Studera membranproteinhandel i Drosophila fotoreceptorceller med eGFP-märkta proteiner

GFP-märkta fotoreceptorproteiner, som jonkanalen TRPL GFP, tillåter oss att studera proteintransport i neuroner med hjälp av icke-invasiva tekniker. Denna metod kan också användas för att övervaka fotoreceptordegenerering. Således kan den molekylära grunden för ärftliga sjukdomar som resulterar i blindhet hos människor studeras i Drosophila-ögat.

Cellulär lokalisering av GFP-märkta proteiner kan bedömas genom att observera fluorescensen i den djupa pseudopupilen eller genom vattennedsänkningsmikroskopi. Båda metoderna möjliggör snabb bestämning av lokaliseringen av visuella proteiner och observation av strukturella defekter hos rabdomerer på grund av degenerering av fotoreceptorceller. För att få högkvalitativa bilder är den viktigaste aspekten flugögats orientering.

När man utför denna teknik bör man fokusera på ommatidia som ligger något mot ögats periferi. Jag kommer att demonstrera proceduren för DPP-avbildning, medan de två teknikerna med vattennedsänkningsmikroskopi kommer att demonstreras av min kollega, Dr.Krystina Wagner, och Matthias Zeger, doktorand i vår grupp. För att börja djup pseudopupil, eller DPP, avbildning, bedöva en till tre dagar gamla flugor och placera en av dem i mitten av mikroskopmålet på dess sida så att antingen vänster eller höger öga vetter mot målet exakt radiellt.

Öka förstoringen så att den passar hela ögat och centrera ögats centrala ommatidier. Om möjligt, minska mikroskopets skärpedjup genom att justera dubbelirismembranet till en grund inställning. Slå sedan på mikroskopet UV-lampan med maximal intensitet.

Välj sedan mikroskopets fluorescensfilteruppsättning enligt fluorescensproteinet uttryckt i ögonen och ställ in ljusvägen mot den mikroskopmonterade kameran. Med hjälp av live-bildfunktionen i programvaran justerar du bildens ljusstyrka till en inställning som endast upptäcker specifika signaler från ögat genom att höja exponeringstiden och öka värdet. Justera mikroskopfokuset i ögat för att generera den överlagrade bilden av DPP.

Ta sedan en ögonblicksbild av den fluorescerande DPP. För att förbereda en fluga i en dödlig variation, fäst en bit Plasticine på en föremålsglid och en annan bit i mitten av en petriskål. Fyll petriskålen med iskylt destillerat vatten och lite isflingor.

Lägg sedan en isbedövad fluga under ett stereomikroskop ovanpå den plasticinbelagda objektrutschbanan. Vrid flugan på ryggen och genomborra en insektsstift genom mitten av bröstkorgen. Fäst stiftet horisontellt på den plasticinbelagda föremålsbilden och orientera antingen vänster eller höger öga på flugan uppåt.

Fixera sedan försiktigt föremålsrutschkanan med sin Plasticine-fria sida vänd nedåt i petriskålen, vilket förhindrar rotation av flughuvudet. Se till att flugan är täckt med vatten. Alternativt, för att förbereda en fluga i en icke-dödlig variation, överför det isbedövade flughuvudet först till en 200 mikroliter pipettspets och tryck försiktigt flugan mot spetsen med tryckluft.

Skär sedan av pipettspetsen precis framför huvudet med en skalpell och tryck försiktigt in flugan några millimeter i pipettspetsen med en pincett. Klipp av pipettspetsen igen och tryck tillbaka flugan mot spetsen med tryckluften så att endast flugans huvud sticker ut från pipettspetsen. Efter att ha fäst en bit Plasticine på en föremålsglidning, tryck pipettspetsen in i den så att vänster eller höger öga vetter uppåt.

Se till att ögat är riktat korrekt under mikroskopet. För bildförvärv väljer du ett mål för vattennedsänkning. Vid en icke-dödlig variation, använd en laboratoriepipett för att fästa en stor droppe kylt vatten på undersidan av vattennedsänkningsmålet.

Placera försiktigt objektbilden med den förberedda flugan på mikroskopsteget. Sänk sedan vattennedsänkningsmålet manuellt tills det kommer i kontakt med vattenytan eller flugans öga berör droppen. Växla sedan ljusvägen mot mikroskopkameran och generera en levande bild.

Justera fokus för kameran och utvärdera ögats orientering, med tanke på att ögat måste möta mikroskopmålet radiellt. Använd programvaran för uppslagstabellen för att upptäcka övermättnad. När det gäller icke-pigmenterade flugor, justera exponeringstiden så att de ljusaste pixlarna ligger strax under mättnadsgränsen för varje bild.

