Name: quantitative microtubule fractionation technique to separate stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin in mouse tissues
Uploaded: 2023-11-17T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado en parte por JST, el establecimiento de becas universitarias para la creación de innovación científica y tecnológica (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), una subvención para becarios de JSPS (A.HT.; 23KJ2078), una subvención para la investigación científica (B) JSPS KAKENHI (22H02946 para TM), una subvención para la investigación científica en áreas innovadoras titulada "Envejecimiento de las proteínas cerebrales y control de la demencia" del MEXT (TM; 26117004), y por la beca de investigación Uehara de la Fundación Uehara Memorial (TM; 202020027). Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

1. Método de fraccionamiento MT
NOTA: Todos los experimentos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Doshisha. Aquí se utilizaron ratones C57BL/6J de ambos sexos, de 3 a 4 meses de edad. En este protocolo, los tejidos disecados, por ejemplo, el cerebro, el hígado o el timo, se homogeneizaron inmediatamente en un tampón estabilizador de microtúbulos (MSB) helado, que contenía Taxol (estabilizador de MT) a una concentr...

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	<li>Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+code+and+its+role+in+controlling+microtubule+properties+and+functions.">The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).</li><li>Conde, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly,+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites.">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+properties+of+neuronal+microtubules.">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li><li>Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubule+ends+are+required+for+growth+cone+turning+to+avoid+an+inhibitory+guidance+cue.">Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue.</a> Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).</li><li>Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+neuronal+microtubule+cytoskeleton.">Building the neuronal microtubule cytoskeleton.</a> Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).</li><li>Leo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+fidgetin+restrains+axonal+growth+by+severing+labile+domains+of+microtubules.">Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules.</a> Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).</li><li>Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+code:+molecular+components,+readout+mechanisms,+and+functions.">The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions.</a> Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).</li><li>Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+post-translational+modifications+and+microtubule+dynamics.">Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).</li><li>Baas, P. W., Black, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+microtubules+in+the+axon+consist+of+domains+that+differ+in+both+composition+and+stability.">Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability.</a> Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).</li><li>Cartelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+alterations+occur+early+in+experimental+parkinsonism+and+the+microtubule+stabilizer+epothilone+D+is+neuroprotective.">Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective.</a> Scientific Reports. 3, 1837 (2013).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-binding+drugs+offset+tau+sequestration+by+stabilizing+microtubules+and+reversing+fast+axonal+transport+deficits+in+a+tauopathy+model.">Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+alpha-tubulin+in+Alzheimer+disease.">Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease.</a> Translational Neurodegeneration. 4, 9 (2015).</li><li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+improves+tau-induced+neuronal+dysfunction+of+nematodes.">Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes.</a> Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).</li><li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microtubule+assembly+competent+tubulin+synthesis+leads+to+accumulation+of+phosphorylated+tau+in+neuronal+cell+bodies.">Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).</li><li>Vielkind, U., Swierenga, S. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+tubulin+synthesis+in+hepatocytes+and+fibroblasts.">Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts.</a> Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).</li><li>Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+destruction+of+stable+microtubules+and+axons+by+inhibitors+of+protein+serine/threonine+phosphatases+in+cultured+human+neurons.">Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons.</a> Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).</li><li>Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+destruction+induces+tau+liberation+and+its+subsequent+phosphorylation.">Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation.</a> FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).</li><li>Hagita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fractionation+of+tissue+microtubules+with+distinct+biochemical+properties+reflecting+their+stability+and+lability.">Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).</li><li>Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+microtubule+stabilization+on+the+freezing+tolerance+of+mesophyll+cells+of+spinach.">Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach.</a> Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).</li><li>Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+acetylated+alpha-tubulin+immunoreactivity+in+neurofibrillary+tangle-bearing+neurons+in+Alzheimer's+disease.">Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).</li><li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalanced+expression+of+tau+and+tubulin+induces+neuronal+dysfunction+in+C.+elegans+models+of+tauopathy.">Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).</li><li>Boiarska, Z., Passarella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-targeting+agents+and+neurodegeneration.">Microtubule-targeting agents and neurodegeneration.</a> Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).</li></ol>

La tarea más importante cuando se investiga el estado de la tubulina en el tejido de los organismos vivos es prevenir la polimerización o despolimerización accidental de la MT durante la preparación. La estabilidad de los MT en las muestras se ve afectada por factores como la concentración de Taxol en MSB, la proporción de cantidad de tejido a tampón y la temperatura durante el proceso desde la extracción del tejido hasta la homogeneización y centrifugación. Por lo tanto, se optimizaron las condiciones en cada ...

