Name: quantitative microtubule fractionation technique to separate stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin in mouse tissues
Uploaded: 2023-11-17T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues at JoVE.com

이 작업은 JST의 과학기술 혁신 창출을 위한 대학 펠로우십 설립(A.HT; JPMJFS2145), JST 스프링(A.HT.; JPMJSP2129), JSPS 펠로우를 위한 보조금(A.HT.; 23KJ2078), 과학 연구 보조금(B) JSPS KAKENHI(TM의 경우 22H02946), 문부과학성(TM; 26117004)의 "뇌 단백질 노화 및 치매 제어"라는 제목의 혁신적인 분야에 대한 과학 연구 보조금 및 우에하라 기념 재단(TM; 202020027)의 우에하라 연구 펠로우십. 저자는 재정적 이익이 상충되지 않는다고 선언합니다.

1. MT 분획법
참고: 본 연구에서 수행된 모든 실험은 도시샤 대학 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. C57BL/6J 생후 3-4개월 된 남녀 마우스를 여기에 사용하였다. 이 프로토콜에서 절개된 조직(예: 뇌, 간 또는 흉선)은 해중합뿐만 아니라 MT의 재중합을 방지하는 농도로 탁솔(MT 안정제)을 함유한 얼음처럼 차가운 미세소관 안정화 완충액(MSB)에서 즉시 균질화되었습?...

<ol>
	<li>Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+code+and+its+role+in+controlling+microtubule+properties+and+functions.">The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).</li><li>Conde, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly,+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites.">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubule+ends+are+required+for+growth+cone+turning+to+avoid+an+inhibitory+guidance+cue.">Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue.</a> Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).</li><li>Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+neuronal+microtubule+cytoskeleton.">Building the neuronal microtubule cytoskeleton.</a> Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).</li><li>Leo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+fidgetin+restrains+axonal+growth+by+severing+labile+domains+of+microtubules.">Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules.</a> Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).</li><li>Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+code:+molecular+components,+readout+mechanisms,+and+functions.">The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions.</a> Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).</li><li>Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+post-translational+modifications+and+microtubule+dynamics.">Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).</li><li>Baas, P. W., Black, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+microtubules+in+the+axon+consist+of+domains+that+differ+in+both+composition+and+stability.">Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability.</a> Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).</li><li>Cartelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+alterations+occur+early+in+experimental+parkinsonism+and+the+microtubule+stabilizer+epothilone+D+is+neuroprotective.">Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective.</a> Scientific Reports. 3, 1837 (2013).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-binding+drugs+offset+tau+sequestration+by+stabilizing+microtubules+and+reversing+fast+axonal+transport+deficits+in+a+tauopathy+model.">Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+alpha-tubulin+in+Alzheimer+disease.">Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease.</a> Translational Neurodegeneration. 4, 9 (2015).</li><li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+improves+tau-induced+neuronal+dysfunction+of+nematodes.">Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes.</a> Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).</li><li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microtubule+assembly+competent+tubulin+synthesis+leads+to+accumulation+of+phosphorylated+tau+in+neuronal+cell+bodies.">Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).</li><li>Vielkind, U., Swierenga, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+fixation+procedure+for+immunofluorescent+detection+of+different+cytoskeletal+components+within+the+same+cell.">A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell.</a> Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).</li><li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+tau+isoforms+and+microtubule+bundle+formation+in+fibroblasts+transfected+with+a+single+tau+cDNA.">Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA.</a> Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).</li><li>Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+microtubules+of+the+axon:+quantitative+analysis+of+tyrosinated+and+acetylated+tubulin+along+individual+axonal+microtubules.">Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules.</a> Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).</li><li>Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+is+enriched+on+dynamic+microtubules+in+the+distal+region+of+growing+axons.">Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons.</a> Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).</li><li>Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+tubulin+synthesis+in+hepatocytes+and+fibroblasts.">Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts.</a> Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).</li><li>Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+destruction+of+stable+microtubules+and+axons+by+inhibitors+of+protein+serine/threonine+phosphatases+in+cultured+human+neurons.">Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons.</a> Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).</li><li>Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+destruction+induces+tau+liberation+and+its+subsequent+phosphorylation.">Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation.</a> FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).</li><li>Hagita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fractionation+of+tissue+microtubules+with+distinct+biochemical+properties+reflecting+their+stability+and+lability.">Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).</li><li>Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+tubulins+are+not+alike:+Heterodimer+dissociation+differs+among+different+biological+sources.">All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).</li><li>Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taxol-dependent+procedure+for+the+isolation+of+microtubules+and+microtubule-associated+proteins+(MAPs).">A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs).</a> Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).</li><li>Bartolo, M. E., Carter, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+microtubule+stabilization+on+the+freezing+tolerance+of+mesophyll+cells+of+spinach.">Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach.</a> Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).</li><li>Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPT+mutations,+tauopathy,+and+mechanisms+of+neurodegeneration.">MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).</li><li>Fourel, G., Boscheron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+mutations+in+neurodevelopmental+disorders+as+a+tool+to+decipher+microtubule+function.">Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function.</a> FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).</li><li>Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+in+Alzheimer's+presenile+dementia.">Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia.</a> The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).</li><li>Yoshida, H., Ihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+in+paired+helical+filaments+is+functionally+distinct+from+fetal+tau:+assembly+incompetence+of+paired+helical+filament-tau.">Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau.</a> Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).</li><li>Cash, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+reduction+in+Alzheimer's+disease+and+aging+is+independent+of+tau+filament+formation.">Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation.</a> The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).</li><li>Hempen, B., Brion, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+acetylated+alpha-tubulin+immunoreactivity+in+neurofibrillary+tangle-bearing+neurons+in+Alzheimer's+disease.">Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).</li><li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+expression+of+tau+and+tubulin+induces+neuronal+dysfunction+in+C.+elegans+models+of+tauopathy.">Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).</li><li>Boiarska, Z., Passarella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-targeting+agents+and+neurodegeneration.">Microtubule-targeting agents and neurodegeneration.</a> Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).</li></ol>

