Name: quantitative microtubule fractionation technique to separate stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin in mouse tissues
Uploaded: 2023-11-17T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана JST, учреждением университетских стипендий для создания научно-технических инноваций (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), Grant-in-Aid для стипендиатов JSPS (A.HT.; 23KJ2078), грант для научных исследований (B) JSPS KAKENHI (22H02946 для TM), грант для научных исследований в инновационных областях под названием «Старение белка мозга и контроль деменции» от MEXT (TM; 26117004) и исследовательская стипендия Уэхара от Мемориального фонда Уэхара (TM; 202020027). Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

1. Метод фракционирования МТ
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты, проведенные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по этике животных Университета Досися. Здесь использовали мышей C57BL/6J обоего пола в возрасте 3-4 месяцев. В этом протоколе препарированные ткани, нап...

<ol>
	<li>Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+code+and+its+role+in+controlling+microtubule+properties+and+functions.">The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).</li><li>Conde, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly,+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites.">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubule+ends+are+required+for+growth+cone+turning+to+avoid+an+inhibitory+guidance+cue.">Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue.</a> Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).</li><li>Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+neuronal+microtubule+cytoskeleton.">Building the neuronal microtubule cytoskeleton.</a> Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).</li><li>Leo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+fidgetin+restrains+axonal+growth+by+severing+labile+domains+of+microtubules.">Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules.</a> Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).</li><li>Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+code:+molecular+components,+readout+mechanisms,+and+functions.">The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions.</a> Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).</li><li>Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+post-translational+modifications+and+microtubule+dynamics.">Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).</li><li>Baas, P. W., Black, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+microtubules+in+the+axon+consist+of+domains+that+differ+in+both+composition+and+stability.">Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability.</a> Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).</li><li>Cartelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+alterations+occur+early+in+experimental+parkinsonism+and+the+microtubule+stabilizer+epothilone+D+is+neuroprotective.">Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective.</a> Scientific Reports. 3, 1837 (2013).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-binding+drugs+offset+tau+sequestration+by+stabilizing+microtubules+and+reversing+fast+axonal+transport+deficits+in+a+tauopathy+model.">Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+alpha-tubulin+in+Alzheimer+disease.">Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease.</a> Translational Neurodegeneration. 4, 9 (2015).</li><li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+improves+tau-induced+neuronal+dysfunction+of+nematodes.">Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes.</a> Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).</li><li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microtubule+assembly+competent+tubulin+synthesis+leads+to+accumulation+of+phosphorylated+tau+in+neuronal+cell+bodies.">Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).</li><li>Vielkind, U., Swierenga, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+fixation+procedure+for+immunofluorescent+detection+of+different+cytoskeletal+components+within+the+same+cell.">A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell.</a> Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).</li><li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+tau+isoforms+and+microtubule+bundle+formation+in+fibroblasts+transfected+with+a+single+tau+cDNA.">Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA.</a> Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).</li><li>Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+microtubules+of+the+axon:+quantitative+analysis+of+tyrosinated+and+acetylated+tubulin+along+individual+axonal+microtubules.">Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules.</a> Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).</li><li>Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+is+enriched+on+dynamic+microtubules+in+the+distal+region+of+growing+axons.">Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons.</a> Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).</li><li>Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+tubulin+synthesis+in+hepatocytes+and+fibroblasts.">Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts.</a> Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).</li><li>Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+destruction+of+stable+microtubules+and+axons+by+inhibitors+of+protein+serine/threonine+phosphatases+in+cultured+human+neurons.">Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons.</a> Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).</li><li>Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+destruction+induces+tau+liberation+and+its+subsequent+phosphorylation.">Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation.</a> FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).</li><li>Hagita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fractionation+of+tissue+microtubules+with+distinct+biochemical+properties+reflecting+their+stability+and+lability.">Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).</li><li>Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+tubulins+are+not+alike:+Heterodimer+dissociation+differs+among+different+biological+sources.">All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).</li><li>Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taxol-dependent+procedure+for+the+isolation+of+microtubules+and+microtubule-associated+proteins+(MAPs).">A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs).</a> Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).</li><li>Bartolo, M. E., Carter, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+microtubule+stabilization+on+the+freezing+tolerance+of+mesophyll+cells+of+spinach.">Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach.</a> Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).</li><li>Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPT+mutations,+tauopathy,+and+mechanisms+of+neurodegeneration.">MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).</li><li>Fourel, G., Boscheron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+mutations+in+neurodevelopmental+disorders+as+a+tool+to+decipher+microtubule+function.">Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function.</a> FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).</li><li>Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+in+Alzheimer's+presenile+dementia.">Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia.</a> The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).</li><li>Yoshida, H., Ihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+in+paired+helical+filaments+is+functionally+distinct+from+fetal+tau:+assembly+incompetence+of+paired+helical+filament-tau.">Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau.</a> Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).</li><li>Cash, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+reduction+in+Alzheimer's+disease+and+aging+is+independent+of+tau+filament+formation.">Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation.</a> The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).</li><li>Hempen, B., Brion, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+acetylated+alpha-tubulin+immunoreactivity+in+neurofibrillary+tangle-bearing+neurons+in+Alzheimer's+disease.">Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).</li><li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+expression+of+tau+and+tubulin+induces+neuronal+dysfunction+in+C.+elegans+models+of+tauopathy.">Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).</li><li>Boiarska, Z., Passarella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-targeting+agents+and+neurodegeneration.">Microtubule-targeting agents and neurodegeneration.</a> Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).</li></ol>