Los microtúbulos (MT) son estructuras tubulares alargadas que comprenden protofilamentos formados por subunidades heterodímeras de α/β-tubulina. Desempeñan un papel esencial en diversos procesos celulares, como la división celular, la motilidad, el mantenimiento de la forma y el transporte intracelular, lo que los convierte en componentes integrales del citoesqueleto eucariota. El extremo negativo de las MT, donde la subunidad de α-tubulina está expuesta, es relativamente estable, mientras que el extremo positivo, donde la subunidad de β-tubulina está expuesta, sufre despolimerización dinámica y polimerización2. Este ciclo continuo de adición y disociación de dímeros de tubulina en el extremo positivo, denominado inestabilidad dinámica, da lugar a un proceso repetitivo de rescate y catástrofe3. Los MT exhiben dominios focales con variaciones localizadas en la inestabilidad dinámica, incluyendo dominios estables y lábiles4.
El control preciso de la inestabilidad dinámica de las MT es crucial para numerosas funciones celulares, particularmente en neuronas caracterizadas por morfologías intrincadas. La adaptabilidad y durabilidad de las MT juegan un papel vital en el desarrollo y buen funcionamiento de las células nerviosas 5,6,7. Se ha encontrado que la inestabilidad dinámica de los MT está asociada con varias modificaciones postraduccionales (PTM) de la tubulina, como acetilación, fosforilación, palmitoilación, destirosinación, delta 2, oxidación de poliglutamina y poliglicación. Además, la unión de proteínas asociadas a microtúbulos (MAP) sirve como mecanismo regulador8. Los PTM, excluyendo la acetilación, se producen predominantemente en la región carboxiterminal de la tubulina situada en la superficie externa de los MT. Estas modificaciones crean diversas condiciones superficiales en los MT, lo que influye en su interacción con los MAP y, en última instancia, gobierna la estabilidad del MT9. La presencia de un residuo de tirosina carboxiterminal en la α-tubulina es indicativa de MT dinámicos, que son rápidamente reemplazados por el pool de tubulina libre. Por el contrario, la destirosinación del extremo carboxilo y la acetilación de Lys40 significan MTs estables con inestabilidad dinámica reducida 9,10.
Los PTM de la tubulina se han empleado ampliamente en experimentos para evaluar la dinámica y la estabilidad de las MT 5,7,11,12,13,14,15. Por ejemplo, en los estudios de cultivos celulares, las tubulinas se pueden segregar en dos grupos: el grupo de tubulinas libres y el grupo MT. Esto se logra liberando tubulina libre a través de la permeabilización celular antes de fijar los MT restantes 15,16,17,18,19. Los métodos bioquímicos implican el uso de estabilizadores químicos de MT que protegen a las MT de catástrofes, permitiendo la separación de MTs y tubulina libre a través de la centrifugación20,21,22. Sin embargo, estos procedimientos no diferencian entre MT estables y menos estables (lábiles), lo que hace imposible cuantificar MT o tubulina soluble en tejidos como el cerebro. En consecuencia, la evaluación de la estabilidad de la MT en organismos en condiciones fisiológicas y patológicas ha demostrado ser un desafío. Para abordar esta limitación experimental, hemos desarrollado una técnica novedosa para separar con precisión las MT y la tubulina libre en tejido de ratón23.
Este método único de fraccionamiento de MT implica la homogeneización de los tejidos en condiciones que mantienen el estado de la tubulina en los tejidos y la centrifugación en dos pasos para separar las MT estables, las MT lábiles y la tubulina libre. Este sencillo procedimiento puede aplicarse a estudios amplios, como la investigación básica sobre las MT y las MAP en organismos vivos, los análisis fisiológicos y patológicos de la salud y las enfermedades asociadas a la estabilidad de la MT, y el desarrollo de fármacos y otras terapias dirigidas a las MT.