살아있는 유기체의 조직 내 튜불린 상태를 조사할 때 가장 중요한 작업은 준비 중 우발적인 MT 중합 또는 해중합을 방지하는 것입니다. 샘플에서 MT의 안정성은 MSB의 탁솔 농도, 완충액에 대한 조직 양의 비율, 조직 제거에서 균질화 및 원심분리에 이르는 과정 중 온도와 같은 요인의 영향을 받습니다. 따라서, 조건은 20배 부피의 균질액으로 마우스 조직을 분석하기 위한 프로토콜의 각 단계에서 최...

미세소관(MT)은 α/β-튜불린 헤테로다이머 소단위로 구성된 프로토필라멘트로 구성된 길쭉한 관형 구조입니다. 이들은 세포 분열, 운동성, 형태 유지, 세포 내 수송과 같은 다양한 세포 과정에서 필수적인 역할을 하며, 진핵생물 세포골격의 필수 구성 요소가 된다1. α-튜불린 소단위체가 노출되는 MT의 마이너스 엔드는 비교적 안정적인 반면, β-튜불린 서브유닛이 노출되는 플러스 엔드는 동적 해중합 및 중합을 거친다2. 동적 불안정성(dynamic instability)이라고 하는 플러스 말단(plus-end)에서의 튜불린 이량체 첨가 및 해리의 연속적인 순환은 구조와 재앙의 반복적인 과정을 초래한다3. MT는 안정적 영역과 불안정한 영역을 포함하여 동적 불안정성의 국소적 변형이 있는 초점 영역을 나타낸다4.
MT의 동적 불안정성을 정밀하게 제어하는 것은 특히 복잡한 형태를 특징으로 하는 뉴런에서 수많은 세포 기능에 매우 중요합니다. MT의 적응성과 내구성은 신경 세포의 발달과 적절한 기능에 중요한 역할을 합니다 5,6,7. MT의 동적 불안정성은 아세틸화, 인산화, 팔미토일화, 탈티로시닝, 델타 2, 폴리글루타민 산화 및 폴리글리실화와 같은 튜불린의 다양한 번역 후 변형(PTM)과 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다. 또한, 미세소관 관련 단백질(microtubule-associated protein, MAP)의 결합은 조절 메커니즘역할을 한다 8. 아세틸화를 제외한 PTM은 주로 MT의 외부 표면에 위치한 튜불린 카르복시 말단 영역에서 발생합니다. 이러한 수정은 MT에 다양한 표면 조건을 만들어 MAP과의 상호 작용에 영향을 미치고 궁극적으로 MT 안정성을 좌우합니다9. α-튜불린에 카르복시 말단 티로신 잔류물이 존재한다는 것은 동적 MT를 나타내며, 이는 유리 튜불린 풀로 빠르게 대체됩니다. 반대로, 카르복시 말단의 탈티로신화와 Lys40의 아세틸화는 동적 불안정성이 감소된 안정적인 MT를 의미합니다 9,10.
튜불린의 PTM은 MT 5,7,11,12,13,14,15의 역학 및 안정성을 평가하기 위한 실험에 광범위하게 사용되었습니다. 예를 들어, 세포 배양 연구에서 튜불린은 유리 튜불린 풀과 MT 풀의 두 가지 풀로 분리할 수 있습니다. 이는 나머지 MTs 15,16,17,18,19를 고정하기 전에 세포 투과화를 통해 유리 튜불린을 방출함으로써 달성됩니다. 생화학적 방법은 MT를 재앙으로부터 보호하는 화학적 MT 안정제의 사용을 포함하며, 원심분리를 통해 MT와 유리 튜불린의 분리를 가능하게 한다20,21,22. 그러나 이러한 절차는 안정적인 MT와 덜 안정적인(불안정한) MT를 구별하지 못하므로 뇌와 같은 조직에서 MT 또는 용해성 튜불린을 정량화하는 것이 불가능합니다. 결과적으로, 생리학적 및 병리학적 조건에서 유기체의 MT 안정성을 평가하는 것은 어려운 것으로 입증되었습니다. 이러한 실험적 한계를 해결하기 위해 마우스 조직23에서 MT와 유리 튜불린을 정밀하게 분리하는 새로운 기술을 개발했습니다.
이 독특한 MT 분획 방법은 조직에서 튜불린 상태를 유지하는 조건에서의 조직 균질화와 안정적인 MT, 불안정한 MT 및 유리 튜불린을 분리하기 위한 2단계 원심분리를 포함합니다. 이 간단한 절차는 살아있는 유기체의 MT 및 MAP에 대한 기초 연구, MT 안정성과 관련된 건강 및 질병의 생리학적 및 병리학적 분석, MT를 표적으로 하는 약물 및 기타 치료제 개발을 포함한 광범위한 연구에 적용할 수 있습니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ML TUBE CASE OF 500</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1A2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9028</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02442-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 kDa ultrafiltration spin column</td>
			<td>Aproscience</td>
			<td>PT-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-11B1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA prime plus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antipain</td>
			<td>Peptide Institute Inc.</td>
			<td>4062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aprotinin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>03346-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi-Lumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>07880-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>0.22&#181;m 33.2cm&#178; Nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIFP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>55-91-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIGITAL HOMOGENIZER</td>