Spela in en bild och spara den som en råfil för att arkivera alla motsvarande metadata för inspelningen. Exportera sedan bilden i ett tif-format. För att kvantifiera relativ eGFP-fluorescens i rhabdomeres av vattennedsänkningsmikrografer, justera ImageJ-inställningarna genom att klicka på Analysera, sedan Ange mätningar och markera endast rutan för Genomsnittligt grått värde.

Importera tif-bilden genom att klicka på Arkiv och sedan på Öppna. Välj en representativ region i bilden i fokus och förstora den till 200 till 300 % genom att upprepade gånger trycka på Control och tillsammans. Välj sedan det ovala verktyget, och medan du trycker på Shift-tangenten genererar du ett cirkulärt urval i bilden som är betydligt mindre än en fluorescerande rhabdomere.

Leta sedan efter den exakta storleken som visas under verktygsfältet i ImageJ-huvudfönstret. Om du vill mäta fluorescensintensiteterna inom det cirkulära valet flyttar du cirkeln till den första rhabdomeren med piltangenterna på tangentbordet och klickar på Analysera och sedan på Mät. Ett resultatfönster med det uppmätta grå värdet dyker upp.

Fortsätt med mätningar av rhabdomeres två till sex, och mät även bakgrundssignalen. När det gäller icke-pigmenterade flugor, gör ytterligare mätningar av motsvarande cellkroppsområden. Mät fluorescensen hos ytterligare två ommatidier, vilket resulterar i tre tekniska replikat.

Markera den analyserade ommatidien med hjälp av pennverktyget och spara den här bilden för dokumentation. Välj och kopiera de uppmätta grå värdena från resultatfönstret och klistra in dem i kalkylarksprogram för ytterligare beräkningar. Sortera fluorescensintensitetsvärdena enligt deras ursprung i kategorierna rhabdomere, cellkropp och bakgrund och beräkna medelintensiteten från varje kategori.

Beräkna sedan den relativa mängden eGFP som finns i rhabdomere med hjälp av den första formeln för icke-pigmenterade ögon och den andra för pigmenterade ögon. Alternativt, för att kvantifiera ögonmorfologi med eGFP-fluorescens i vattennedsänkningsmikrografer, välj tre intilliggande ommatidier i en representativ region av bilden som är i fokus. Utvärdera de 18 rabdomererna i urvalet individuellt enligt deras eGFP-intensitet, kantskärpa och kontrast med avseende på den omgivande bakgrundssignalen.

Slutligen, poängsätt de tydligt synliga rhabdomeres med ett värde av två, veckovisa synliga rhabdomeres med ett värde av en och frånvarande rhabdomeres med ett värde av noll för att generera ett degenerationsindex. I transgena Drosophila-flugor som uttrycker ett eGFP TRPL-fusionsprotein försvinner rabdomeral fluorescens i ljus på grund av translokation av eGFP TRPL. Detta gör det möjligt att utföra en genetisk skärm för att identifiera mutanter som är defekta i internaliseringen av eGFP TRPL.

I kontrollflugor translokerar eGFP TRPL ut ur rhabdomererna till cellkroppen efter 16 timmars belysning, vilket resulterar i en signifikant minskning av rabdomeral fluorescens jämfört med det mörkanpassade tillståndet. Den andra mörka inkubationen höjer rabdomeral fluorescens igen mot det ursprungliga värdet. I TRPL-translokationen defekt mutant vps35MH20 förändras emellertid fluorescensmönstret inte drastiskt efter 16 timmars belysning och en efterföljande mörk anpassning i 24 timmar.

Denna kvantifieringsmetod kan upptäcka en statistiskt mycket signifikant återvinningsdefekt. Vitögda flugor möjliggör detektering av fluorescenssignaler från både rhabdomere och cellkropp. Däremot är fluorescenssignaler hos rödögda flugor endast detekterbara i rabdomeres men inte i cellkroppen.

När det gäller kvantifiering av retinal degeneration kan eGFP TRP-fluorescens bedömas under flera veckor. När det hölls i en 12-timmars ljus, 12-timmars mörk cykel i två veckor, minskade degenerationsindexet i mutanta flugor men inte i kontrollflugor. I detta protokoll måste man skilja mellan pigmenterade och icke-pigmenterade ögon.

Eftersom pigmentering påverkar den fluorescerande signalen har kvantitativ vattennedsänkningsmikroskopi optimerats för båda fallen individuellt. DPP-avbildning och vattennedsänkningsmikroskopi är metoder med hög genomströmning med begränsad upplösning. För att undersöka subcellulär lokalisering rekommenderar vi immunofluorescensmikroskopi på vävnadssektioner.

För en detaljerad analys av degenerativa fenotyper kan elektronmikroskopi utföras.