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		<tr>
			<td>1.5 ML TUBE CASE OF 500</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1A2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9028</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02442-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 kDa ultrafiltration spin column</td>
			<td>Aproscience</td>
			<td>PT-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-11B1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA prime plus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antipain</td>
			<td>Peptide Institute Inc.</td>
			<td>4062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aprotinin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>03346-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi-Lumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>07880-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>0.22&#181;m 33.2cm&#178; Nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIFP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>55-91-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIGITAL HOMOGENIZER</td>
			<td></td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>HOM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9026</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14128-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>37346-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W 3.3 Meter Roll</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17018-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td></td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17450-61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman</td>
			<td></td>
			<td>TOMY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9893-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Gauge Software&#160;</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoStar LD&#160;</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>292-69903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMX-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3408</td>
			<td>1:5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-4000 luminescent image analyzer</td>
			<td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leupeptin</td>
			<td>Peptide Institute Inc.</td>
			<td>43449-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>21003-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>32013-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31420-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>okadaic acid</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>O-2220&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTIMA MAX-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pepstatin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26436-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free)</td>
			<td></td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified tubulin&#160;</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSONICA Q55</td>
			<td>QSonica</td>
			<td>Q55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taxol</td>
			<td></td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>P-9600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-120.2 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-55 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLCK</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>34219-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12967-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative microtubule fractionation technique to separate stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin in mouse tissues

Los microtúbulos, compuestos por dímeros de α/β-tubulina, son un componente crucial del citoesqueleto de las células eucariotas. Estos polímeros en forma de tubo exhiben inestabilidad dinámica a medida que las subunidades de heterodímero de tubulina se someten a polimerización y despolimerización repetitivas. El control preciso de la estabilidad y la dinámica de los microtúbulos, logrado a través de las modificaciones postraduccionales de la tubulina y las proteínas asociadas a los microtúbulos, es esencial para diversas funciones celulares. Las disfunciones en los microtúbulos están fuertemente implicadas en la patogénesis, incluidos los trastornos neurodegenerativos. La investigación en curso se centra en agentes terapéuticos dirigidos a los microtúbulos que modulan la estabilidad, ofreciendo posibles opciones de tratamiento para estas enfermedades y cánceres. En consecuencia, comprender el estado dinámico de los microtúbulos es crucial para evaluar la progresión de la enfermedad y los efectos terapéuticos.
Tradicionalmente, la dinámica de los microtúbulos se ha evaluado in vitro o en células cultivadas mediante fraccionamiento aproximado o inmunoensayo, utilizando anticuerpos dirigidos a modificaciones postraduccionales de la tubulina. Sin embargo, el análisis preciso del estado de la tubulina en los tejidos mediante estos procedimientos plantea desafíos. En este estudio, desarrollamos un método simple e innovador de fraccionamiento de microtúbulos para separar microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre en tejidos de ratón.
El procedimiento consistió en homogeneizar tejidos de ratón disecados en un tampón estabilizador de microtúbulos en una proporción de volumen de 19:1. A continuación, los homogeneizados se fraccionaron mediante un proceso de ultracentrifugación de dos pasos tras una centrifugación lenta inicial (2.400 × g) para eliminar los residuos. La primera etapa de ultracentrifugación (100.000 × g) precipitó microtúbulos estables, mientras que el sobrenadante resultante se sometió a una segunda etapa de ultracentrifugación (500.000 × g) para fraccionar los microtúbulos lábiles y los dímeros de tubulina soluble. Este método determinó las proporciones de tubulina que constituyen microtúbulos estables o lábiles en el cerebro del ratón. Además, se observaron distintas variaciones tisulares en la estabilidad de los microtúbulos que se correlacionaron con la capacidad proliferativa de las células constituyentes. Estos hallazgos ponen de relieve el importante potencial de este novedoso método para analizar la estabilidad de los microtúbulos en condiciones fisiológicas y patológicas.

