Name: quantitative microtubule fractionation technique to separate stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin in mouse tissues
Uploaded: 2023-11-17T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado, em parte, pela JST: o estabelecimento de bolsas universitárias para a criação de ciência, tecnologia, inovação (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), Grant-in-Aid for JSPS Fellows (A.HT.; 23KJ2078), Grant-in-Aid for Scientific Research(B) JSPS KAKENHI (22H02946 for TM), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas intitulado "Brain Protein Aging and Dementia Control" da MEXT (TM; 26117004), e pela Uehara Research Fellowship da Uehara Memorial Foundation (TM; 202020027). Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

1. Método de fracionamento MT
NOTA: Todos os experimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Doshisha. Camundongos C57BL/6J de ambos os sexos, com 3-4 meses de idade, foram usados aqui. Nesse protocolo, os tecidos dissecados, por exemplo, cérebro, fígado ou timo, foram imediatamente homogeneizados em tampão estabilizador de microtúbulos (MSB) gelado, que continha Taxol (estabilizador de MT) em uma concentração que impe...

<ol>
	<li>Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+code+and+its+role+in+controlling+microtubule+properties+and+functions.">The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).</li><li>Conde, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly,+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites.">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubule+ends+are+required+for+growth+cone+turning+to+avoid+an+inhibitory+guidance+cue.">Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue.</a> Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).</li><li>Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+neuronal+microtubule+cytoskeleton.">Building the neuronal microtubule cytoskeleton.</a> Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).</li><li>Leo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+fidgetin+restrains+axonal+growth+by+severing+labile+domains+of+microtubules.">Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules.</a> Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).</li><li>Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+code:+molecular+components,+readout+mechanisms,+and+functions.">The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions.</a> Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).</li><li>Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+post-translational+modifications+and+microtubule+dynamics.">Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).</li><li>Baas, P. W., Black, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+microtubules+in+the+axon+consist+of+domains+that+differ+in+both+composition+and+stability.">Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability.</a> Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).</li><li>Cartelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+alterations+occur+early+in+experimental+parkinsonism+and+the+microtubule+stabilizer+epothilone+D+is+neuroprotective.">Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective.</a> Scientific Reports. 3, 1837 (2013).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-binding+drugs+offset+tau+sequestration+by+stabilizing+microtubules+and+reversing+fast+axonal+transport+deficits+in+a+tauopathy+model.">Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+alpha-tubulin+in+Alzheimer+disease.">Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease.</a> Translational Neurodegeneration. 4, 9 (2015).</li><li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+improves+tau-induced+neuronal+dysfunction+of+nematodes.">Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes.</a> Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).</li><li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microtubule+assembly+competent+tubulin+synthesis+leads+to+accumulation+of+phosphorylated+tau+in+neuronal+cell+bodies.">Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).</li><li>Vielkind, U., Swierenga, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+fixation+procedure+for+immunofluorescent+detection+of+different+cytoskeletal+components+within+the+same+cell.">A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell.</a> Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).</li><li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+tau+isoforms+and+microtubule+bundle+formation+in+fibroblasts+transfected+with+a+single+tau+cDNA.">Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA.</a> Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).</li><li>Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+microtubules+of+the+axon:+quantitative+analysis+of+tyrosinated+and+acetylated+tubulin+along+individual+axonal+microtubules.">Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules.</a> Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).</li><li>Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+is+enriched+on+dynamic+microtubules+in+the+distal+region+of+growing+axons.">Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons.</a> Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).</li><li>Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+tubulin+synthesis+in+hepatocytes+and+fibroblasts.">Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts.</a> Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).</li><li>Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+destruction+of+stable+microtubules+and+axons+by+inhibitors+of+protein+serine/threonine+phosphatases+in+cultured+human+neurons.">Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons.</a> Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).</li><li>Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+destruction+induces+tau+liberation+and+its+subsequent+phosphorylation.">Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation.</a> FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).</li><li>Hagita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fractionation+of+tissue+microtubules+with+distinct+biochemical+properties+reflecting+their+stability+and+lability.">Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).</li><li>Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+tubulins+are+not+alike:+Heterodimer+dissociation+differs+among+different+biological+sources.">All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).</li><li>Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taxol-dependent+procedure+for+the+isolation+of+microtubules+and+microtubule-associated+proteins+(MAPs).">A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs).</a> Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).</li><li>Bartolo, M. E., Carter, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+microtubule+stabilization+on+the+freezing+tolerance+of+mesophyll+cells+of+spinach.">Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach.</a> Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).</li><li>Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPT+mutations,+tauopathy,+and+mechanisms+of+neurodegeneration.">MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).</li><li>Fourel, G., Boscheron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+mutations+in+neurodevelopmental+disorders+as+a+tool+to+decipher+microtubule+function.">Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function.</a> FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).</li><li>Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+in+Alzheimer's+presenile+dementia.">Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia.</a> The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).</li><li>Yoshida, H., Ihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+in+paired+helical+filaments+is+functionally+distinct+from+fetal+tau:+assembly+incompetence+of+paired+helical+filament-tau.">Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau.</a> Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).</li><li>Cash, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+reduction+in+Alzheimer's+disease+and+aging+is+independent+of+tau+filament+formation.">Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation.</a> The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).</li><li>Hempen, B., Brion, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+acetylated+alpha-tubulin+immunoreactivity+in+neurofibrillary+tangle-bearing+neurons+in+Alzheimer's+disease.">Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).</li><li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+expression+of+tau+and+tubulin+induces+neuronal+dysfunction+in+C.+elegans+models+of+tauopathy.">Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).</li><li>Boiarska, Z., Passarella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-targeting+agents+and+neurodegeneration.">Microtubule-targeting agents and neurodegeneration.</a> Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).</li></ol>