Важнейшей задачей при исследовании состояния тубулина в тканях живых организмов является предотвращение случайной МТ-полимеризации или деполимеризации в процессе препарирования. На стабильность МТ в образцах влияют такие факторы, как концентрация таксола в MSB, доля тканевого количе?...

Микротрубочки (МТ) представляют собой удлиненные трубчатые структуры, состоящие из протофиламентов, состоящих из α/β-тубулиновых гетеродимерных субъединиц. Они играют важную роль в различных клеточных процессах, таких как деление клеток, подвижность, поддержание формы и внутриклеточный транспорт, что делает их неотъемлемыми компонентами эукариотического цитоскелета. Минус-конец МТ, где экспонируется субъединица α-тубулина, относительно стабилен, тогда как плюс-конец, где экспонируется субъединица β-тубулина, подвергается динамической деполимеризации и полимеризации2. Этот непрерывный цикл присоединения и диссоциации димера тубулина на плюс-конце, называемый динамической нестабильностью, приводит к повторяющемуся процессу спасения икатастрофы. МТ демонстрируют фокальные домены с локализованными вариациями динамической неустойчивости, включая стабильные и лабильные домены4.
Точный контроль динамической нестабильности МТ имеет решающее значение для многих клеточных функций, особенно в нейронах, характеризующихся сложной морфологией. Адаптивность и долговечность МТ играют жизненно важную роль в развитии и правильном функционировании нервных клеток 5,6,7. Было обнаружено, что динамическая нестабильность МТ связана с различными посттрансляционными модификациями (ПТМ) тубулина, такими как ацетилирование, фосфорилирование, пальмитоилирование, детирозинирование, дельта2, окисление полиглутамина и полиглицилирование. Кроме того, связывание белков, ассоциированных с микротрубочками (MAP), служит регуляторным механизмом8. ПТМ, исключая ацетилирование, преимущественно встречаются в карбоксиконцевой области тубулина, расположенной на наружной поверхности МТ. Эти модификации создают разнообразные поверхностные условия на МТ, влияя на их взаимодействие с MAP и, в конечном счете, определяя устойчивость МТ9. Наличие карбокси-концевого остатка тирозина в α-тубулине свидетельствует о динамических МТ, которые быстро замещаются пулом свободного тубулина. И наоборот, детирозинация карбокси-конца и ацетилирование Lys40 означают стабильные МТ с пониженной динамической нестабильностью 9,10.
ПТМ тубулина широко использовались в экспериментах по оценке динамики и стабильности МТ 5,7,11,12,13,14,15. Например, в исследованиях клеточных культур тубулины могут быть разделены на два пула: пул свободного тубулина и пул МТ. Это достигается высвобождением свободного тубулина через пермеабилизацию клеток перед фиксацией оставшихся МТ 15,16,17,18,19. Биохимические методы включают использование химических стабилизаторов МТ, которые защищают МТ от катастрофы, позволяя отделять МТ и свободный тубулин путем центрифугирования20,21,22. Тем не менее, эти процедуры не различают стабильные и менее стабильные (лабильные) МТ, что делает невозможным количественное определение МТ или растворимого тубулина в тканях, таких как головной мозг. Следовательно, оценка стабильности МТ у организмов в физиологических и патологических условиях оказалась сложной задачей. Чтобы устранить это экспериментальное ограничение, мы разработали новый метод точного разделения МТ и свободного тубулина в тканях мыши23.
Этот уникальный метод фракционирования МТ включает в себя гомогенизацию тканей в условиях, поддерживающих статус тубулина в тканях, и двухступенчатое центрифугирование для разделения стабильных МТ, лабильных МТ и свободного тубулина. Эта простая процедура может быть применена к широким исследованиям, включая фундаментальные исследования МТ и МАП у живых организмов, физиологический и патологический анализ здоровья и заболеваний, связанных со стабильностью МТ, а также разработку лекарств и других терапевтических средств, нацеленных на МТ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ML TUBE CASE OF 500</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1A2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9028</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02442-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 kDa ultrafiltration spin column</td>
			<td>Aproscience</td>
			<td>PT-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-11B1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA prime plus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antipain</td>
			<td>Peptide Institute Inc.</td>
			<td>4062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aprotinin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>03346-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi-Lumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>07880-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>0.22&#181;m 33.2cm&#178; Nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIFP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>55-91-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIGITAL HOMOGENIZER</td>
