulina sono state recuperate in ciascuna frazione.Le frazioni P2 sono state significativamente arricchite con alfa-tubulina acetilata, mentre l'alfa-tubulina tirosinata era dominante nella frazione P3. Il congelamento del cervello prima dell'omogeneizzazione ha provocato una diminuzione della concentrazione di alfa-tubulina nelle frazioni P2. Tuttavia, l'alfa-tubulina è aumentata nella frazione P3.Il congelamento ha anche diminuito i livelli di acetilazione e aumentato i livelli di tirosinazione dell'alfa-tubulina nella frazione P2. Il trattamento con nocodazolo ha ridotto l'alfa-tubulina nella frazione P2. A differenza del congelamento, il nocodazolo non ha influenzato le modificazioni post-traduzionali della tubulina P2.Il tessuto cerebrale ha mostrato una concentrazione significativamente più elevata di tubuline P2, mentre le tubuline P3 erano concentrate nel tessuto proliferativo. Il Western blotting ha mostrato che la tubulina P2 specificamente presente nel sistema nervoso ha avuto origine da microtubuli stabili e la tubulina P3 ha avuto origine da microtubuli labili. La stabilità dei microtubuli è altamente dinamica.È importante completare questo protocollo rapidamente, senza interruzioni, in un ambiente a basse temperature. Assicurarsi inoltre che i tessuti e le frazioni non siano stati congelati fino a quando non sono stati sciolti nel tampone del campione SDS. La combinazione della presentazione immunitaria utilizzando ciascuna frazione con la proteomica dovrebbe identificare i fattori coinvolti nella dinamica dei microtubuli.Usando questo metodo, abbiamo rivelato come la tau normale esista sui microtubuli. Può anche essere utilizzato per studiare come diventa anormale nei cervelli invecchiati al fine di identificare nuovi bersagli farmacologici della demenza.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Isolamento di proteine ​​filamentose intermedie da tessuti multipli di topo per studiare modificazioni post-traduzionali associate all&#39;invecchiamento

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