A tarefa mais significativa ao investigar o estado da tubulina em tecidos de organismos vivos é prevenir a polimerização acidental de MT ou a despolimerização durante a preparação. A estabilidade das MTs nas amostras é afetada por fatores como a concentração de Taxol em MSB, a proporção da quantidade de tecido em tampão e a temperatura durante o processo, desde a remoção do tecido até a homogeneização e centrifugação. Portanto, as condições foram otimizadas em cada etapa do protocolo para análise d...

Microtúbulos (MTs) são estruturas tubulares alongadas constituídas por protofilamentos constituídos por subunidades heterodímeras de α/β-tubulina. Desempenham papéis essenciais em vários processos celulares, como divisão celular, motilidade, manutenção da forma e transporte intracelular, tornando-se componentes integrantes do citoesqueleto eucariótico1. A extremidade inferior das MTs, onde a subunidade α-tubulina é exposta, é relativamente estável, enquanto a extremidade superior, onde a subunidade β-tubulina é exposta, sofre despolimerização dinâmica e polimerização2. Esse ciclo contínuo de adição e dissociação de dímeros de tubulina na extremidade superior, denominado instabilidade dinâmica, resulta em um processo repetitivo de resgate e catástrofe3. As MTs exibem domínios focais com variações localizadas na instabilidade dinâmica, incluindo domínios estáveis e lábeis4.
O controle preciso da instabilidade dinâmica das MTs é crucial para inúmeras funções celulares, particularmente em neurônios caracterizados por morfologias intrincadas. A adaptabilidade e a durabilidade das MTs desempenham um papel vital no desenvolvimento e funcionamento adequado das células nervosas 5,6,7. A instabilidade dinâmica das MTs tem sido associada a várias modificações pós-traducionais (MPTs) da tubulina, tais como acetilação, fosforilação, palmitoilação, destirosinação, delta 2, oxidação de poliglutamina e poliglicilação. Além disso, a ligação de proteínas associadas a microtúbulos (MAPs) serve como mecanismo regulatório8. As MPTs, excluindo a acetilação, ocorrem predominantemente na região carboxi-terminal da tubulina, situada na superfície externa das MTs. Essas modificações criam diversas condições de superfície nas MTs, influenciando sua interação com as MAPs e, em última análise, governando a estabilidade das MTs9. A presença de um resíduo de tirosina carboxi-terminal na α-tubulina é indicativa de MTs dinâmicas, que são rapidamente substituídas pelo pool de tubulina livre. Por outro lado, a destirosinação do terminal carboxi e a acetilação de Lys40 significam MTs estáveis com reduzida instabilidade dinâmica 9,10.
As MPTs da tubulina têm sido extensivamente empregadas em experimentos para avaliar a dinâmica e estabilidade de MTs 5,7,11,12,13,14,15. Por exemplo, em estudos de cultura celular, as tubulinas podem ser segregadas em dois pools: o pool de tubulina livre e o pool de MT. Isso é conseguido liberando-se tubulina livre através da permeabilização celular antes da fixação das MTs remanescentes 15,16,17,18,19. Os métodos bioquímicos envolvem o uso de estabilizantes químicos de MT que protegem MTs de catástrofes, possibilitando a separação de MTs e tubulina livre através de centrifugação20,21,22. No entanto, esses procedimentos não diferenciam entre MTs estáveis e menos estáveis (lábeis), tornando impossível quantificar MTs ou tubulina solúvel em tecidos como o cérebro. Consequentemente, avaliar a estabilidade da MT em organismos sob condições fisiológicas e patológicas tem se mostrado um desafio. Para resolver essa limitação experimental, desenvolvemos uma nova técnica para separar com precisão MTs e tubulina livre em tecido decamundongos23.
Este método único de fracionamento de MT envolve homogeneização de tecidos sob condições que mantêm o status de tubulina nos tecidos e centrifugação em duas etapas para separar MTs estáveis, MTs lábeis e tubulina livre. Este procedimento simples pode ser aplicado a estudos amplos, incluindo pesquisa básica sobre MTs e MAPs em organismos vivos, análises fisiológicas e patológicas de saúde e doenças associadas à estabilidade de MT, e desenvolvimento de drogas e outras terapêuticas que visam MTs.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ML TUBE CASE OF 500</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1A2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9028</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02442-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 kDa ultrafiltration spin column</td>
			<td>Aproscience</td>
			<td>PT-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-11B1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA prime plus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antipain</td>
			<td>Peptide Institute Inc.</td>
			<td>4062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aprotinin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>03346-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi-Lumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>07880-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>0.22&#181;m 33.2cm&#178; Nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIFP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>55-91-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIGITAL HOMOGENIZER</td>