			<td></td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>HOM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9026</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14128-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>37346-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W 3.3 Meter Roll</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17018-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td></td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17450-61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman</td>
			<td></td>
			<td>TOMY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9893-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Gauge Software&#160;</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoStar LD&#160;</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>292-69903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMX-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3408</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-4000 luminescent image analyzer</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leupeptin</td>
			<td>Peptide Institute Inc.</td>
			<td>43449-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>21003-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>32013-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31420-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>okadaic acid</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>O-2220&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTIMA MAX-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pepstatin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26436-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free)</td>
			<td></td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified tubulin&#160;</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSONICA Q55</td>
			<td>QSonica</td>
			<td>Q55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taxol</td>
			<td></td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>P-9600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-120.2 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-55 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLCK</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>34219-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative microtubule fractionation technique to separate stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin in mouse tissues

α/β-튜불린 이량체로 구성된 미세소관은 진핵 세포에서 세포골격의 중요한 구성 요소입니다. 이러한 튜브형 중합체는 튜불린 헤테로다이머 소단위체가 반복적인 중합 및 해중합을 겪을 때 동적 불안정성을 나타냅니다. 튜불린 번역 후 변형(post-translational modification) 및 미세소관 관련 단백질을 통해 달성되는 미세소관 안정성 및 역학의 정밀한 제어는 다양한 세포 기능에 필수적입니다. 미세소관의 기능 장애는 신경 퇴행성 질환을 포함한 발병기전과 밀접한 관련이 있습니다. 진행 중인 연구는 안정성을 조절하는 미세소관 표적 치료제에 중점을 두고 있으며, 이러한 질병 및 암에 대한 잠재적인 치료 옵션을 제공합니다. 따라서 미세소관의 동적 상태를 이해하는 것은 질병 진행 및 치료 효과를 평가하는 데 매우 중요합니다.
전통적으로 미세소관 역학은 튜불린의 번역 후 변형을 표적으로 하는 항체를 사용하여 거친 분획 또는 면역분석을 통해 시험관 내 또는 배양된 세포에서 평가되었습니다. 그러나 이러한 절차를 사용하여 조직의 튜불린 상태를 정확하게 분석하는 것은 어려운 일입니다. 이 연구에서는 마우스 조직에서 안정적인 미세소관, 불안정한 미세소관 및 유리 튜불린을 분리하는 간단하고 혁신적인 미세소관 분획 방법을 개발했습니다.
이 절차에는 19:1 부피 비율로 미세소관 안정화 완충액에서 절개된 마우스 조직을 균질화하는 작업이 포함되었습니다. 그런 다음 균질액을 초기 느린 원심분리(2,400× g)에 이어 2단계 초원심분리 공정을 통해 분획하여 파편을 제거했습니다. 제1 초원심분리 단계(100,000 × g)는 안정한 미세소관을 침전시킨 반면, 생성된 상층액은 불안정한 미세소관 및 용해성 튜불린 이량체를 분획하기 위해 제2 초원심분리 단계(500,000 × g)를 거쳤다. 이 방법은 쥐의 뇌에서 안정적이거나 불안정한 미세소관을 구성하는 튜불린의 비율을 측정했습니다. 또한, 구성 세포의 증식 능력과 상관 관계가 있는 미세소관 안정성의 뚜렷한 조직 변이가 관찰되었습니다. 이러한 발견은 생리학적 및 병리학적 조건에서 미세소관 안정성을 분석하기 위한 이 새로운 방법의 상당한 잠재력을 강조합니다.