			<td></td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>HOM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9026</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14128-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>37346-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W 3.3 Meter Roll</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17018-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td></td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17450-61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman</td>
			<td></td>
			<td>TOMY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9893-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Gauge Software&#160;</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoStar LD&#160;</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>292-69903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMX-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3408</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-4000 luminescent image analyzer</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leupeptin</td>
			<td>Peptide Institute Inc.</td>
			<td>43449-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>21003-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>32013-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31420-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>okadaic acid</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>O-2220&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTIMA MAX-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pepstatin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26436-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free)</td>
			<td></td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified tubulin&#160;</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSONICA Q55</td>
			<td>QSonica</td>
			<td>Q55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taxol</td>
			<td></td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>P-9600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-120.2 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-55 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLCK</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>34219-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative microtubule fractionation technique to separate stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin in mouse tissues

Микротрубочки, состоящие из димеров α/β-тубулина, являются важнейшим компонентом цитоскелета в эукариотических клетках. Эти трубчатые полимеры демонстрируют динамическую нестабильность, поскольку субъединицы гетеродимера тубулина подвергаются повторяющейся полимеризации и деполимеризации. Точный контроль стабильности и динамики микротрубочек, достигаемый с помощью посттрансляционных модификаций тубулина и белков, ассоциированных с микротрубочками, имеет важное значение для различных клеточных функций. Дисфункции микротрубочек тесно связаны с патогенезом, в том числе с нейродегенеративными расстройствами. Текущие исследования сосредоточены на терапевтических агентах, нацеленных на микротрубочки, которые модулируют стабильность, предлагая потенциальные варианты лечения этих заболеваний и рака. Следовательно, понимание динамического состояния микротрубочек имеет решающее значение для оценки прогрессирования заболевания и терапевтических эффектов.
Традиционно динамику микротрубочек оценивали in vitro или в культивируемых клетках с помощью грубого фракционирования или иммуноанализа с использованием антител, нацеленных на посттрансляционные модификации тубулина. Однако точный анализ статуса тубулина в тканях с помощью таких процедур представляет собой проблему. В этом исследовании мы разработали простой и инновационный метод фракционирования микротрубочек для разделения стабильных микротрубочек, лабильных микротрубочек и свободного тубулина в тканях мышей.
Процедура включала гомогенизацию рассеченных тканей мышей в буфере, стабилизирующем микротрубочки, в объемном соотношении 19:1. Затем гомогенаты были фракционированы с помощью двухступенчатого процесса ультрацентрифугирования после первоначального медленного центрифугирования (2400 × г) для удаления мусора. Первая стадия ультрацентрифугирования (100 000 × г) осаждала стабильные микротрубочки, в то время как полученная надосадочная жидкость подвергалась второй стадии ультрацентрифугирования (500 000 × г) для фракционирования лабильных микротрубочек и растворимых димеров тубулина. Этот метод определял пропорции тубулина, составляющего стабильные или лабильные микротрубочки в мозге мыши. Кроме того, наблюдались различные тканевые вариации стабильности микротрубочек, которые коррелировали с пролиферативной способностью составляющих клеток. Эти результаты подчеркивают значительный потенциал этого нового метода для анализа стабильности микротрубочек при физиологических и патологических состояниях.