			<td></td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>HOM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9026</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14128-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>37346-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W 3.3 Meter Roll</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17018-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td></td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17450-61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman</td>
			<td></td>
			<td>TOMY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9893-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Gauge Software&#160;</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoStar LD&#160;</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>292-69903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMX-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3408</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-4000 luminescent image analyzer</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leupeptin</td>
			<td>Peptide Institute Inc.</td>
			<td>43449-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>21003-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>32013-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31420-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>okadaic acid</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>O-2220&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTIMA MAX-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pepstatin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26436-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free)</td>
			<td></td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified tubulin&#160;</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSONICA Q55</td>
			<td>QSonica</td>
			<td>Q55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taxol</td>
			<td></td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>P-9600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-120.2 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-55 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLCK</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>34219-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative microtubule fractionation technique to separate stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin in mouse tissues

Microtúbulos, compostos por dímeros de α/β-tubulina, são um componente crucial do citoesqueleto em células eucarióticas. Esses polímeros semelhantes a tubos exibem instabilidade dinâmica à medida que subunidades heterodímeras de tubulina sofrem polimerização e despolimerização repetitivas. O controle preciso da estabilidade e dinâmica dos microtúbulos, obtido através de modificações pós-traducionais da tubulina e proteínas associadas aos microtúbulos, é essencial para várias funções celulares. Disfunções nos microtúbulos estão fortemente implicadas na patogênese, incluindo doenças neurodegenerativas. A pesquisa em andamento concentra-se em agentes terapêuticos direcionados a microtúbulos que modulam a estabilidade, oferecendo opções potenciais de tratamento para essas doenças e cânceres. Consequentemente, a compreensão do estado dinâmico dos microtúbulos é crucial para avaliar a progressão da doença e os efeitos terapêuticos.
Tradicionalmente, a dinâmica dos microtúbulos tem sido avaliada in vitro ou em células cultivadas através de fracionamento rugoso ou imunoensaio, usando anticorpos visando modificações pós-traducionais da tubulina. No entanto, a análise precisa do estado da tubulina em tecidos usando tais procedimentos impõe desafios. Neste estudo, desenvolvemos um método simples e inovador de fracionamento de microtúbulos para separar microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre em tecidos de camundongos.
O procedimento envolveu a homogeneização de tecidos dissecados de camundongos em tampão estabilizador de microtúbulos na proporção de volume de 19:1. Os homogeneizados foram então fracionados através de um processo de ultracentrifugação em duas etapas após centrifugação lenta inicial (2.400 × g) para remoção de debris. A primeira etapa de ultracentrifugação (100.000 × g) precipitou microtúbulos estáveis, enquanto o sobrenadante resultante foi submetido a uma segunda etapa de ultracentrifugação (500.000 × g) para fracionar microtúbulos lábeis e dímeros de tubulina solúveis. Este método determinou as proporções de tubulina constituindo microtúbulos estáveis ou lábeis no cérebro de camundongos. Adicionalmente, variações teciduais distintas na estabilidade dos microtúbulos foram observadas que se correlacionaram com a capacidade proliferativa das células constituintes. Esses achados destacam o potencial significativo deste novo método para analisar a estabilidade de microtúbulos em condições fisiológicas e patológicas.