MT 분획 방법에 의한 마우스 뇌의 P2, P3 및 S3 분획에서 튜불린의 정량화 마우스 조직의 튜불린을 MT 분획법에 의해 P2, P3 및 S3 분획으로 분리하고 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 정량화했습니다(그림 1A). 20분 동안 100,000× g 에서 초원심분리에 의해 P2 분획에 남아 있는 MT의 침전물은 마우스 뇌에서 총 튜불린의 34.86% ± 1.68%를 차지했습니다. 상층액(S2)을 60...

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Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues

튜불린 중합체인 미세소관은 진핵 세포에서 세포골격 구성 요소로서 중요한 역할을 하며 동적 불안정성으로 알려져 있습니다. 본 연구는 다양한 마우스 조직에서 미세소관의 안정성을 평가하기 위해 미세소관을 분류하여 안정 미세소관, 불안정한 미세소관, 유리 튜불린으로 분리하는 방법을 개발하였다.

마우스 조직에서 안정적인 미세소관, 불안정한 미세소관 및 유리 튜불린을 분리하기 위한 정량적 미세소관 분획 기술

Microtubules, composed of &#945;/&#946;-tubulin dimers, are a crucial component of the cytoskeleton in eukaryotic cells. These tube-like polymers exhibit ...

당사의 새로운 프로토콜은 동물 조직의 안정적인 미세소관, 불안정한 미세소관 및 자유 세뇨관과 같은 튜브 링의 세 가지 상태를 구별하고 정량화하는 데 도움이 됩니다. 이 기법은 간단한 단계로 구성되며 병진 변형 후 튜빙의 정량화로 검출할 수 없는 튜빙의 구조적 안정성을 평가할 수 있습니다. 이 방법은 알츠하이머병 및 암과 같이 미세소관 안정성이 중요한 질병에 대한 치료 방법의 연구 및 개발에 필수적입니다.조직 해부를 위한 실험실 착용을 준비하여 절차를 시작합니다. 상자에 으깬 얼음을 채우고 그 위에 두 개의 페트리 접시를 놓습니다. 얼음처럼 차가운 인산염 완충 용액 또는 PBS로 접시 하나를 채우면 해부된 조직의 일시적인 세척 및 보관이 가능합니다.두 번째 접시에 PBS를 적신 여과지를 놓습니다. 다음으로, 절개된 조직 보관을 위해 PBS로 채워진 1.5밀리리터 마이크로튜브의 무게를 잰다. 안락사된 쥐에서 조직을 추출한 후 튜브로 옮기고 각 마이크로튜브의 무게를 다시 잰다.조직을 얼음처럼 차가운 미세소관 안정화 완충액 또는 MSB+medium이 있는 유리 균질화기로 옮기고 냉각된 균질화기를 사용하여 조직을 즉시 균질화합니다. 이제 파스퇴르 피펫과 2, 400G의 원심 분리기를 사용하여 조직 균질액을 섭씨 2도에서 3 분 동안 2 밀리리터 마이크로 튜브로 옮깁니다. 상층액을 새 1.5밀리리터 마이크로튜브로 옮겨 이물질을 제거합니다.새로운 1.5밀리리터 마이크로튜브에서 상층액 또는 S1 분획을 소용돌이치게 합니다. 즉시 S1 분획의 200 마이크로 리터를 원심 분리 마이크로 튜브에 넣고 100, 000 G에서 TLA-55 로터를 사용하여 섭씨 2도에서 20 분 동안 원심 분리기합니다. 두 번째 원심분리 후 P2 침전물에서 S2 상층액을 분리합니다.즉각 S2 조각의 전량을 원심분리 microtube로 옮기고 500에 회전시키도, 2 섭씨 온도에 60 분 동안 000 G를 회전시키기 위하여 TLA-120.2 회전자를 이용하십시오. 세 번째 원심분리 후 P3 침전물에서 S3 상층액을 분리합니다. 전체 S3 분획을 2X 소듐 도데실 설페이트 또는 SDS 샘플 완충액 200마이크로리터에 용해시킵니다.나머지 S1 분획을 동일한 부피의 2X SDS 샘플 버퍼와 혼합하여 웨스턴 블로팅의 표준 곡선으로 사용합니다. 다음으로, 400 마이크로리터의 SDS 샘플 완충액을 P2 및 P3 분획 튜브에 추가합니다. 그런 다음 샘플을 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 튜브로 옮기고 아이스 박스에 넣기 전에 용액을 간단히 초음파 처리하여 침전물을 용해시킵니다.