Cuantificación de tubulina en las fracciones P2, P3 y S3 del cerebro de ratón mediante el método de fraccionamiento MT La tubulina en el tejido de ratón se separó en las fracciones P2, P3 y S3 mediante el método de fraccionamiento MT y se cuantificó mediante Western blot (Figura 1A). El precipitado de MTs que permaneció en la fracción P2 por ultracentrifugación a 100.000 × g durante 20 min representó el 34,86% ± el 1,68% de la tubulina total en el ce...

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Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues

Los microtúbulos, que son polímeros de tubulina, desempeñan un papel crucial como componente del citoesqueleto en las células eucariotas y son conocidos por su inestabilidad dinámica. Este estudio desarrolló un método para fraccionar microtúbulos para separarlos en microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre para evaluar la estabilidad de los microtúbulos en varios tejidos de ratón.

Técnica de fraccionamiento cuantitativo de microtúbulos para separar microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre en tejidos de ratón

Microtubules, composed of &#945;/&#946;-tubulin dimers, are a crucial component of the cytoskeleton in eukaryotic cells. These tube-like polymers exhibit ...

Nuestro nuevo protocolo ayuda a distinguir y cuantificar tres estados de los anillos tubulares, como los microtúbulos estables, los microtúbulos lábiles y los túbulos libres en tejidos animales. Esta técnica se compone de pasos simples y puede evaluar la estabilidad estructural de la tubería, que no se puede detectar mediante la cuantificación de la modificación traslacional posterior a la tubería. Este método es esencial para la investigación y el desarrollo de vías terapéuticas para enfermedades en las que la estabilidad de los microtúbulos es crítica, como la enfermedad de Alzheimer y los cánceres.Comience el procedimiento preparando la ropa de laboratorio para la disección de tejidos. Llene una caja con hielo picado y coloque dos placas de Petri sobre ella. Llene un plato con una solución tampón de fosfato helada o PBS para el lavado y almacenamiento transitorio de los tejidos disecados.Coloque papel de filtro humedecido con PBS en el segundo plato. A continuación, pesa los microtubos de 1,5 mililitros llenos de PBS para almacenar el tejido diseccionado. Después de extraer los tejidos de un ratón sacrificado, transfiéralos a los tubos y vuelva a pesar cada microtubo.Mueva los tejidos a un homogeneizador de vidrio con tampón estabilizador de microtúbulos helado o MSB + medio, y homogeneice el tejido inmediatamente con un homogeneizador refrigerado. Ahora transfiera el homogeneizado de tejido a un microtubo de dos mililitros utilizando una pipeta Pasteur y centrifugue a 2.400 G durante tres minutos a dos grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un nuevo microtubo de 1,5 mililitros para eliminar los residuos.Vértice el sobrenadante o la fracción S1 en un nuevo microtubo de 1,5 mililitros. Pipetear inmediatamente 200 microlitros de la fracción S1 en un microtubo de centrifugación y centrifugar a 100.000 G utilizando un rotor TLA-55 durante 20 minutos a dos grados centígrados. Después de la segunda centrifugación, separe el sobrenadante S2 del precipitado P2.Transfiera inmediatamente toda la cantidad de la fracción S2 a un microtubo de centrifugación y use un rotor TLA-120.2 para hacerla girar a 500, 000 G durante 60 minutos a dos grados Celsius. Después de la tercera centrifugación, separe el sobrenadante S3 del precipitado P3. Disuelva toda la fracción S3 en 200 microlitros de dodecil sulfato de sodio 2X o tampón de muestra SDS.Mezcle las fracciones S1 restantes con un volumen igual de tampón de muestra SDS 2X para usarlo como una curva estándar para Western blot. A continuación, agregue 400 microlitros de tampón de muestra SDS a los tubos de fracción P2 y P3. A continuación, sonicar brevemente la solución para disolver el precipitado antes de transferir las muestras a nuevos microtubos de 1,5 mililitros y colocarlas en la nevera.Hervir todas las muestras a 100 grados centígrados durante tres minutos. Los microtúbulos de la fracción P2 representaron