Quantificação de tubulina nas frações P2, P3 e S3 do cérebro de camundongos pelo método de fracionamento de MT A tubulina em tecido de camundongo foi separada nas frações P2, P3 e S3 pelo método de fracionamento MT e quantificada por Western blotting (Figura 1A). O precipitado de MTs que permaneceram na fração P2 por ultracentrifugação a 100.000 × g por 20 min representou 34,86% ± 1,68% da tubulina total em cérebro de camundongo. O sobrenadante (S...

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Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues

Os microtúbulos, que são polímeros da tubulina, desempenham um papel crucial como componente do citoesqueleto em células eucarióticas e são conhecidos por sua instabilidade dinâmica. Este estudo desenvolveu um método de fracionamento de microtúbulos para separá-los em microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre para avaliar a estabilidade de microtúbulos em vários tecidos de camundongos.

Técnica quantitativa de fracionamento de microtúbulos para separar microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre em tecidos de camundongos

Microtubules, composed of &#945;/&#946;-tubulin dimers, are a crucial component of the cytoskeleton in eukaryotic cells. These tube-like polymers exhibit ...

Nosso novo protocolo ajuda a distinguir e quantificar três status de anéis de tubo, como microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e túbulos livres em tecidos animais. Esta técnica é composta por etapas simples e pode avaliar a estabilidade estrutural da tubulação, que não pode ser detectada pela quantificação da tubulação pós-modificação translacional. Este método é essencial para a pesquisa e desenvolvimento de formas terapêuticas para doenças onde a estabilidade dos microtúbulos é crítica, como a doença de Alzheimer e cânceres.Inicie o procedimento preparando o desgaste de laboratório para a dissecção do tecido. Encha uma caixa com gelo picado e coloque duas placas de Petri sobre ela. Encha um prato com solução tampão fosfato gelada ou PBS para lavagem transitória e armazenamento dos tecidos dissecados.Coloque papel filtro umedecido com PBS no segundo prato. Em seguida, pesar os microtubos de 1,5 mililitro preenchidos com PBS para armazenamento do tecido dissecado. Depois de extrair os tecidos de um camundongo eutanasiado, transfira-os para os tubos e pese novamente cada microtubo.Mover os tecidos para um homogeneizador de vidro com tampão estabilizador de microtúbulos gelado ou meio MSB+, e homogeneizar o tecido imediatamente usando um homogeneizador refrigerado. Agora transfira o homogeneizado de tecido para um microtubo de dois mililitros usando uma pipeta de Pasteur e centrífuga a 2.400 G por três minutos a dois graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um novo microtubo de 1,5 mililitro para remover os detritos.Vórtice o sobrenadante ou a fração S1 em um novo microtubo de 1,5 mililitro. Pipetar imediatamente 200 microlitros da fração S1 em um microtubo de centrifugação e centrifugar a 100.000 G usando um rotor TLA-55 por 20 minutos a dois graus Celsius. Após a segunda centrifugação, separar o sobrenadante S2 do precipitado P2.Transfira imediatamente toda a quantidade da fração S2 para um microtubo de centrifugação e use um rotor TLA-120.2 para girá-lo a 500.000 G por 60 minutos a dois graus Celsius. Após a terceira centrifugação, separar o sobrenadante S3 do precipitado P3. Dissolva toda a fração S3 em 200 microlitros de dodecil sulfato de sódio 2X, ou tampão de amostra SDS.Misture as frações S1 restantes com um volume igual de buffer de amostra SDS 2X para uso como uma curva padrão para western blotting. Em seguida, adicione 400 microlitros de tampão de amostra SDS aos tubos de fração P2 e P3. Em seguida, sonice brevemente a solução para dissolver o precipitado antes de transferir as amostras para novos microtubos de 1,5 mililitro e colocá-los na caixa de gelo.Ferva todas as amostras a 100 graus Celsius por três minutos. Os microtúbulos da fração P2 representaram 34,86% da