모든 샘플을 섭씨 100도에서 3분 동안 끓입니다. P2 분획의 미세소관은 쥐의 뇌에서 전체 알파-튜불린의 34.86%를 차지하는 반면, P3 및 S3 분획의 미세소관은 각각 56.13%와 9.01%를 차지했습니다. P2, P3 및 S3 분획에서 베타-3 튜불린의 비율은 알파-튜불린의 비율과 유의하게 다르지 않았습니다.S2 분획은 300킬로달톤 한외여과 스핀 컬럼을 통한 튜불린의 제한된 통과를 보인 반면, S3 분획은 튜불린 복합체의 완전한 통과를 허용했습니다. 크로마토그래피 분리를 통해 S3 튜불린을 100킬로달톤 용출할 수 있었습니다. 동일한 비율의 알파 튜불린과 베타 튜불린이 각 분획에서 회수되었습니다.P2 분획물은 아세틸화된 알파-튜불린으로 유의하게 농축된 반면, 티로신화 알파-튜불린은 P3 분획에서 우세했습니다. 균질화 전에 뇌를 얼리면 P2 분획에서 알파-튜불린 농도가 감소했습니다. 그러나 알파 튜불린은 P3 분획에서 증가했습니다.냉동은 또한 아세틸화 수준을 감소시키고 P2 분획에서 알파-튜불린의 티로시화 수준을 증가시켰습니다. 노코다졸 처리는 P2 분획에서 알파-튜불린을 감소시켰다. 동결과 대조적으로, 노코다졸은 P2 튜불린 번역 후 변형에 영향을 미치지 않았다.뇌 조직은 P2 튜불린의 농도가 현저히 높은 반면, P3 튜불린은 증식 조직에 집중되어 있었다. 웨스턴 블로팅(Western blotting)은 신경계에서 특이적으로 발견되는 P2 튜불린(P2 tubulin)은 안정된 미세소관(stable microtubules)에서 유래하고, P3 튜불린(P3 tubulin)은 불안정한 미세소관(microtubules)에서 유래한다는 것을 보여주었습니다. 미세소관의 안정성은 매우 동적입니다.추운 온도 환경에서 중단 없이 이 프로토콜을 신속하게 완료하는 것이 중요합니다. 또한 조직과 분획이 SDS 샘플 완충액에 용해될 때까지 동결되지 않았는지 확인하십시오. 각 분획을 단백질체학과 사용하여 면역 발현을 결합하면 미세소관 역학과 관련된 요인을 식별할 수 있을 것으로 기대됩니다.이 방법을 사용하여 미세소관에 정상적인 타우가 어떻게 존재하는지 밝혔습니다. 또한 치매의 새로운 약물 표적을 식별하기 위해 노화된 뇌에서 어떻게 비정상이 되는지를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

노화 관련 post-translational 수정을 공부하기 위해 여러 마우스 조직에서 중간 필라멘트 단백질의 분리

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

연구

생화학

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

LC-MS Isotopically 두 안정을 사용 하 여 Sphingomyelin에 대 한 양적 및 질적 방법 Sphingomyelin 종 분류

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

인공 비 계 없이 안정적인 3D 셀룰러 어셈블리를 생성 하는 살아있는 세포를 조작

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

잎 스프레이 질량 분석: 식물 조직에서 대사를 직접 평가 하는 급속 한 대기 이온화 기술

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

네이티브 오토플루임션을 기반으로 sFLIM에 의한 식물 섹션의 형광 프로브와 리그닌 간의 상호 작용 측정

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

미세 소관 선인장체의 자체 조립

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

필 블롯 기법: 다층 또는 농축된 생물학적 시료에서 단층을 분리하는 Cryo-EM 시료 전처리 방법

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...