el 34,86% del total de alfa-tubulina en el cerebro de un ratón, mientras que los de las fracciones P3 y S3 representaron el 56,13% y el 9,01% respectivamente. El porcentaje de tubulina beta-3 en las fracciones P2, P3 y S3 no fue significativamente diferente de los de la tubulina alfa.La fracción S2 mostró un paso limitado de tubulina a través de una columna de espín de ultrafiltración de 300 kilodalton, mientras que la fracción S3 permitió el paso completo de complejos de tubulina. La separación cromatográfica dio como resultado una elución de 100 kilodalton de tubulina S3. Se recuperaron proporciones iguales de alfa y beta-tubulina en cada fracción.Las fracciones P2 se enriquecieron significativamente con alfa-tubulina acetilada, mientras que la alfa-tubulina tirosinada fue dominante en la fracción P3. La congelación del cerebro antes de la homogeneización dio lugar a una disminución de la concentración de alfa-tubulina en las fracciones P2. Sin embargo, la alfa-tubulina aumentó en la fracción P3.La congelación también disminuyó los niveles de acetilación y aumentó los niveles de tirosinación de la alfa-tubulina en la fracción P2. El tratamiento con nocodazol disminuyó la alfa-tubulina en la fracción P2. A diferencia de la congelación, el nocodazol no afectó a las modificaciones postraduccionales de la tubulina P2.El tejido cerebral exhibió una concentración significativamente mayor de tubulinas P2, mientras que las tubulinas P3 se concentraron en el tejido proliferativo. La Western blot mostró que la tubulina P2 que se encuentra específicamente en el sistema nervioso se originó a partir de microtúbulos estables, y la tubulina P3 se originó a partir de microtúbulos lábiles. La estabilidad de los microtúbulos es muy dinámica.Es importante completar este protocolo rápidamente, sin interrupciones, en el ambiente de temperatura fría. Asegúrese también de que los tejidos y las fracciones no se hayan congelado hasta que se disuelvan en el tampón de muestra SDS. Se espera que la combinación de la presentación inmune utilizando cada fracción con la proteómica identifique los factores involucrados en la dinámica de los microtúbulos.Usando este método, revelamos cómo existe tau normal en los microtúbulos. También se puede utilizar para estudiar cómo se vuelve anormal en cerebros envejecidos con el fin de identificar nuevas dianas farmacológicas de la demencia.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Aislamiento de proteínas de filamento intermedio de múltiples tejidos de ratón para estudiar las modificaciones postraduccionales asociadas al envejecimiento

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Investigación

Bioquímica

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Método cuantitativo y cualitativo de la esfingomielina por LC-MS con dos estable isotópicamente etiquetada especies de esfingomielina

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipulación de células vivas para construir estable montaje celular 3D sin andamio Artificial

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Espectrometría de masa de hoja aerosol: Una técnica rápida ionización ambiental evaluar directamente los metabolitos de los tejidos vegetales

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robusta comparación de niveles de proteína en los tejidos y a lo largo de desarrollo estandarizados cuantitativos Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Medición de interacciones entre sondas fluorescentes y lignina en secciones de plantas por sFLIM basado en autofluorescencia nativa

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Visualización simultánea de la dinámica de microtúbulos reticulados y únicos in vitro mediante microscopía TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Reflexión de interferencia simultánea y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

Autoensamblaje de tactoides de microtúbulos

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

La técnica Peel-Blot: Un método de preparación de muestras crio-EM para separar capas individuales de muestras biológicas de múltiples capas o concentradas

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...