alfa-tubulina total em cérebro de camundongo, enquanto os das frações P3 e S3 representaram 56,13% e 9,01%, respectivamente. A porcentagem de tubulina beta-3 nas frações P2, P3 e S3 não foi significativamente diferente da alfa-tubulina.A fração S2 mostrou passagem limitada de tubulina através de uma coluna de spin de ultrafiltração de 300 quilodaltons, enquanto a fração S3 permitiu a passagem completa de complexos tubulinos. A separação cromatográfica resultou em uma eluição de 100 quilodalton da tubulina S3. Proporções iguais de alfa e beta-tubulina foram recuperadas em cada fração.As frações P2 foram significativamente enriquecidas com alfa-tubulina acetilada, enquanto a alfa-tubulina tirosinada foi dominante na fração P3. O congelamento do cérebro antes da homogeneização resultou na diminuição da concentração de alfa-tubulina nas frações P2. Entretanto, a alfa-tubulina aumentou na fração P3.O congelamento também diminuiu os níveis de acetilação e aumentou os níveis de tirosinação de alfa-tubulina na fração P2. O tratamento com nocodazol diminuiu a alfa-tubulina na fração P2. Ao contrário do congelamento, o nocodazol não afetou as modificações pós-traducionais da tubulina P2.O tecido cerebral exibiu uma concentração significativamente maior de tubulinas P2, enquanto as tubulinas P3 estavam concentradas no tecido proliferativo. O Western blotting mostrou que a tubulina P2 especificamente encontrada no sistema nervoso originou-se de microtúbulos estáveis, e a tubulina P3 originou-se de microtúbulos lábeis. A estabilidade dos microtúbulos é altamente dinâmica.É importante completar este protocolo rapidamente, sem interrupções, no ambiente de temperatura fria. Certifique-se também de que os tecidos e fracções não foram congelados até serem dissolvidos em tampão de amostra SDS. Espera-se que a combinação da apresentação imune usando cada fração com proteômica identifique fatores envolvidos na dinâmica dos microtúbulos.Usando este método, revelamos como a tau normal existe nos microtúbulos. Ele também pode ser usado para estudar como se torna anormal em cérebros envelhecidos, a fim de identificar novos alvos de drogas de demência.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolamento de Proteínas de Filamento Intermediário a partir de Tecidos Múltiplos de Rato para Estudar Modificações Pós-Translacionais associadas ao Envelhecimento

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Bioquímica

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Método quantitativo e qualitativo para esfingomielina por LC-MS usando dois estável desvendar rotulado esfingomielina espécies

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipulando células vivas para construir estável montagem celular 3D sem andaime Artificial

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Espectrometria de massa folha Spray: Uma técnica de ionização ambiente rápida para avaliar diretamente a metabolitos de tecidos vegetais

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robusta comparação dos níveis de proteína através de tecidos e durante todo o desenvolvimento usando mancha ocidental quantitativa padronizada

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Medindo interações entre sondas fluorescentes e lignina em seções de plantas por sFLIM Com base na autofluorescência nativa

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Visualização Simultânea da Dinâmica dos Microtúbulos Cruzados e Únicos In Vitro pela Microscopia TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Reflexão de Interferência Simultânea e Microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total para Microtúbulos Dinâmicos de Imagem e Proteínas Associadas

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

Auto-montagem de Tactóides microtúbulos

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

A Técnica Peel-Blot: Um Método de Preparação de Amostras Crio-EM para Separar Camadas Individuais de Amostras Biológicas Multicamadas ou Concentradas

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...