Количественное определение тубулина во фракциях P2, P3 и S3 из головного мозга мышей методом МТ-фракционирования Тубулин в тканях мышей разделяли на фракции Р2, Р3 и S3 методом МТ-фракционирования и количественно определяли методом вестерн-блоттинга (рис. 1А). Осад?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues at JoVE.com

Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues

Микротрубочки, которые являются полимерами тубулина, играют решающую роль в качестве компонента цитоскелета в эукариотических клетках и известны своей динамической нестабильностью. В этом исследовании был разработан метод фракционирования микротрубочек для разделения их на стабильные микротрубочки, лабильные микротрубочки и свободный тубулин для оценки стабильности микротрубочек в различных тканях мышей.

Метод количественного фракционирования микротрубочек для разделения стабильных микротрубочек, лабильных микротрубочек и свободного тубулина в тканях мышей

Microtubules, composed of &#945;/&#946;-tubulin dimers, are a crucial component of the cytoskeleton in eukaryotic cells. These tube-like polymers exhibit ...

Наш новый протокол помогает различать и количественно оценивать три статуса трубчатых колец, таких как стабильные микротрубочки, лабильные микротрубочки и свободные канальцы в тканях животных. Этот метод состоит из простых шагов и позволяет оценить структурную стабильность трубок, которая не может быть обнаружена путем количественной оценки трубок после трансляционной модификации. Этот метод имеет важное значение для исследования и разработки терапевтических способов лечения заболеваний, где стабильность микротрубочек имеет решающее значение, таких как болезнь Альцгеймера и рак.Начните процедуру с подготовки лабораторного белья к рассечению тканей. Наполните коробку колотым льдом и поставьте на нее две чашки Петри. Наполните одну посуду ледяным раствором фосфатного буфера или ПБС для кратковременного мытья и хранения рассеченных тканей.На вторую посуду постелите фильтровальную бумагу, смоченную ПБС. Затем взвесьте 1,5-миллилитровые микропробирки, заполненные PBS, для хранения рассеченных тканей. После извлечения тканей из усыпленной мыши переложите их в пробирки и повторно взвесьте каждую микропробирку.Переместите ткани в стеклянный гомогенизатор с ледяным стабилизирующим буфером из микротрубочек или MSB + среда и немедленно гомогенизируйте ткань с помощью охлажденного гомогенизатора. Теперь переложите гомогенат ткани в двухмиллилитровую микропробирку с помощью пипетки Пастера и центрифуги при 2,400 G в течение трех минут при двух градусах Цельсия. Перелейте надосадочную жидкость в новую микропробирку объемом 1,5 миллилитра для удаления мусора.Вбейте надосадочную жидкость или фракцию S1 в новую микропробирку объемом 1,5 миллилитра. Сразу же пипетку 200 микролитров фракции S1 переложить в центрифугаторную микропробирку и центрифугировать при 100 000 G с помощью ротора TLA-55 в течение 20 минут при температуре два градуса Цельсия. После второго центрифугирования отделите надосадочную жидкость S2 от осадка P2.Сразу же переложите все количество фракции S2 в центрифугируемую микропробирку и с помощью ротора TLA-120.2 открутите ее при 500 000 G в течение 60 минут при температуре два градуса Цельсия. После третьего центрифугирования отделите надосадочную жидкость S3 от осадка P3. Растворите всю фракцию S3 в 200 микролитрах 2X додецилсульфата натрия или буфера для образцов SDS.Смешайте оставшиеся фракции S1 с равным объемом 2X буфера для образцов SDS для использования в качестве стандартной кривой для вестерн-блоттинга. Затем добавьте 400 микролитров буфера для образцов SDS в пробирки с фракциями P2 и P3. Затем кратковременно обработайте раствор ультразвуком, чтобы растворить осадок, прежде чем переложить образцы в новые 1,5-миллилитровые микропробирки и поместить их в холодильник.Прокипятите все образцы при температуре 100 градусов Цельсия в течение трех минут. Микротрубочки во фракции P2 составляли 34,86% от общего количества альфа-тубулина в мозге мыши, в то время как микротрубочки во фракциях P3 и S3 составляли 56,13% и 9,01% соответственно. Процентное содержание бета-3 тубулина во фракциях Р2, Р3 и С3 достоверно не отличалось от содержания альфа-тубулина.Фракция S2 показала ограниченное прохождение тубулина через ультрафильтрационную спиновую колонку мощностью 300 килодальтон, в то время как фракция S3 позволила полностью пройти тубулиновые комплексы. Хроматографическое разделение привело к 100-килодальтонному элюированию тубулина S3. В каждой фракции были обнаружены равные пропорции альфа- и бета-тубулина.Фракции Р2 были значительно обогащены ацетилированным альфа-тубулином, в то время как тирозинированный альфа-тубулин доминировал во фракции Р3. Замораживание мозга перед гомогенизацией приводило к снижению концентрации альфа-тубулина во фракциях Р2. Однако альфа-тубулин увеличился во фракции Р3.Замораживание также снижало уровень ацетилирования и повышало уровень тирозинизации альфа-тубулина во фракции Р2. Лечение нокодазолом снижало уровень альфа-тубулина во фракции Р2. В отличие от замораживания, нокодазол не влиял на посттрансляционные модификации Р2-тубулина.В ткани головного мозга наблюдалась значительно более высокая концентрация Р2-тубулинов, тогда как Р3-тубулины были сконцентрированы в пролиферативной ткани. Вестерн-блоттинг показал, что Р2-тубулин, специфически обнаруженный в нервной системе, происходит из стабильных микротрубочек, а Р3-тубулин происходит из лабильных микротрубочек. Стабильность микротрубочек очень динамична.Важно выполнить этот протокол быстро, без перерывов, в условиях низких температур. Также убедитесь, что ткани и фракции не были заморожены до растворения в буфере для образцов SDS. Ожидается, что сочетание иммунной презентации с использованием каждой фракции с протеомикой позволит выявить факторы, участвующие в динамике микротрубочек.С помощью этого метода мы выявили, как нормальный тау существует на микротрубочках. Он также может быть использован для изучения того, как он становится ненормальным в старом мозге, чтобы идентифицировать новые лекарственные мишени деменции.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Выделение промежуточных белков-нитей из множественных мышечных тканей для изучения связанных со старением пост-трансляционных модификаций

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Количественные и качественные метод сфингомиелин, LC-MS, с использованием двух стабильных гетерогенны помечены виды сфингомиелин

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Манипулируя живых клеток для построения стабильной 3D сотовой Ассамблеи без искусственных лесов

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Масс-спектрометрия спрей лист: Быстрое окружающего ионизации техника непосредственно оценить метаболитов из растительных тканей

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Надежные сравнение уровня белка через ткани и на протяжении развития с использованием стандартизированных количественных западный Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Измерение взаимодействия между флуоресцентными зондами и лигнином в секциях растений sFLIM на основе автофлюоресценции коренных народов

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Одновременная визуализация динамики сшитых и одиночных микротрубочек in vitro методом TIRF-микроскопии

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Одновременное интерференционное отражение и флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения для визуализации динамических микротрубочек и связанных с ними белков

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

Самостоятельная сборка тактоидов микротрубочек

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Метод пилинга:метод крио-ЭМ-пробоподготовки для отделения отдельных слоев от многослойных или концентрированных биологических образцов

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...